Automatische Trennung und Sammlung von krebsrelevanten Substanzen aus klinischen Proben

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Anwendung automatisierter Geräte zur einfachen und effizienten Trennung und Sammlung von Substanzen, wie z. B. zellfreier DNA und zirkulierenden Tumorzellen, aus Vollblut.

Zusammenfassung

In jüngster Zeit wurden Flüssigbiopsien verwendet, um verschiedene Krankheiten, einschließlich Krebs, zu diagnostizieren. Körperflüssigkeiten enthalten viele Substanzen, einschließlich Zellen, Proteine und Nukleinsäuren, die aus normalem Gewebe stammen, aber einige dieser Substanzen stammen auch aus dem erkrankten Bereich. Die Untersuchung und Analyse dieser Substanzen in den Körperflüssigkeiten spielt eine zentrale Rolle bei der Diagnose verschiedener Erkrankungen. Daher ist es wichtig, die erforderlichen Substanzen genau zu trennen, und es werden mehrere Techniken entwickelt, die zu diesem Zweck verwendet werden können.

Wir haben ein Lab-on-a-Disc-Gerät und eine Plattform namens CD-PRIME entwickelt. Dieses Gerät ist automatisiert und hat gute Ergebnisse für die Probenkontamination und Probenstabilität. Darüber hinaus hat es die Vorteile einer guten Erfassungsausbeute, einer kurzen Betriebszeit und einer hohen Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus können je nach Art der zu montierenden Scheibe Plasma mit zellfreier DNA, zirkulierenden Tumorzellen, peripheren mononukleären Blutzellen oder Buffy-Coats getrennt werden. So kann die Erfassung einer Vielzahl von Materialien, die in den Körperflüssigkeiten vorhanden sind, für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich der Untersuchung von Omics, erfolgen.

Einleitung

Die frühzeitige und genaue Erkennung verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, ist der wichtigste Faktor bei der Festlegung einer Behandlungsstrategie 1,2,3,4. Insbesondere die Früherkennung von Krebs steht in engem Zusammenhang mit erhöhten Überlebenschancen für den Patienten 5,6,7,8. In jüngster Zeit stehen Flüssigbiopsien für die Früherkennung von Krebs im Rampenlicht. Solide Tumoren durchlaufen eine Angiogenese und setzen verschiedene Substanzen in das Blut frei. Insbesondere zirkulierende DNA (ctDNAs), zirkulierende RNAs (ctRNAs), Proteine, Vesikel wie Exosomen und zirkulierende Tumorzellen (CTCs) wurden im Blut von Krebspatienten gefunden ^2,9. Obwohl es Unterschiede in der Menge dieser Substanzen gibt, werden sie nicht nur in den frühen Stadien, sondern auch in den späteren Stadien konsequent beobachtet ^6,10. Diese individuellen Unterschiede sind jedoch sehr hoch; Zum Beispiel beträgt die Menge an zellfreier DNA (cfDNA), die ctDNA enthält, weniger als 1.000 ng und die Anzahl der CTCs weniger als 100 in 10 ml Vollblut von Krebspatienten^11,12,13. Viele Studien haben Krebs mit diesen Substanzen charakterisiert, die in geringeren Mengen vorhanden sind (d.h. cfDNA, ctDNA und CTCs). Um genaue Ergebnisse zu erhalten, ist es wichtig, kleine Mengen von Substanzen mit hoher Reinheit^13,14 genau zu trennen. Konventionelle Zentrifugationsmethoden werden häufig verwendet, aber sie sind schwierig zu handhaben und haben je nach Geschicklichkeit des Benutzers eine geringe Reinheit. Seit der Entdeckung von CTCs wurden verschiedene Trenntechniken entwickelt, wie z. B. Zentrifugation oder Dichtegradtrennung, Immunbead und mikrofluidische Methoden. Seit der Entdeckung von CTCs wurden mehrere Containment-Techniken entwickelt. Diese Techniken sind jedoch oft begrenzt, wenn es notwendig ist, Zellen aus den verschiedenen Chips und Membranen zu isolieren, die verwendet werden, um sie zu isolieren¹⁵. Außerdem erfordern die Kennzeichnungsmethoden Geräte wie FACS, und dem nachgelagerten Prozess sind aufgrund der Markierungskontamination Grenzen gesetzt.

In letzter Zeit hat der Einsatz von Flüssigbiopsien zugenommen, und es werden verschiedene Studien zur Früherkennung von Krebs durchgeführt. Obwohl diese Methode einfach ist, gibt es immer noch Schwierigkeiten bei der nachgelagerten Analyse, und verschiedene Studien versuchen, diese Schwierigkeiten zu überwinden^16,17. Darüber hinaus benötigen viele Standorte, einschließlich Krankenhäuser, automatisierte, reproduzierbare und hochreine Methoden, die bequem zu bedienen sind. Hier haben wir ein Lab-on-a-Disc für die automatisierte Trennung von Substanzen aus Blutproben nach einer Flüssigbiopsie entwickelt. Diese Geräte basieren auf dem Prinzip der Zentrifugation, Mikrofluidik und porengroßen Zellerfassung. Es gibt drei Arten von Bandscheiben: LBx-1 kann Plasma und Buffy-Coat aufnehmen, während LBx-2 Plasma und PBMC aus Vollblut mit einem Volumen von weniger als 10 ml aufnehmen kann. FAST-auto kann CTCs auch mit einer Membran erfassen, die von der Scheibe abnehmbar ist. Bis zu vier Stück pro Disc können in einem Durchlauf verwendet werden. Der Vorteil dieses Geräts und dieser Methode besteht vor allem darin, dass sie mit einer geringen Menge Blut eine Vielzahl von krebserregenden Substanzen aus derselben Probe gewinnen kann. Das bedeutet, dass dem Patienten nur einmal Blut abgenommen werden muss. Darüber hinaus hat es den Vorteil, dass Fehler aufgrund von Unterschieden in der Blutentnahmezeit ausgeschlossen werden. Diese Plattform ist einfach zu bedienen und liefert genaue Ergebnisse für Flüssigbiopsien und nachgelagerte Anwendungen. In diesem Protokoll wird die Verwendung des Geräts und der Patrone eingeführt.

Protokoll

Alle Vollblutproben wurden von Lungenkrebspatienten gewonnen. Die Forschung und Analyse bei Clinomics wird vom Cancer Genomics Research Institute durchgeführt, und die IRB-Forschungsgenehmigung durch die Regierung wird vom Asan Medical Center Institutional Review Committee (IRB Nr. 2021-0802) geleitet, wobei die IRB-Nummer für die Forschung bei Clinomics registriert ist.

1. Probenvorbereitung

1. Sammeln Sie 9 ml Vollblut in einem EDTA- oder cfDNA-stabilen Blutentnahmeröhrchen.
2. Mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen ca. 10 Mal auf und ab drehen.
3. Lagern Sie die Proben bei Raumtemperatur (RT; für Kurzzeitlagerung) oder 4 °C (für Langzeitlagerung). Nicht einfrieren und auftauen.

2. Gerätevorbereitung

1. Drücken Sie den Netzschalter, um das Gerät einzuschalten.
   HINWEIS: Auf dem Touchpad wird ein Ladebildschirm angezeigt, und das Gerät wird initialisiert. Halten Sie während der Initialisierung die Hände vom Gerät fern. Nach Abschluss der Geräteinitialisierung wird der Bildschirm zur Auswahl der Kartusche angezeigt.
2. Wählen Sie den zu verwendenden Beispielmodus aus. Ändern Sie die Anzahl der Stichproben, indem Sie auf den Pfeil drücken.

3. Gerätebetrieb und Probenentnahme

1. Einlegen der LBx-1-Kassette
   1. Wählen Sie den Kassettentyp auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Geräts aus. Ändern Sie die Anzahl der Proben, indem Sie die Pfeiltaste drücken.
   2. Öffnen Sie die Klappe des Instruments und setzen Sie alle zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein. Vergewissern Sie sich, dass Sie die Patrone und den Patronenhalter richtig einsetzen. Wenn die Kartusche nicht richtig eingesetzt wird, kann dies zu erheblichen Schäden am Instrument führen.
   3. Für insgesamt vier Patronen legen Sie die Dummy-Patrone in den leeren Raum des Patronenhalters.
   4. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen.
   5. Schließen Sie die Klappe und drücken Sie die RUN-Taste auf dem Touchscreen. Das Gerät schließt die Ventile an den Kartuschen, was ca. 30 s dauert.
   6. Befolgen Sie die Meldung, um die Klappe zu öffnen, das Stützrad zu entfernen und die mit dem Ventil geschlossene Patrone aus dem Patronenhalter zu entfernen.
   7. Legen Sie die Patrone auf den Tisch und bereiten Sie die Injektion der Vollblutprobe vor. Pipettieren Sie maximal 10 ml Vollblutprobe mit einer serologischen Pipette.
      VORSICHT: Gefahren beim Umgang mit Blut. Während des gesamten Verfahrens des Umgangs mit Blutproben und Reagenzien ist es wichtig, einen Laborkittel und Laborhandschuhe zu tragen. Das bereitgestellte Sicherheitsdatenblatt sollte von den Labormitarbeitern gründlich untersucht werden.
   8. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Probeneinlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Vollblutprobe.
      HINWEIS Bei der Verwendung von mindestens 9 ml Vollblutprobe ist keine Zugabe von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) erforderlich. Wenn Sie weniger als 9 ml Vollblutprobe verwenden, fügen Sie PBS hinzu, um das Gesamtvolumen auf 9 ml zu erhöhen. Wenn Sie beispielsweise 7,2 ml Vollblut verwenden, geben Sie bitte 1,8 mL PBS in den Probeneinlass. Für die Injektion von Vollblut und PBS kann eine serologische Pipette oder eine Pipettenspitze verwendet werden. Bei Verwendung von weniger als 8 ml Vollblutprobe kann der Buffycoat auch durch Zugabe von 1 ml PBS nicht wiederhergestellt werden. Für die gDNA-Vorbereitung verwenden Sie 200 μL Vollblut, das vor diesem Schritt abgetrennt wurde.
   9. Setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Taste OK .
      HINWEIS: Plasma und Buffy Coat werden automatisch vom Vollblut getrennt, was ca. 30 Minuten dauert.
      ACHTUNG Gefahr während des Betriebs. Das Öffnen der Tür oder das Berühren des Instruments bei Hochgeschwindigkeitsdrehvorgängen kann zu schweren Verletzungen führen. Zudem besteht Verletzungsgefahr durch asymmetrische Belastung des Rotors. Wenn ungewöhnliche Vibrationen und Geräusche auftreten, wenn das Gerät im assistierten Zellanreicherungs- oder Expertenmodus startet, kann die Platzierung der Kartuschen asymmetrisch sein. Drücken Sie sofort die Ein-/Aus-Taste, um die Patrone zu stoppen und ordnungsgemäß einzusetzen.
   10. Suchen Sie nach der Meldung auf dem Bildschirm, begleitet von einem Alarmton, der erscheint, wenn die Trennung von Plasma und Buffy Coat abgeschlossen ist.
   11. Stoppen Sie den Alarm, indem Sie die Tür öffnen oder die STOP-Taste drücken. Öffnen Sie die Tür, nehmen Sie die Patrone heraus und legen Sie sie auf den Tisch.
   12. Gewinnen Sie 3 ml Plasma aus dem Plasmaauslass mit einer 1 ml Pipettenspitze. Gewinnen Sie den Buffy Coat von 3 ml aus dem Buffy Coat-Auslass mit einer 1 ml Pipettenspitze.
2. Einlegen der LBx-2-Kassette
   1. Wählen Sie den Namen der Patrone auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Geräts aus. Ändern Sie die Anzahl der Proben, indem Sie die Pfeiltaste drücken.
   2. Öffnen Sie die Klappe, und setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein.
   3. Für insgesamt vier Patronen legen Sie die Dummy-Patrone in den leeren Raum des Patronenhalters.
   4. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Patrone korrekt in den Patronenhalter eingesetzt wird. Wenn die Kartusche nicht richtig eingesetzt wird, kann dies zu erheblichen Schäden am Instrument führen.
   5. Schließen Sie die Klappe und drücken Sie die RUN-Taste auf dem Touchscreen. Das Gerät schließt die Ventile an der Kartusche, was ca. 30 s dauert.
   6. Befolgen Sie die Anweisungen, um die Klappe zu öffnen, das Stützrad zu entfernen, die mit dem Ventil geschlossene Kartusche aus dem Patronenhalter zu entfernen und auf den Tisch zu legen.
   7. Legen Sie die Patrone auf den Tisch und bereiten Sie die Injektion der Dichtegradientenlösung und der Vollblutprobe vor. Das Volumen der zu injizierenden Dichtegradientenlösung und des zu injizierenden PBS ist in Abhängigkeit vom Volumen der Vollblutprobe zu überprüfen (Zusatztabelle 1).
   8. Die Dichtegradientenlösung wird mit einer serologischen Pipette pipettiert. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Einlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Dichtegradientenlösung.
   9. Nach der Injektion der Dichtegradientenlösung wird die Vollblutprobe mit einer serologischen Pipette pipettiert. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Probeneinlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Vollblutprobe.
      HINWEIS: Wenn Sie weniger als 9 ml der Vollblutprobe verwenden, fügen Sie PBS gemäß dieser Tabelle hinzu (Zusatztabelle 1).
   10. Setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der richtigen Reihenfolge ein, wie sie auf dem Patronenhalter angegeben sind. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Taste OK .
   11. Plasma und PBMC werden automatisch vom Vollblut getrennt, was ca. 30 Minuten dauert. Suchen Sie nach der Meldung, die von einem Alarmton begleitet wird, wenn die Trennung von Plasma und PBMC abgeschlossen ist.
   12. Stoppen Sie den Alarm, indem Sie die Tür öffnen oder die STOP-Taste drücken. Öffnen Sie die Tür, nehmen Sie die Patrone heraus und legen Sie sie auf den Tisch.
   13. Gewinnen Sie 3 ml Plasma aus dem Plasmaauslass mit einer 1 ml Pipettenspitze. Gewinnen Sie 3 ml PBMC aus dem PBMC-Auslass mit einer 1-ml-Pipettenspitze.
3. Einlegen der FAST-Auto-Patrone
   1. Wählen Sie die Kassette auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Instruments aus. Ändern Sie die Anzahl der Proben, indem Sie die Pfeiltaste drücken.
   2. Öffnen Sie die Klappe, und setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein. Für insgesamt vier Patronen legen Sie die Dummy-Patrone in den leeren Raum des Patronenhalters.
   3. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen.
   4. Schließen Sie die Klappe und drücken Sie die RUN-Taste auf dem Touchscreen. Das Gerät schließt die Ventile an der Kartusche, was ca. 30 s dauert.
   5. Befolgen Sie die Meldung, um die Klappe zu öffnen, das Stützrad zu entfernen und die mit dem Ventil geschlossene Patrone aus dem Patronenhalter zu entfernen.
   6. Legen Sie die Patrone auf den Tisch und bereiten Sie die Injektion der PBS-Lösung und der Vollblutprobe vor. Pipettieren Sie 6 ml PBS-Lösung mit einer serologischen Pipette. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den PBS-Einlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam 6 ml der PBS-Lösung.
   7. Nach der Injektion der PBS-Lösung werden 3 ml Vollblut oder PBMC-Probe aus LBx-2 mit einer serologischen Pipette pipettiert, die zuvor mit 1% BSA gespült wurde, um ein Anhaften des Rückstands zu verhindern. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Probeneinlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Vollblutprobe.
   8. Setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Taste OK .
   9. CTCs werden automatisch aus Vollblut angereichert, was ca. 15 Minuten dauert. Suchen Sie nach einer Meldung, die von einem Alarmton begleitet wird, wenn die Anreicherung der CTCs abgeschlossen ist. Stoppen Sie den Alarm, indem Sie die Tür öffnen oder die STOP-Taste drücken.
   10. Öffnen Sie die Tür, nehmen Sie die Patrone heraus und legen Sie sie auf den Tisch. Führen Sie den hinteren Plattenentferner (BPR) in die vier Löcher an der Vorderseite der Patrone ein. Drücken Sie den dunkelblauen Flügel mit den Daumen beider Hände und drücken Sie dann auf den hellblauen Körper, bis er klickt.
   11. Entfernen Sie vorsichtig das Kartuschengehäuse, indem Sie es anheben. Nehmen Sie die Filtermembran mit einer Pinzette ganz vorsichtig am Rand auf. Bitte achten Sie darauf, den äußeren Rand (den 1 mm breiten Randteil) der Filtermembran zu verwenden, um die Filtermembran einzuklemmen und zu halten.
   12. Legen Sie die Filtermembran (auf der sich angereicherte CTCs befinden) vorsichtig in ein 1,5-ml-Röhrchen zur Nukleinsäurepräparation. Falls erforderlich, das gefilterte Blut mit einer 1-ml-Pipettenspitze in den Blutauslass zurückgewinnen.

4. Wartung des Systems

1. Vorbereitung für die Reinigung und Desinfektion des Instruments
   1. Reinigen Sie alle zugänglichen Oberflächen des Instruments und des Zubehörs einmal pro Woche mit Ethanol und getrocknetem Gewebe und auch sofort, wenn es kontaminiert ist.
   2. Reinigen Sie die Trommel und die Rotorwelle regelmäßig mit Alkohol (Ethanol und Isopropanol) oder Desinfektionsmitteln auf Alkoholbasis.
2. Reinigung und Desinfektion des Instruments
   HINWEIS: Allgemeine Hinweise zur Fehlerbehebung und andere Hinweise zum System finden Sie in der Zusatztabelle 2.
   1. Schalten Sie das Gerät mit dem Hauptnetzschalter aus. Trennen Sie den Netzstecker von der Stromversorgung.
   2. Öffnen Sie die Tür und reinigen und desinfizieren Sie alle zugänglichen Oberflächen des Geräts, einschließlich des Netzkabels, mit einem feuchten Tuch und den empfohlenen Reinigungsmitteln.
   3. Überprüfen Sie die Rotorwelle auf Beschädigungen. Untersuchen Sie das Gerät auf Korrosion und Beschädigungen.
   4. Schließen Sie das Gerät nur dann an die Stromversorgung an, wenn es innen und außen vollständig trocken ist.
3. Ziehen Sie den Netzstecker ab und entfernen Sie den Sicherungshalter. Der Sicherungshalter befindet sich über der Steckdose. Ersetzen Sie die gebrauchte Sicherung durch eine Ersatzsicherung aus dem Behälter.

Ergebnisse

Ziel dieser Technik ist es, krebsassoziierte Substanzen einfach und automatisch aus dem Vollblut zu isolieren. Insbesondere kann jeder diese Technik in allen geeigneten Forschungs- und Analysebereichen einsetzen. Die gleichzeitige und reproduzierbare Trennung mehrerer Substanzen in einer einzigen Blutprobe ist bei Flüssigbiopsien von Bedeutung. Die LBx-1- und LBx-2-Scheiben werden zur Isolierung von Plasma und Buffy Coat oder PBMC aus Vollblut verwendet. Abbildung 1 zeigt die Materialien, d...

Diskussion

Die Menge und Konzentration von cfDNA und CTC hängt vom Individuum, dem Stadium und der Art des Krebses ab. Es hängt auch vom Zustand des Patienten^ab 2,4,5,10,20. Insbesondere in den frühen oder präkanzerösen Stadien von Krebs sind die Konzentrationen krebsrelevanter Substanzen sehr gering, so dass eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie nicht nach...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% BSA (Bovine Serum Albumin)	Sigma-Aldrich	A3059
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15 mL Conical Tube	SPL	50015
4150 TapeStation System	Agilent	G2992AA	Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit	Apostle	A17622-250	5 mL X 50 preps version
BD Vacutainer blood collection tubes	BD	367525	EDTA Blood Collection Tube (10 mL)
BioViewCCBS	Clinomics		BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610	Invitrogen	MHCD4522
FAST Auto cartridge	Clinomics	CLX-M3001
LBx-1 cartridge	Clinomics	CLX-M4101
LBx-2 cartridge	Clinomics	CLX-M4201
OPR-2000 instrument	Clinomics	CLX-I2001
Cover Glass	Marienfeld Superior	HSU-0101040
DynaMag 2 Magnet Stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Ficoll Paque Solution	GE healthcare	17-1440-03	density gradient solution
Filter Tip, 10 µL	Axygen	AX-TF-10	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 200 µL	Axygen	AX-TF-200	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 100 µL	Axygen	AX-TF-100	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 1000 µL	Axygen	AX-TF-1000	Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	324204
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin	BD Biosciences	347653
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)	Sigma Aldrich	433284
Kimtech Science Wipers	Yuhan-Kimberly	41117
Latex glove	Microflex	63-754
Magnetic Bead Separation Rack	V&P Scientific	VP 772F2M-2
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	abcam	ab104139
Normal Human IgG Control	R&D Systems	1-001-A
OLYMPUS BX-UCB	Olympus	9217316
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Corning	21-040CVC
Portable Pipet Aid	Drummond	4-000-201
Slide Glass	Marienfeld Superior	HSU-1000612
StainTray Staining box	Simport	M920
Sterile Serological Pipette (10 mL)	SPL	91010
Triton X-100 solution	Sigma Aldrich	93443
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P7949
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)	Excelitas	010-00157