Kanserle İlgili Maddelerin Klinik Örneklerden Otomatik Olarak Ayrılması ve Toplanması

Özet

Bu makalede, hücresiz DNA ve dolaşımdaki tümör hücreleri gibi maddeleri tam kandan kolayca ve verimli bir şekilde ayırmak ve toplamak için otomatik ekipmanın uygulanması açıklanmaktadır.

Özet

Son zamanlarda, sıvı biyopsiler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkları teşhis etmek için kullanılmıştır. Vücut sıvıları, normal dokulardan kaynaklanan hücreler, proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere birçok madde içerir, ancak bu maddelerin bazıları da hastalıklı bölgeden kaynaklanır. Vücut sıvılarındaki bu maddelerin araştırılması ve analizi, çeşitli hastalıkların teşhisinde çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, gerekli maddeleri doğru bir şekilde ayırmak önemlidir ve bu amaçla kullanılmak üzere çeşitli teknikler geliştirilmiştir.

CD-PRIME adlı bir disk üzerinde laboratuvar tipi cihaz ve platform geliştirdik. Bu cihaz otomatiktir ve numune kontaminasyonu ve numune kararlılığı için iyi sonuçlara sahiptir. Ayrıca, iyi bir satın alma verimi, kısa bir çalışma süresi ve yüksek tekrarlanabilirlik avantajlarına sahiptir. Ek olarak, monte edilecek diskin türüne bağlı olarak, hücresiz DNA içeren plazma, dolaşımdaki tümör hücreleri, periferik kan mononükleer hücreleri veya kabarık katlar ayrılabilir. Böylece, vücut sıvılarında bulunan çeşitli malzemelerin elde edilmesi, omiklerin incelenmesi de dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamaları için yapılabilir.

Giriş

Kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların erken ve doğru tespiti, bir tedavi stratejisinin oluşturulmasında en önemli faktördür 1,2,3,4. Özellikle, kanserin erken teşhisi, hastanın 5,6,7,8 sağkalım şansının artmasıyla yakından ilişkilidir. Son zamanlarda, sıvı biyopsiler kanserin erken teşhisi için spot ışığında olmuştur. Solid tümörler anjiyogeneze uğrar ve çeşitli maddeleri kana salgılar. Özellikle kanser hastalarının kanında dolaşımdaki DNA'lar (ctDNA'lar), dolaşımdaki RNA'lar (ctRNA'lar), proteinler, eksozomlar gibi veziküller ve dolaşımdaki tümör hücreleri (^{CTC'ler) bulunmuştur 2,9}. Bu maddelerin miktarında farklılıklar olmasına rağmen, sadece erken evrelerde değil, sonraki aşamalarda da sürekli olarak gözlenirler ^6,10. Bununla birlikte, bu bireysel farklılıklar çok yüksektir; Örneğin, ctDNA içeren hücresiz DNA (cfDNA) miktarı 1.000 ng'den azdır ve CTC'lerin sayısı 10 mL'lik tam kanda ^100'den azdır^11,12,13. Birçok çalışma, daha az miktarda bulunan bu maddeleri (yani, cfDNA, ctDNA ve CTC'ler) kullanarak kanseri karakterize etmiştir. Doğru sonuçlar elde etmek için, yüksek saflıkta az miktarda maddenin doğru bir şekilde ayrılması önemlidir^13,14. Geleneksel santrifüjleme yöntemleri yaygın olarak kullanılır, ancak kullanımı zordur ve kullanıcının becerisine bağlı olarak düşük saflığa sahiptir. CTC'lerin keşfinden bu yana, santrifüjleme veya yoğunluk derecesi ayırma, immünoboncuk ve mikroakışkan yöntemler gibi çeşitli ayırma teknikleri geliştirilmiştir. CTC'lerin keşfinden bu yana çeşitli muhafaza teknikleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu teknikler, hücreleri izole etmek için kullanılan çeşitli çiplerden ve zarlardan izole etmek gerektiğinde genellikle sınırlıdır¹⁵. Ayrıca, etiketleme yöntemleri FACS gibi ekipmanlar gerektirir ve etiketleme kontaminasyonu nedeniyle çıkış yönündeki prosesin sınırları vardır.

Son zamanlarda, sıvı biyopsilerin kullanımı artmıştır ve kanserin erken teşhisi için çeşitli çalışmalar yapılmaktadır. Bu yöntem basit olmasına rağmen, aşağı akış analizinde hala zorluklar vardır ve çeşitli çalışmalar bu zorlukların üstesinden gelmeye çalışmaktadır^16,17. Buna ek olarak, hastaneler de dahil olmak üzere birçok site, kullanımı uygun, otomatik, yeniden üretilebilir ve yüksek saflıkta yöntemler gerektirir. Burada, sıvı biyopsi sonrasında maddelerin kan örneklerinden otomatik olarak ayrılması için bir disk üzerinde laboratuvar geliştirdik. Bu cihazlar santrifüjleme, mikroakışkanlar ve gözenek büyüklüğünde hücre yakalama prensibine dayanmaktadır. Üç tip disk vardır: LBx-1 plazma ve buffy kat elde edebilirken, LBx-2 10 mL'den daha az hacimli tam kandan plazma ve PBMC elde edebilir; FAST-auto, diskten çıkarılabilir bir membran kullanarak CTC'leri de alabilir. Bir çalıştırmada her diskten en fazla dört adet kullanılabilir. Her şeyden önce, bu cihazın ve yöntemin avantajı, az miktarda kan kullanarak aynı numuneden çeşitli kanser kaynaklı maddeler elde edebilmesidir. Bu, hastanın kanının sadece bir kez alınması gerektiği anlamına gelir. Ayrıca kan örnekleme periyodundaki farklılıklardan kaynaklanan hataları dışlama avantajına sahiptir. Bu platformun kullanımı kolaydır ve sıvı biyopsiler ve aşağı akış uygulamaları için doğru sonuçlar sağlar. Bu protokolde, cihazın ve kartuşun kullanımı tanıtılır.

Protokol

Tüm tam kan örnekleri akciğer kanseri hastalarından alındı. Clinomics'teki araştırma ve analizler Kanser Genomiği Araştırma Enstitüsü tarafından yürütülmektedir ve hükümet tarafından IRB araştırma onayı, Clinomics'te araştırma için kayıtlı IRB numarası ile Asan Tıp Merkezi Kurumsal İnceleme Komitesi (IRB NO. 2021-0802) tarafından yönetilmektedir.

1. Numune hazırlama

1. Bir EDTA veya cfDNA stabil kan toplama tüpüne 9 mL tam kan toplayın.
2. Tüpü yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı çevirerek iyice karıştırın.
3. Numuneleri oda sıcaklığında (RT; kısa süreli depolama için) veya 4 °C'de (uzun süreli depolama için) saklayın. Donmayın ve çözmeyin.

2. Cihaz hazırlama

1. Cihazı açmak için güç düğmesine basın.
   NOT: Dokunmatik yüzeyde bir yükleme ekranı görünür ve cihaz başlatılır. Başlatma sırasında ellerinizi cihazdan uzak tutun. Cihaz başlatma işlemi tamamlandıktan sonra kartuş seçim ekranı görüntülenir.
2. Kullanılacak örnek modu seçin. Oka basarak örnek sayısını değiştirin.

3. Cihaz çalışması ve örnek toplama

1. LBx-1 kartuşunun takılması
   1. Cihazın dokunmatik ekran panelinde kartuş türünü seçin. Ok düğmesine basarak örnek sayısını değiştirin.
   2. Cihazın kapağını açın ve kullanılacak tüm kartuşları kartuş tutucusundaki numara sırasına göre takın. Kartuşu ve kartuş tutucuyu doğru şekilde taktığınızdan emin olun. Kartuş doğru şekilde takılmazsa, cihazda önemli hasara neden olabilir.
   3. Toplam dört kartuş için, kukla kartuşu kartuş tutucunun boş alanına yerleştirin.
   4. Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın.
   5. Kapıyı kapatın ve dokunmatik yüzey ekranındaki RUN düğmesine basın. Cihaz, kartuşların üzerindeki valfleri kapatır ve bu da yaklaşık 30 s sürer.
   6. Kapıyı açmak, destek tekerleğini çıkarmak ve valf kapalı kartuşu kartuş tutucusundan çıkarmak için mesajı izleyin.
   7. Kartuşu masaya yerleştirin ve tam kan örneğini enjekte etmeye hazırlanın. Serolojik pipet kullanarak maksimum 10 mL tam kan örneği pipetin.
      DİKKAT: Kan tutmanın tehlikeleri. Kan örneklerini ve reaktifleri kullanma prosedürünün tamamı boyunca, bir laboratuvar önlüğü ve laboratuvar eldiveni giymek önemlidir. Sağlanan MSDS, laboratuvar çalışanları tarafından kapsamlı bir şekilde incelenmelidir.
   8. Pipet ucunu kartuşun numune girişinin derinliklerine yerleştirin ve tüm kan örneğini yavaşça enjekte edin.
      NOT 9 mL'den fazla veya buna eşit tam kan örneği kullanıldığında, fosfat tamponlu salin (PBS) ilavesi gerekli değildir. 9 mL'den az tam kan örneği kullanırken, toplam hacmi 9 mL'ye çıkarmak için PBS ekleyin. Örneğin, 7,2 mL tam kan kullanırken, lütfen numune girişine 1,8 mL PBS ekleyin. Tam kan ve PBS enjeksiyonu için serolojik pipet veya pipet ucu kullanılabilir. 8 mL'den daha az tam kan örneği kullanıldığında, buffy ceket 1 mL PBS eklenerek bile geri kazanılamayabilir. GDNA hazırlığı için, bu adımdan önce ayrılmış olan 200 μL tam kan kullanın.
   9. Kullanılacak kartuşları, kartuş tutucu üzerindeki numara sırasına göre takın. Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın. Kapıyı kapatın ve OK düğmesine basın.
      NOT: Plazma ve buffy kat tam kandan otomatik olarak ayrılır ve bu yaklaşık 30 dakika sürer.
      DİKKAT Çalışma sırasında tehlike. Yüksek hızlı dönen işlemler sırasında kapıyı açmak veya cihaza dokunmak ciddi yaralanmalara neden olabilir. Rotorun asimetrik yüklenmesi nedeniyle yaralanma riski de vardır. Cihaz yardımlı hücre zenginleştirme veya uzman modunda başladığında olağandışı titreşimler ve sesler oluşursa, kartuş yerleşimi asimetrik olabilir. Kartuşu durdurmak ve düzgün bir şekilde takmak için hemen güç tuşuna basın.
   10. Plazma ve buffy ceketin ayrılması tamamlandığında ortaya çıkan bir alarm sesi eşliğinde ekrandaki mesajı arayın.
   11. Kapıyı açarak veya STOP düğmesine basarak alarmı durdurun . Kapıyı açın, kartuşu çıkarın ve masanın üzerine yerleştirin.
   12. 1 mL'lik pipet ucu kullanarak plazma çıkışından 3 mL plazma geri kazanın. 1 mL'lik pipet ucu kullanarak 3 mL'lik buffy ceketi buffy kaplama çıkışından geri alın.
2. LBx-2 kartuşunun takılması
   1. Cihazın dokunmatik ekran panelinde kartuş adını seçin. Ok düğmesine basarak örnek sayısını değiştirin.
   2. Kapağı açın ve kullanılacak kartuşları kartuş tutucu üzerindeki numara sırasına göre takın.
   3. Toplam dört kartuş için, kukla kartuşu kartuş tutucunun boş alanına yerleştirin.
   4. Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın. Kartuşu kartuş tutucusuna doğru şekilde taktığınızdan emin olun. Kartuş doğru şekilde takılmazsa, cihazda önemli hasara neden olabilir.
   5. Kapıyı kapatın ve dokunmatik yüzey ekranındaki RUN düğmesine basın. Cihaz, kartuş üzerindeki valfleri kapatır ve bu da yaklaşık 30 s sürer.
   6. Kapıyı açmak, destek tekerleğini çıkarmak ve valf kapalı kartuşu kartuş tutucusundan çıkarıp masanın üzerine yerleştirmek için mesajı izleyin.
   7. Kartuşu masaya yerleştirin ve yoğunluk gradyanı çözeltisini ve tam kan örneğini enjekte etmeye hazırlanın. Tam kan örneğinin hacmine bağlı olarak enjekte edilecek yoğunluk gradyanı çözeltisinin ve PBS'nin hacmini kontrol edin (Ek Tablo 1).
   8. Serolojik pipet kullanarak yoğunluk gradyanı çözeltisini pipetleyin. Pipet ucunu kartuşun girişinin derinliklerine yerleştirin ve yoğunluk gradyanı çözeltisini yavaşça enjekte edin.
   9. Yoğunluk gradyanı çözeltisini enjekte ettikten sonra, serolojik bir pipet kullanarak tüm kan örneğini pipetleyin. Pipet ucunu kartuşun numune girişinin derinliklerine yerleştirin ve tüm kan örneğini yavaşça enjekte edin.
      NOT: Tam kan örneğinin 9 mL'den daha azını kullanırken, bu tabloya başvurarak PBS ekleyin (Ek Tablo 1).
   10. Kullanılacak kartuşları, kartuş tutucu üzerindeki numaraya göre sırayla takın. Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın. Kapıyı kapatın ve OK düğmesine basın.
   11. Plazma ve PBMC tam kandan otomatik olarak ayrılır, bu da yaklaşık 30 dakika sürer. Plazma ve PBMC'nin ayrılması tamamlandığında alarm sesiyle birlikte görünen mesajı arayın.
   12. Kapıyı açarak veya STOP düğmesine basarak alarmı durdurun . Kapıyı açın, kartuşu çıkarın ve masanın üzerine yerleştirin.
   13. 1 mL'lik pipet ucu kullanarak plazma çıkışından 3 mL plazma geri kazanın. 1 mL'lik pipet ucu kullanarak PBMC çıkışından PBMC'nin 3 mL'sini geri kazanın.
3. HIZLI otomatik kartuşun takılması
   1. Cihazın dokunmatik ekran panelindeki kartuşu seçin. Ok düğmesine basarak örnek sayısını değiştirin.
   2. Kapağı açın ve kullanılacak kartuşları kartuş tutucu üzerindeki numara sırasına göre takın. Toplam dört kartuş için, kukla kartuşu kartuş tutucunun boş alanına yerleştirin.
   3. Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın.
   4. Kapıyı kapatın ve dokunmatik yüzey ekranındaki RUN düğmesine basın. Cihaz, kartuş üzerindeki valfleri kapatır ve bu da yaklaşık 30 s sürer.
   5. Kapıyı açmak, destek tekerleğini çıkarmak ve valf kapalı kartuşu kartuş tutucusundan çıkarmak için mesajı izleyin.
   6. Kartuşu masaya yerleştirin ve PBS çözeltisini ve tam kan örneğini enjekte etmeye hazırlanın. Serolojik pipet kullanılarak 6 mL PBS çözeltisi pipet. Pipet ucunu kartuşun PBS girişinin derinliklerine yerleştirin ve 6 mL'lik PBS çözeltisini yavaşça enjekte edin.
   7. PBS çözeltisi enjekte edildikten sonra, kalıntının yapışmasını önlemek için daha önce% 1 BSA ile durulanan serolojik bir pipet kullanılarak LBx-2'den 3 mL tam kan veya PBMC numunesi elde edilen pipet. Pipet ucunu kartuşun numune girişinin derinliklerine yerleştirin ve tüm kan örneğini yavaşça enjekte edin.
   8. Kullanılacak kartuşları, kartuş tutucu üzerindeki numara sırasına göre takın. Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın. Kapıyı kapatın ve OK düğmesine basın.
   9. CTC'ler otomatik olarak tam kandan zenginleştirilir, bu da yaklaşık 15 dakika sürer. CTC'lerin zenginleştirilmesi tamamlandığında alarm sesiyle birlikte görünen bir mesaj arayın. Kapıyı açarak veya STOP düğmesine basarak alarmı durdurun .
   10. Kapıyı açın, kartuşu çıkarın ve masanın üzerine yerleştirin. Arka plaka sökücüyü (BPR) kartuşun önündeki dört deliğe takın. Koyu mavi kanadı iki elinizin baş parmaklarıyla bastırın ve ardından açık mavi gövdeyi tıklayana kadar bastırın.
   11. Kartuş gövdesini yukarı kaldırarak dikkatlice çıkarın. Bir cımbız kullanarak filtre zarını kenardan çok nazikçe alın. Lütfen filtre membranını sıkıştırmak ve tutmak için filtre zarının dış kenarını (1 mm genişliğindeki kenar kısmı) kullandığınızdan emin olun.
   12. Filtre membranını (zenginleştirilmiş CTC'lerin bulunduğu) nükleik asit preparasyonu için 1,5 mL'lik bir tüpe dikkatlice yerleştirin. Gerekirse, filtrelenmiş kanı 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak kan çıkışına geri kazanın.

4. Sistemin bakımı

1. Cihazın temizlenmesi ve dezenfeksiyonu için hazırlık
   1. Cihazın ve aksesuarların erişilebilir tüm yüzeylerini haftada bir kez etanol ve kuru doku kullanarak ve ayrıca kontamine olduğunda hemen temizleyin.
   2. Kaseyi ve rotor milini alkol (etanol ve izopropanol) veya alkol bazlı dezenfektanlar kullanarak düzenli olarak temizleyin.
2. Cihazın temizlenmesi ve dezenfekte edilmesi
   NOT: Genel sorun giderme ve makineyle ilgili diğer notlar için Ek Tablo 2'ye bakın.
   1. Ana güç düğmesini kullanarak cihazı kapatın. Güç fişini güç kaynağından çıkarın.
   2. Kapıyı açın ve güç kablosu da dahil olmak üzere cihazın erişilebilir tüm yüzeylerini nemli bir bez ve önerilen temizlik maddeleri kullanarak temizleyin ve dezenfekte edin.
   3. Rotor milinde hasar olup olmadığını kontrol edin. Cihazı korozyon ve hasar açısından kontrol edin.
   4. Cihazı güç kaynağına yalnızca içi ve dışı tamamen kuruysa bağlayın.
3. Ana güç fişini çıkarın ve sigorta tutucuyu çıkarın. Sigorta tutucu elektrik prizinin üzerinde bulunur. Kullanılmış sigortayı kaptan yedek bir sigorta ile değiştirin.

Sonuçlar

Bu tekniğin amacı, kanserle ilişkili maddeleri tam kandan kolayca ve otomatik olarak izole etmektir. Özellikle, herkes bu tekniği uygun tüm araştırma ve analiz alanlarında kullanabilir. Tek bir kan örneğinde birden fazla maddenin eşzamanlı ve tekrarlanabilir şekilde ayrılması, sıvı biyopsilerde önemlidir. LBx-1 ve LBx-2 diskleri, plazma ve buffy coat veya PBMC'yi tam kandan izole etmek için kullanılır. Şekil 1 , bu cihazın uygulanmasıyla ayrılan malzemeleri gösterm...

Tartışmalar

CfDNA ve CTC'nin miktarı ve konsantrasyonu kanserin bireyine, evresine ve türüne bağlıdır. Aynı zamanda hastanın durumuna da bağlıdır 2,4,5,10,20. Özellikle, kanserin erken veya kanser öncesi evrelerinde, kanserle ilişkili maddelerin konsantrasyonları çok düşüktür, bu nedenle tespit edilememesi olasılığı yüksektir. Bununla birlikte, er...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3059
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL Conical Tube	SPL	50015
4150 TapeStation System	Agilent	G2992AA	Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit	Apostle	A17622-250	5 mL X 50 preps version
BD Vacutainer blood collection tubes	BD	367525	EDTA Blood Collection Tube (10 mL)
BioViewCCBS	Clinomics		BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610	Invitrogen	MHCD4522
FAST Auto cartridge	Clinomics	CLX-M3001
LBx-1 cartridge	Clinomics	CLX-M4101
LBx-2 cartridge	Clinomics	CLX-M4201
OPR-2000 instrument	Clinomics	CLX-I2001
Cover Glass	Marienfeld Superior	HSU-0101040
DynaMag 2 Magnet Stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Ficoll Paque Solution	GE healthcare	17-1440-03	density gradient solution
Filter Tip, 10 µL	Axygen	AX-TF-10	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 200 µL	Axygen	AX-TF-200	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 100 µL	Axygen	AX-TF-100	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 1000 µL	Axygen	AX-TF-1000	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	324204
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin	BD Biosciences	347653
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)	Sigma Aldrich	433284
Kimtech Science Wipers	Yuhan-Kimberly	41117
Latex glove	Microflex	63-754
Magnetic Bead Separation Rack	V&P Scientific	VP 772F2M-2
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	abcam	ab104139
Normal Human IgG Control	R&D Systems	1-001-A
OLYMPUS BX-UCB	Olympus	9217316
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Corning	21-040CVC
Portable Pipet Aid	Drummond	4-000-201
Slide Glass	Marienfeld Superior	HSU-1000612
StainTray Staining box	Simport	M920
Sterile Serological Pipette (10 mL)	SPL	91010
Triton X-100 solution	Sigma Aldrich	93443
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P7949
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)	Excelitas	010-00157