Separación y recolección automáticas de sustancias relacionadas con el cáncer a partir de muestras clínicas

Resumen

Este documento describe la aplicación de equipos automatizados para separar y recolectar sustancias de manera fácil y eficiente, como ADN libre de células y células tumorales circulantes, de sangre total.

Resumen

Recientemente, las biopsias líquidas se han utilizado para diagnosticar diversas enfermedades, incluido el cáncer. Los fluidos corporales contienen muchas sustancias, incluyendo células, proteínas y ácidos nucleicos que se originan en los tejidos normales, pero algunas de estas sustancias también se originan en el área enferma. La investigación y el análisis de estas sustancias en los fluidos corporales juegan un papel fundamental en el diagnóstico de diversas enfermedades. Por lo tanto, es importante separar con precisión las sustancias requeridas, y se desarrollan varias técnicas para ser utilizadas para este propósito.

Hemos desarrollado un tipo de dispositivo y plataforma de laboratorio en un disco llamado CD-PRIME. Este dispositivo está automatizado y tiene buenos resultados para la contaminación de la muestra y la estabilidad de la muestra. Además, tiene ventajas de un buen rendimiento de adquisición, un corto tiempo de operación y una alta reproducibilidad. Además, dependiendo del tipo de disco a montar, se puede separar el plasma que contiene ADN libre de células, las células tumorales circulantes, las células mononucleares de sangre periférica o las capas leucocitarias. Por lo tanto, la adquisición de una variedad de materiales presentes en los fluidos corporales se puede hacer para una variedad de aplicaciones posteriores, incluido el estudio de ómicas.

Introducción

La detección precoz y precisa de diversas enfermedades, incluyendo el cáncer, es el factor más importante para establecer una estrategia de tratamiento 1,2,3,4. En particular, la detección precoz del cáncer está estrechamente relacionada con el aumento de las posibilidades de supervivencia para el paciente 5,6,7,8. Recientemente, las biopsias líquidas han estado en el centro de atención para la detección temprana del cáncer. Los tumores sólidos sufren angiogénesis y liberan diversas sustancias en la sangre. En particular, se han encontrado ADN circulantes (ctDNAs), ARN circulantes (ctRNAs), proteínas, vesículas como exosomas y células tumorales circulantes (CTCs) en la sangre de pacientes con cáncer ^2,9. Aunque existen diferencias en la cantidad de estas sustancias, se observan consistentemente no sólo en las primeras etapas, sino también en las etapas posteriores ^6,10. Sin embargo, estas diferencias individuales son muy altas; por ejemplo, la cantidad de ADN libre de células (ADNcf) que contiene ctDNA es inferior a 1.000 ng, y el número de CTC es inferior a 100 en 10 ml de sangre total de pacientes con cáncer^11,12,13. Muchos estudios han caracterizado el cáncer utilizando estas sustancias presentes en cantidades menores (es decir, cfDNA, ctDNA y CTC). Para obtener resultados precisos, es importante separar con precisión pequeñas cantidades de sustancias con alta pureza^13,14. Los métodos convencionales de centrifugación se utilizan comúnmente, pero son difíciles de manejar y tienen baja pureza dependiendo de la habilidad del usuario. Desde el descubrimiento de las CTC, se han desarrollado varias técnicas de separación, como la centrifugación o separación de grado de densidad, la inmunoperla y los métodos microfluídicos. Se han desarrollado varias técnicas de contención desde el descubrimiento de los CTC. Sin embargo, estas técnicas a menudo son limitadas cuando es necesario aislar las células de los diversos chips y membranas utilizadas para aislarlas¹⁵. Además, los métodos de etiquetado requieren equipos como FACS, y existen límites para el proceso posterior debido a la contaminación del etiquetado.

Recientemente, el uso de biopsias líquidas ha aumentado, y se están realizando diversos estudios para la detección temprana del cáncer. A pesar de que este método es simple, todavía existen dificultades en el análisis posterior, y varios estudios están tratando de superar esas dificultades^16,17. Además, muchos sitios, incluidos los hospitales, requieren métodos automatizados, reproducibles y de alta pureza que sean cómodos de usar. Aquí, hemos desarrollado un laboratorio en un disco para la separación automatizada de sustancias de muestras de sangre después de una biopsia líquida. Estos dispositivos se basan en el principio de centrifugación, microfluídica y captura de células del tamaño de un poro. Hay tres tipos de discos: LBx-1 puede adquirir plasma y capa leucocitaria, mientras que LBx-2 puede adquirir plasma y PBMC de sangre total con un volumen de menos de 10 ml; FAST-auto también puede adquirir CTC utilizando una membrana que se puede quitar del disco. Se pueden usar hasta cuatro de cada disco en una sola ejecución. Sobre todo, la ventaja de este dispositivo y método es que puede obtener una variedad de sustancias derivadas del cáncer de la misma muestra utilizando una pequeña cantidad de sangre. Esto significa que la sangre del paciente solo necesita ser extraída una vez. Además, tiene la ventaja de excluir errores debidos a diferencias en el período de muestreo de sangre. Esta plataforma es fácil de usar y proporciona resultados precisos para biopsias líquidas y aplicaciones posteriores. En este protocolo, se introduce el uso del dispositivo y el cartucho.

Protocolo

Todas las muestras de sangre entera se obtuvieron de pacientes con cáncer de pulmón. La investigación y el análisis en Clinomics son llevados a cabo por el Instituto de Investigación de Genómica del Cáncer, y la aprobación de la investigación del IRB por parte del gobierno está dirigida por el Comité de Revisión Institucional del Centro Médico Asan (IRB NO. 2021-0802) con el número IRB registrado para la investigación en Clinomics.

1. Preparación de la muestra

1. Recoja 9 ml de sangre total en un tubo de recolección de sangre estable con EDTA o cfDNA.
2. Mezcle bien volteando el tubo hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces.
3. Conservar las muestras a temperatura ambiente (RT; para almacenamiento a corto plazo) o 4 °C (para almacenamiento a largo plazo). No congelar y descongelar.

2. Preparación del dispositivo

1. Pulse el interruptor de encendido para encender el instrumento.
   NOTA: Aparece una pantalla de carga en el panel táctil y se inicializa el instrumento. Mantenga las manos alejadas del instrumento durante la inicialización. La pantalla de selección del cartucho aparece una vez completada la inicialización del instrumento.
2. Seleccione el modo de muestra que se va a utilizar. Cambie el número de muestras pulsando la flecha.

3. Funcionamiento del dispositivo y recogida de muestras

1. Carga del cartucho LBx-1
   1. Seleccione el tipo de cartucho en el panel de la pantalla táctil del instrumento. Cambie el número de muestras pulsando el botón de flecha.
   2. Abra la puerta del instrumento e inserte todos los cartuchos que se utilizarán en orden de número en el soporte del cartucho. Asegúrese de insertar correctamente el cartucho y el soporte del cartucho. Si el cartucho no se inserta correctamente, puede causar daños considerables al instrumento.
   3. Para un total de cuatro cartuchos, coloque el cartucho ficticio en el espacio vacío del portacartuchos.
   4. Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo.
   5. Cierre la puerta y pulse el botón EJECUTAR en la pantalla del panel táctil. El instrumento cierra las válvulas de los cartuchos, lo que tarda aproximadamente 30 s.
   6. Siga el mensaje para abrir la puerta, quitar la rueda de soporte y retirar el cartucho cerrado con la válvula del soporte del cartucho.
   7. Coloque el cartucho sobre la mesa y prepárese para inyectar toda la muestra de sangre. Pipetear un máximo de 10 ml de muestra de sangre total utilizando una pipeta serológica.
      PRECAUCIÓN: Peligros de manipular sangre. Durante todo el procedimiento de manejo de muestras de sangre y reactivos, es importante usar una bata de laboratorio y guantes de laboratorio. La MSDS proporcionada debe ser estudiada a fondo por los trabajadores del laboratorio.
   8. Inserte la punta de la pipeta profundamente en la entrada de muestras del cartucho e inyecte lentamente toda la muestra de sangre.
      NOTA Cuando se usa más o igual a 9 ml de muestra de sangre entera, no es necesaria la adición de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Cuando use menos de 9 ml de muestra de sangre total, agregue PBS para que el volumen total sea de 9 ml. Por ejemplo, cuando use 7.2 ml de sangre total, agregue 1.8 ml de PBS a la entrada de la muestra. Se puede utilizar una pipeta serológica o una punta de pipeta para la inyección de sangre total y PBS. Cuando se usa menos de 8 ml de muestra de sangre total, es posible que la capa leucocitaria no se recupere incluso agregando 1 ml de PBS. Para la preparación de ADNg, use 200 μL de sangre total, que se separó antes de este paso.
   9. Inserte los cartuchos que se utilizarán en orden de número en el soporte del cartucho. Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo. Cierre la puerta y pulse el botón OK .
      NOTA: El plasma y la capa leucocitaria se separan automáticamente de la sangre total, lo que tarda aproximadamente 30 minutos.
      PRECAUCIÓN Peligro durante la operación. Abrir la puerta o tocar el instrumento durante las operaciones de rotación de alta velocidad puede causar lesiones graves. También existe el riesgo de lesiones debido a la carga asimétrica del rotor. Si se producen vibraciones y ruidos inusuales cuando el instrumento arranca en modo de enriquecimiento celular asistido o experto, la colocación del cartucho puede ser asimétrica. Presione inmediatamente la tecla de encendido para detener e instalar correctamente el cartucho.
   10. Busque el mensaje en la pantalla acompañado de un sonido de alarma, que aparece cuando se completa la separación del plasma y la capa leucocitaria.
   11. Detenga la alarma abriendo la puerta o presionando el botón STOP . Abra la puerta, retire el cartucho y colóquelo sobre la mesa.
   12. Recuperar 3 ml de plasma de la salida de plasma utilizando una punta de pipeta de 1 ml. Recuperar la capa leucocitaria de 3 ml de la salida de la capa leucocitaria con una punta de pipeta de 1 ml.
2. Carga del cartucho LBx-2
   1. Seleccione el nombre del cartucho en el panel de la pantalla táctil del instrumento. Cambie el número de muestras pulsando el botón de flecha.
   2. Abra la puerta e inserte los cartuchos que se utilizarán en orden del número en el soporte del cartucho.
   3. Para un total de cuatro cartuchos, coloque el cartucho ficticio en el espacio vacío del portacartuchos.
   4. Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo. Asegúrese de insertar correctamente el cartucho en el soporte del cartucho. Si el cartucho no se inserta correctamente, puede causar daños considerables al instrumento.
   5. Cierre la puerta y pulse el botón EJECUTAR en la pantalla del panel táctil. El instrumento cierra las válvulas del cartucho, lo que tarda aproximadamente 30 s.
   6. Siga el mensaje para abrir la puerta, quitar la rueda de soporte, retirar el cartucho cerrado con válvula del soporte del cartucho y colocarlo sobre la mesa.
   7. Coloque el cartucho sobre la mesa y prepárese para inyectar la solución de gradiente de densidad y la muestra de sangre entera. Compruebe el volumen de la solución de gradiente de densidad y PBS que se inyectará en función del volumen de la muestra de sangre total (Tabla complementaria 1).
   8. Pipetear la solución de gradiente de densidad utilizando una pipeta serológica. Inserte la punta de la pipeta profundamente en la entrada del cartucho e inyecte lentamente la solución de gradiente de densidad.
   9. Después de inyectar la solución de gradiente de densidad, pipetear toda la muestra de sangre con una pipeta serológica. Inserte la punta de la pipeta profundamente en la entrada de muestras del cartucho e inyecte lentamente toda la muestra de sangre.
      NOTA: Cuando use menos de 9 ml de la muestra de sangre total, agregue PBS consultando esta tabla (Tabla suplementaria 1).
   10. Inserte los cartuchos que se utilizarán en orden según el número en el soporte del cartucho. Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo. Cierre la puerta y pulse el botón OK .
   11. El plasma y la PBMC se separan automáticamente de la sangre total, lo que tarda aproximadamente 30 minutos. Busque el mensaje que aparece acompañado de un sonido de alarma, cuando la separación de plasma y PBMC se haya completado.
   12. Detenga la alarma abriendo la puerta o presionando el botón STOP . Abra la puerta, retire el cartucho y colóquelo sobre la mesa.
   13. Recuperar 3 ml de plasma de la salida de plasma utilizando una punta de pipeta de 1 ml. Recupere 3 ml del PBMC de la salida del PBMC utilizando una punta de pipeta de 1 ml.
3. Carga del cartucho FAST-auto
   1. Seleccione el cartucho en el panel de pantalla táctil del instrumento. Cambie el número de muestras pulsando el botón de flecha.
   2. Abra la puerta e inserte los cartuchos que se utilizarán en orden del número en el soporte del cartucho. Para un total de cuatro cartuchos, coloque el cartucho ficticio en el espacio vacío del portacartuchos.
   3. Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo.
   4. Cierre la puerta y presione el botón EJECUTAR en la pantalla del panel táctil. El instrumento cierra las válvulas del cartucho, lo que tarda aproximadamente 30 s.
   5. Siga el mensaje para abrir la puerta, quitar la rueda de soporte y retirar el cartucho cerrado con la válvula del soporte del cartucho.
   6. Coloque el cartucho sobre la mesa y prepárese para inyectar la solución de PBS y la muestra de sangre entera. Pipetear 6 ml de solución de PBS utilizando una pipeta serológica. Inserte la punta de la pipeta profundamente en la entrada de PBS del cartucho e inyecte lentamente 6 ml de la solución de PBS.
   7. Después de inyectar la solución de PBS, pipetear 3 ml de sangre total o muestra de PBMC obtenida de LBx-2 utilizando una pipeta serológica, que se enjuagó previamente con BSA al 1% para evitar que se pegue el residuo. Inserte la punta de la pipeta profundamente en la entrada de muestras del cartucho e inyecte lentamente toda la muestra de sangre.
   8. Inserte los cartuchos que se utilizarán en orden de número en el soporte del cartucho. Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo. Cierre la puerta y pulse el botón OK .
   9. Las CTC se enriquecen automáticamente con sangre total, lo que tarda aproximadamente 15 minutos. Busque un mensaje que aparezca acompañado de un sonido de alarma cuando se complete el enriquecimiento de los CTC. Detenga la alarma abriendo la puerta o presionando el botón STOP .
   10. Abra la puerta, retire el cartucho y colóquelo sobre la mesa. Inserte el removedor de placa posterior (BPR) en los cuatro orificios de la parte frontal del cartucho. Presione el ala azul oscuro con los pulgares de ambas manos y luego presione el cuerpo azul claro hasta que haga clic.
   11. Retire con cuidado el cuerpo del cartucho levantándolo. Levante muy suavemente la membrana del filtro por el borde con una pinza. Asegúrese de utilizar el borde exterior (la parte del borde de 1 mm de ancho) de la membrana del filtro para pellizcar y sostener la membrana del filtro.
   12. Coloque cuidadosamente la membrana del filtro (en la que residen los CTC enriquecidos) en un tubo de 1,5 ml para la preparación de ácidos nucleicos. Si es necesario, recupere la sangre filtrada a la salida de sangre con una punta de pipeta de 1 ml.

4. Mantenimiento del sistema

1. Preparación para la limpieza y desinfección del instrumento
   1. Limpie todas las superficies accesibles del instrumento y los accesorios una vez a la semana con etanol y tejido seco, y también inmediatamente cuando esté contaminado.
   2. Limpie el recipiente y el eje del rotor regularmente con alcohol (etanol e isopropanol) o desinfectantes a base de alcohol.
2. Limpieza y desinfección del instrumento
   NOTA: Para la solución de problemas generales y otras notas sobre el equipo, consulte la Tabla complementaria 2.
   1. Apague el instrumento con el interruptor de encendido principal. Desconecte el enchufe de alimentación de la fuente de alimentación.
   2. Abra la puerta y limpie y desinfecte todas las superficies accesibles del instrumento, incluido el cable de alimentación, utilizando un paño húmedo y los agentes de limpieza recomendados.
   3. Compruebe si el eje del rotor está dañado. Inspeccione el instrumento en busca de corrosión y daños.
   4. Conecte el instrumento a la fuente de alimentación solo si está completamente seco por dentro y por fuera.
3. Desconecte el enchufe de alimentación principal y retire el portafusibles. El portafusibles se encuentra encima de la toma de corriente. Reemplace el fusible usado por uno de repuesto del contenedor.

Resultados

El objetivo de esta técnica es aislar fácil y automáticamente las sustancias asociadas al cáncer de la sangre total. En particular, cualquiera puede utilizar esta técnica en todos los campos adecuados de investigación y análisis. La separación simultánea y reproducible de múltiples sustancias en una sola muestra de sangre es significativa en las biopsias líquidas. Los discos LBx-1 y LBx-2 se utilizan para aislar plasma y capa leucocitaria o PBMC de sangre total. La figura 1 muestr...

Discusión

La cantidad y concentración de cfDNA y CTC depende del individuo, la etapa y el tipo de cáncer. También depende de la condición del paciente 2,4,5,10,20. En particular, en las etapas tempranas o precancerosas del cáncer, las concentraciones de sustancias relacionadas con el cáncer son muy bajas, por lo que existe una alta posibilidad de que no se pueda d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3059
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL Conical Tube	SPL	50015
4150 TapeStation System	Agilent	G2992AA	Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit	Apostle	A17622-250	5 mL X 50 preps version
BD Vacutainer blood collection tubes	BD	367525	EDTA Blood Collection Tube (10 mL)
BioViewCCBS	Clinomics		BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610	Invitrogen	MHCD4522
FAST Auto cartridge	Clinomics	CLX-M3001
LBx-1 cartridge	Clinomics	CLX-M4101
LBx-2 cartridge	Clinomics	CLX-M4201
OPR-2000 instrument	Clinomics	CLX-I2001
Cover Glass	Marienfeld Superior	HSU-0101040
DynaMag 2 Magnet Stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Ficoll Paque Solution	GE healthcare	17-1440-03	density gradient solution
Filter Tip, 10 µL	Axygen	AX-TF-10	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 200 µL	Axygen	AX-TF-200	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 100 µL	Axygen	AX-TF-100	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 1000 µL	Axygen	AX-TF-1000	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	324204
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin	BD Biosciences	347653
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)	Sigma Aldrich	433284
Kimtech Science Wipers	Yuhan-Kimberly	41117
Latex glove	Microflex	63-754
Magnetic Bead Separation Rack	V&P Scientific	VP 772F2M-2
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	abcam	ab104139
Normal Human IgG Control	R&D Systems	1-001-A
OLYMPUS BX-UCB	Olympus	9217316
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Corning	21-040CVC
Portable Pipet Aid	Drummond	4-000-201
Slide Glass	Marienfeld Superior	HSU-1000612
StainTray Staining box	Simport	M920
Sterile Serological Pipette (10 mL)	SPL	91010
Triton X-100 solution	Sigma Aldrich	93443
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P7949
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)	Excelitas	010-00157