Separazione automatica e raccolta di sostanze correlate al cancro da campioni clinici

Riepilogo

Questo documento descrive l'applicazione di apparecchiature automatizzate per separare e raccogliere in modo semplice ed efficiente sostanze, come il DNA privo di cellule e le cellule tumorali circolanti, dal sangue intero.

Abstract

Recentemente, le biopsie liquide sono state utilizzate per diagnosticare varie malattie, tra cui il cancro. I fluidi corporei contengono molte sostanze, tra cui cellule, proteine e acidi nucleici provenienti da tessuti normali, ma alcune di queste sostanze provengono anche dall'area malata. L'indagine e l'analisi di queste sostanze nei fluidi corporei svolgono un ruolo fondamentale nella diagnosi di varie malattie. Pertanto, è importante separare accuratamente le sostanze richieste e vengono sviluppate diverse tecniche da utilizzare a tale scopo.

Abbiamo sviluppato un tipo di dispositivo e piattaforma lab-on-a-disc chiamato CD-PRIME. Questo dispositivo è automatizzato e ha buoni risultati per la contaminazione del campione e la stabilità del campione. Inoltre, ha vantaggi di una buona resa di acquisizione, un breve tempo di funzionamento e un'elevata riproducibilità. Inoltre, a seconda del tipo di disco da montare, il plasma contenente DNA privo di cellule, cellule tumorali circolanti, cellule mononucleate del sangue periferico o buffy coat può essere separato. Pertanto, l'acquisizione di una varietà di materiali presenti nei fluidi corporei può essere effettuata per una varietà di applicazioni a valle, incluso lo studio dell'omica.

Introduzione

La diagnosi precoce e accurata di varie malattie, incluso il cancro, è il fattore più importante nello stabilire una strategia di trattamento 1,2,3,4. In particolare, la diagnosi precoce del cancro è strettamente correlata all'aumento delle possibilità di sopravvivenza per il paziente 5,6,7,8. Recentemente, le biopsie liquide sono state sotto i riflettori per la diagnosi precoce del cancro. I tumori solidi subiscono angiogenesi e rilasciano varie sostanze nel sangue. In particolare, DNA circolanti (ctDNA), RNA circolanti (ctRNA), proteine, vescicole come esosomi e cellule tumorali circolanti (CTC) sono stati trovati nel sangue di pazienti oncologici ^2,9. Sebbene ci siano differenze nella quantità di queste sostanze, sono costantemente osservate non solo nelle fasi iniziali ma anche nelle fasi successive ^6,10. Tuttavia, queste differenze individuali sono molto elevate; ad esempio, la quantità di DNA privo di cellule (cfDNA) contenente ctDNA è inferiore a 1.000 ng e il numero di CTC è inferiore a 100 in 10 ml di sangue intero da pazienti oncologici^11,12,13. Molti studi hanno caratterizzato il cancro utilizzando queste sostanze presenti in quantità minori (cioè cfDNA, ctDNA e CTC). Per ottenere risultati accurati, è importante separare accuratamente piccole quantità di sostanze con elevata purezza^13,14. I metodi di centrifugazione convenzionali sono comunemente usati, ma sono difficili da gestire e hanno una bassa purezza a seconda dell'abilità dell'utente. Dalla scoperta dei CTC, sono state sviluppate diverse tecniche di separazione, come la centrifugazione o la separazione del grado di densità, l'immunobead e i metodi microfluidici. Diverse tecniche di contenimento sono state sviluppate dalla scoperta dei CTC. Tuttavia, queste tecniche sono spesso limitate quando è necessario isolare le cellule dai vari chip e membrane utilizzati per isolarle¹⁵. Inoltre, i metodi di etichettatura richiedono attrezzature come FACS e ci sono limiti al processo a valle a causa della contaminazione dell'etichettatura.

Recentemente, l'uso di biopsie liquide è aumentato e sono stati condotti vari studi per la diagnosi precoce del cancro. Sebbene questo metodo sia semplice, ci sono ancora difficoltà nell'analisi a valle, e vari studi stanno tentando di superare queste difficoltà^16,17. Inoltre, molti siti, compresi gli ospedali, richiedono metodi automatizzati, riproducibili e ad alta purezza che siano convenienti da usare. Qui, abbiamo sviluppato un lab-on-a-disc per la separazione automatica delle sostanze dai campioni di sangue dopo una biopsia liquida. Questi dispositivi si basano sul principio della centrifugazione, della microfluidica e della cattura cellulare delle dimensioni dei pori. Esistono tre tipi di dischi: LBx-1 può acquisire plasma e buffy coat, mentre LBx-2 può acquisire plasma e PBMC da sangue intero con un volume inferiore a 10 ml; FAST-auto può anche acquisire CTC utilizzando una membrana rimovibile dal disco. È possibile utilizzare fino a quattro di ciascun disco in una sola esecuzione. Soprattutto, il vantaggio di questo dispositivo e metodo è che può ottenere una varietà di sostanze derivate dal cancro dallo stesso campione utilizzando una piccola quantità di sangue. Ciò significa che il sangue del paziente deve essere prelevato solo una volta. Inoltre, ha il vantaggio di escludere errori dovuti a differenze nel periodo di prelievo del sangue. Questa piattaforma è facile da usare e fornisce risultati accurati per biopsie liquide e applicazioni a valle. In questo protocollo, viene introdotto l'utilizzo del dispositivo e della cartuccia.

Protocollo

Tutti i campioni di sangue intero sono stati ottenuti da pazienti affetti da cancro del polmone. La ricerca e l'analisi presso Clinomics sono condotte dal Cancer Genomics Research Institute e l'approvazione della ricerca IRB da parte del governo è guidata dal Comitato di revisione istituzionale dell'Asan Medical Center (IRB NO. 2021-0802) con il numero IRB registrato per la ricerca presso Clinomics.

1. Preparazione del campione

1. Raccogliere 9 ml di sangue intero in una provetta di raccolta del sangue stabile con EDTA o cfDNA.
2. Mescolare bene capovolgendo il tubo su e giù circa 10 volte.
3. Conservare i campioni a temperatura ambiente (RT; per la conservazione a breve termine) o a 4 °C (per la conservazione a lungo termine). Non congelare e scongelare.

2. Preparazione del dispositivo

1. Premere l'interruttore di alimentazione per accendere lo strumento.
   NOTA: sul touchpad viene visualizzata una schermata di caricamento e lo strumento viene inizializzato. Tenere le mani lontane dallo strumento durante l'inizializzazione. La schermata di selezione della cartuccia viene visualizzata al termine dell'inizializzazione dello strumento.
2. Selezionare la modalità campione da utilizzare. Modificare il numero di campioni premendo la freccia.

3. Funzionamento del dispositivo e raccolta dei campioni

1. Caricamento della cartuccia LBx-1
   1. Selezionare il tipo di cartuccia sul pannello touchscreen dello strumento. Modificare il numero di campioni premendo il pulsante freccia.
   2. Aprire lo sportello dello strumento e inserire tutte le cartucce da utilizzare in ordine di numero sul portacartucce. Assicurarsi di inserire correttamente la cartuccia e il portacartucce. Se la cartuccia non è inserita correttamente, potrebbe causare danni considerevoli allo strumento.
   3. Per un totale di quattro cartucce, posizionare la cartuccia fittizia nello spazio vuoto del portacartucce.
   4. Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo.
   5. Chiudere lo sportello e premere il pulsante RUN sullo schermo del touchpad. Lo strumento chiude le valvole sulle cartucce, il che richiede circa 30 s.
   6. Seguire il messaggio per aprire lo sportello, rimuovere la ruota di supporto e rimuovere la cartuccia chiusa a valvola dal supporto della cartuccia.
   7. Posizionare la cartuccia sul tavolo e prepararsi a iniettare l'intero campione di sangue. Pipettare un massimo di 10 ml di campione di sangue intero utilizzando una pipetta sierologica.
      ATTENZIONE: Pericoli della manipolazione del sangue. Durante l'intera procedura di manipolazione di campioni di sangue e reagenti, è importante indossare un camice da laboratorio e guanti da laboratorio. La scheda di sicurezza fornita deve essere studiata accuratamente dagli operatori di laboratorio.
   8. Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso del campione della cartuccia e iniettare lentamente l'intero campione di sangue.
      NOTA Quando si utilizzano più o uguali a 9 ml di campione di sangue intero, non è necessaria l'aggiunta di soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Quando si utilizzano meno di 9 ml di campione di sangue intero, aggiungere PBS per rendere il volume totale a 9 ml. Ad esempio, quando si utilizzano 7,2 ml di sangue intero, aggiungere 1,8 ml di PBS nell'ingresso del campione. Una pipetta sierologica o una punta di pipetta può essere utilizzata per l'iniezione di sangue intero e PBS. Quando si utilizzano meno di 8 ml di campione di sangue intero, il buffy coat non può essere recuperato anche aggiungendo 1 mL di PBS. Per la preparazione del gDNA, utilizzare 200 μL di sangue intero, che è stato separato prima di questo passaggio.
   9. Inserire le cartucce da utilizzare in ordine di numero sul portacartucce. Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo. Chiudere lo sportello e premere il pulsante OK .
      NOTA: Il plasma e il buffy coat vengono separati automaticamente dal sangue intero, il che richiede circa 30 minuti.
      ATTENZIONE Pericolo durante il funzionamento. L'apertura della porta o il contatto con lo strumento durante le operazioni di rotazione ad alta velocità può causare gravi lesioni. C'è anche il rischio di lesioni dovute al carico asimmetrico del rotore. Se si verificano vibrazioni e rumori insoliti quando lo strumento si avvia in modalità di arricchimento cellulare assistito o esperto, il posizionamento della cartuccia può essere asimmetrico. Premere immediatamente il tasto di accensione per arrestare e installare correttamente la cartuccia.
   10. Cerca il messaggio sullo schermo accompagnato da un suono di allarme, che appare quando la separazione di plasma e buffy coat è completa.
   11. Arrestare l'allarme aprendo la porta o premendo il pulsante STOP . Aprire la porta, rimuovere la cartuccia e posizionarla sul tavolo.
   12. Recuperare 3 mL di plasma dall'uscita del plasma utilizzando una punta da pipetta da 1 mL. Recuperare il buffy coat da 3 mL dall'uscita del buffy coat utilizzando una punta per pipetta da 1 mL.
2. Caricamento della cartuccia LBx-2
   1. Selezionare il nome della cartuccia sul pannello touchscreen dello strumento. Modificare il numero di campioni premendo il pulsante freccia.
   2. Aprire lo sportello e inserire le cartucce da utilizzare in ordine di numero sul portacartucce.
   3. Per un totale di quattro cartucce, posizionare la cartuccia fittizia nello spazio vuoto del portacartucce.
   4. Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo. Assicurarsi di inserire correttamente la cartuccia nel supporto della cartuccia. Se la cartuccia non è inserita correttamente, potrebbe causare danni considerevoli allo strumento.
   5. Chiudere lo sportello e premere il pulsante RUN sullo schermo del touchpad. Lo strumento chiude le valvole sulla cartuccia, che richiede circa 30 s.
   6. Seguire il messaggio per aprire lo sportello, rimuovere la ruota di supporto, rimuovere la cartuccia chiusa a valvola dal supporto della cartuccia e posizionarla sul tavolo.
   7. Posizionare la cartuccia sul tavolo e prepararsi a iniettare la soluzione con gradiente di densità e l'intero campione di sangue. Controllare il volume della soluzione a gradiente di densità e della PBS da iniettare in funzione del volume dell'intero campione di sangue (Tabella supplementare 1).
   8. Pipettare la soluzione del gradiente di densità utilizzando una pipetta sierologica. Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso della cartuccia e iniettare lentamente la soluzione con gradiente di densità.
   9. Dopo aver iniettato la soluzione a gradiente di densità, pipettare l'intero campione di sangue utilizzando una pipetta sierologica. Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso del campione della cartuccia e iniettare lentamente l'intero campione di sangue.
      NOTA: Quando si utilizzano meno di 9 ml di campione di sangue intero, aggiungere PBS facendo riferimento a questa tabella (Tabella supplementare 1).
   10. Inserire le cartucce da utilizzare in base al numero riportato sul portacartucce. Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo. Chiudere lo sportello e premere il pulsante OK .
   11. Il plasma e la PBMC vengono separati automaticamente dal sangue intero, il che richiede circa 30 minuti. Cerca il messaggio che appare accompagnato da un suono di allarme, quando la separazione di plasma e PBMC è completa.
   12. Arrestare l'allarme aprendo la porta o premendo il pulsante STOP . Aprire la porta, rimuovere la cartuccia e posizionarla sul tavolo.
   13. Recuperare 3 mL di plasma dall'uscita del plasma utilizzando una punta da pipetta da 1 mL. Recuperare 3 mL di PBMC dalla presa PBMC utilizzando una punta per pipetta da 1 mL.
3. Caricamento della cartuccia FAST-auto
   1. Selezionare la cartuccia sul pannello touch screen dello strumento. Modificare il numero di campioni premendo il pulsante freccia.
   2. Aprire lo sportello e inserire le cartucce da utilizzare in ordine di numero sul portacartucce. Per un totale di quattro cartucce, posizionare la cartuccia fittizia nello spazio vuoto del portacartucce.
   3. Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo.
   4. Chiudere lo sportello e premere il pulsante RUN sullo schermo del touchpad. Lo strumento chiude le valvole sulla cartuccia, che richiede circa 30 s.
   5. Seguire il messaggio per aprire lo sportello, rimuovere la ruota di supporto e rimuovere la cartuccia chiusa a valvola dal supporto della cartuccia.
   6. Posizionare la cartuccia sul tavolo e prepararsi a iniettare la soluzione PBS e il campione di sangue intero. Pipettare 6 mL di soluzione PBS utilizzando una pipetta sierologica. Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso PBS della cartuccia e iniettare lentamente 6 mL della soluzione PBS.
   7. Dopo aver iniettato la soluzione PBS, pipettare 3 ml di sangue intero o campione di PBMC ottenuto da LBx-2 utilizzando una pipetta sierologica, che è stata precedentemente risciacquata con BSA all'1% per evitare l'attaccamento del residuo. Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso del campione della cartuccia e iniettare lentamente l'intero campione di sangue.
   8. Inserire le cartucce da utilizzare in ordine di numero sul portacartucce. Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo. Chiudere lo sportello e premere il pulsante OK .
   9. I CTC sono arricchiti automaticamente dal sangue intero, il che richiede circa 15 minuti. Cerca un messaggio che appaia accompagnato da un suono di allarme quando l'arricchimento dei CTC è completo. Arrestare l'allarme aprendo la porta o premendo il pulsante STOP .
   10. Aprire la porta, rimuovere la cartuccia e posizionarla sul tavolo. Inserire il dispositivo di rimozione della piastra posteriore (BPR) nei quattro fori sulla parte anteriore della cartuccia. Premere l'ala blu scuro con i pollici di entrambe le mani, quindi premere il corpo azzurro fino a quando non scatta.
   11. Rimuovere con cautela il corpo della cartuccia sollevandolo. Raccogliere molto delicatamente la membrana filtrante dal bordo usando una pinzetta. Assicurarsi di utilizzare il bordo esterno (la parte del bordo larga 1 mm) della membrana filtrante per pizzicare e tenere la membrana filtrante.
   12. Posizionare con cautela la membrana filtrante (su cui risiedono i CTC arricchiti) in un tubo da 1,5 mL per la preparazione degli acidi nucleici. Se necessario, recuperare il sangue filtrato all'uscita del sangue utilizzando una punta di pipetta da 1 ml.

4. Manutenzione del sistema

1. Preparazione per la pulizia e la disinfezione dello strumento
   1. Pulire tutte le superfici accessibili dello strumento e degli accessori una volta alla settimana utilizzando etanolo e fazzoletto essiccato, e anche immediatamente quando contaminati.
   2. Pulire regolarmente la ciotola e l'albero del rotore utilizzando alcool (etanolo e isopropanolo) o disinfettanti a base alcolica.
2. Pulizia e disinfezione dello strumento
   NOTA: per la risoluzione generale dei problemi e altre note sulla macchina, fare riferimento alla tabella supplementare 2.
   1. Spegnere lo strumento utilizzando l'interruttore di alimentazione principale. Scollegare la spina di alimentazione dall'alimentatore.
   2. Aprire lo sportello e pulire e disinfettare tutte le superfici accessibili dello strumento, compreso il cavo di alimentazione, utilizzando un panno umido e i detergenti consigliati.
   3. Controllare che l'albero del rotore non sia danneggiato. Ispezionare lo strumento per verificare la presenza di corrosione e danni.
   4. Collegare lo strumento all'alimentatore solo se è completamente asciutto dentro e fuori.
3. Scollegare la spina di alimentazione principale e rimuovere il portafusibili. Il portafusibili si trova sopra la presa di corrente. Sostituire il fusibile usato con uno di ricambio dal contenitore.

Risultati

L'obiettivo di questa tecnica è quello di isolare facilmente e automaticamente le sostanze associate al cancro dal sangue intero. In particolare, chiunque può utilizzare questa tecnica in tutti i campi adatti di ricerca e analisi. La separazione simultanea e riproducibile di più sostanze in un singolo campione di sangue è significativa nelle biopsie liquide. I dischi LBx-1 e LBx-2 sono utilizzati per isolare il plasma e il buffy coat o PBMC dal sangue intero. La Figura 1 mostra i materia...

Discussione

La quantità e la concentrazione di cfDNA e CTC dipende dall'individuo, dallo stadio e dal tipo di cancro. Dipende anche dalle condizioni del paziente 2,4,5,10,20. In particolare, nelle fasi iniziali o precancerose del cancro, le concentrazioni di sostanze correlate al cancro sono molto basse, quindi c'è un'alta possibilità che non possa essere rilevato. Tut...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3059
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL Conical Tube	SPL	50015
4150 TapeStation System	Agilent	G2992AA	Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit	Apostle	A17622-250	5 mL X 50 preps version
BD Vacutainer blood collection tubes	BD	367525	EDTA Blood Collection Tube (10 mL)
BioViewCCBS	Clinomics		BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610	Invitrogen	MHCD4522
FAST Auto cartridge	Clinomics	CLX-M3001
LBx-1 cartridge	Clinomics	CLX-M4101
LBx-2 cartridge	Clinomics	CLX-M4201
OPR-2000 instrument	Clinomics	CLX-I2001
Cover Glass	Marienfeld Superior	HSU-0101040
DynaMag 2 Magnet Stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Ficoll Paque Solution	GE healthcare	17-1440-03	density gradient solution
Filter Tip, 10 µL	Axygen	AX-TF-10	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 200 µL	Axygen	AX-TF-200	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 100 µL	Axygen	AX-TF-100	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 1000 µL	Axygen	AX-TF-1000	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	324204
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin	BD Biosciences	347653
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)	Sigma Aldrich	433284
Kimtech Science Wipers	Yuhan-Kimberly	41117
Latex glove	Microflex	63-754
Magnetic Bead Separation Rack	V&P Scientific	VP 772F2M-2
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	abcam	ab104139
Normal Human IgG Control	R&D Systems	1-001-A
OLYMPUS BX-UCB	Olympus	9217316
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Corning	21-040CVC
Portable Pipet Aid	Drummond	4-000-201
Slide Glass	Marienfeld Superior	HSU-1000612
StainTray Staining box	Simport	M920
Sterile Serological Pipette (10 mL)	SPL	91010
Triton X-100 solution	Sigma Aldrich	93443
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P7949
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)	Excelitas	010-00157