Un método para estudiar la correlación entre la estructura local del colágeno y las propiedades mecánicas del tejido fibroso de la placa aterosclerótica

Resumen

Hemos desarrollado una tubería de imágenes mecanológicas para estudiar las propiedades heterogéneas estructurales y mecánicas de la placa aterosclerótica. Esta tubería permite la correlación del ángulo predominante local y la dispersión de la orientación de la fibra de colágeno, el comportamiento de ruptura y las huellas dactilares de tensión del tejido de la placa fibrosa.

Resumen

La ruptura de placas ateroscleróticas en las arterias coronarias y carótidas es la causa principal de eventos cardiovasculares fatales. Sin embargo, la mecánica de ruptura del tejido heterogéneo y altamente colágeno de la placa, y cómo esto se relaciona con la estructura fibrosa del tejido, aún no se conocen. Las tuberías existentes para estudiar la mecánica de la placa se limitan a obtener solo características mecánicas brutas del tejido de la placa, basadas en el supuesto de homogeneidad estructural del tejido. Sin embargo, el tejido de la placa fibrosa es estructuralmente heterogéneo, posiblemente debido principalmente a la variación local en la arquitectura de la fibra de colágeno.

La tubería de imágenes mecanográficas descrita aquí se ha desarrollado para estudiar las propiedades heterogéneas estructurales y mecánicas de la placa. En esta tubería, la arquitectura de colágeno local del tejido se caracteriza utilizando microscopía multifotónica (MPM) con segunda generación armónica (SHG), y el comportamiento de falla del tejido se caracteriza bajo condiciones de prueba de tracción uniaxial utilizando análisis de correlación de imagen digital (DIC). Esta tubería experimental permite la correlación del ángulo predominante local y la dispersión de la orientación de la fibra de colágeno, el comportamiento de ruptura y las huellas dactilares de tensión del tejido de la placa fibrosa. El conocimiento obtenido es clave para comprender, predecir y prevenir mejor los eventos de ruptura de placa aterosclerótica.

Introducción

El accidente cerebrovascular isquémico, a menudo desencadenado por la ruptura de la placa aterosclerótica en las arterias carótidas, es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo¹. Sin embargo, las estrategias actuales de planificación del tratamiento quirúrgico para prevenir el accidente cerebrovascular relacionado con la aterosclerosis carotídea no incluyen la evaluación del riesgo de ruptura de placa². Esto se debe principalmente a que los biomarcadores de riesgo sugeridos anteriormente, como el grosor de la tapa^de la placa 3 y^{el tamaño 4} del núcleo lipídico, han demostrado tener un valor predictivo subóptimo para futuros eventos clínicos ^5,6. Es necesaria una mejor comprensión de la mecánica de la placa y los mecanismos de ruptura para optimizar la evaluación del riesgo de ruptura de placa e identificar nuevos marcadores de riesgo de placas ateroscleróticas.

La ruptura de la placa es un evento mecánico local en el que el tejido de placa altamente fibroso no puede soportar la carga mecánica ejercida sobre él por la presión arterial y pierde su integridad estructural⁷. A pesar de esto, la mecánica del evento de ruptura de placa y su vínculo con la microestructura subyacente son poco conocidos⁸. Los pocos estudios experimentales que caracterizaron las características de insuficiencia tisular de la placa 9,10,11,12,13 informaron propiedades de ruptura mecánica macroscópica (es decir^, deformación y resistencia a la falla de tracción final), derivadas con el supuesto de homogeneidad estructural del tejido. Sin embargo, el tejido fibroso de la placa es estructuralmente heterogéneo, posiblemente debido principalmente a la variación local en la arquitectura de la fibra de colágeno¹⁴. Además, el vínculo entre las características de falla mecánica del tejido de la placa y la arquitectura del colágeno solo se investigó en un estudio reciente de Johnston et al. Los autores mostraron una diferencia entre placas en la orientación predominante de la fibra y reportaron mayores tensiones finales y menores cepas finales para muestras de tapa de placa fibrosa con una orientación predominantemente circunferencial^{de fibra 15}. Sin embargo, el estudio también se limitó a las propiedades mecánicas y estructurales brutas.

Para arrojar luz sobre la información esencial sobre la arquitectura local del colágeno y las propiedades mecánicas locales del tejido de la placa fibrosa, en el estudio actual, hemos desarrollado una tubería de mecano-imagen. Esta tubería ex vivo permite cuantificar la dirección y dispersión de la fibra de colágeno local, así como la tensión de ruptura local. La tubería incluye imágenes MPM con SHG para obtener imágenes de fibras de colágeno en el tejido de la placa, así como DIC y pruebas de tracción uniaxiales para cuantificar las características de ruptura del tejido.

La microscopía multifotónica-segunda generación armónica (MPM-SHG) se ha convertido en una técnica popular para estudiar el colágeno en tejidos biológicos¹⁶. La técnica tiene muchas ventajas en comparación con otras técnicas de imagen de colágeno, como la histología¹⁷, la imagen con tensor de difusión (DTI)14 y la dispersión de luz de ángulo pequeño (SALS)¹⁵. En primer lugar, las imágenes MPM-SHG no son destructivas, lo que las hace ideales para combinarlas con pruebas mecánicas¹⁸. En segundo lugar, la señal SHG es específica para el colágeno y, por lo tanto, no es necesario teñir el tejido. Debido a las longitudes de onda de excitación largas (infrarrojo cercano), la profundidad de penetración es mayor que con otras técnicas de microscopía¹⁶. La alta resolución (nivel μm) lograda con imágenes SHG también permite la visualización de fibras individuales. Esto ofrece muchas posibilidades, como la cuantificación local del número de fibras de colágeno, la orientación de la fibra de colágeno y la distribución¹⁹.

La correlación digital de imágenes (CID) combinada con pruebas mecánicas es un método ampliamente utilizado para obtener propiedades mecánicas locales de tejidos biológicos²⁰. Con DIC, el desplazamiento de las manchas aplicadas en la superficie del tejido se rastrea comparando imágenes de cámara de alta velocidad adquiridas durante las pruebas mecánicas²⁰. Este método de postprocesamiento de imágenes se utiliza para estimar las tensiones superficiales de campo completo de la muestra²⁰ y también se puede utilizar para estudiar el comportamiento de ruptura del tejido²¹.

Protocolo

Todos los métodos descritos en este documento fueron aprobados por el Comité de Investigación Ética del Centro Médico Erasmus de Rotterdam; Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de la recolección de muestras de placa. En la figura 1 se muestra un gráfico de flujo de trabajo del protocolo.

1. Recolección de tejido, imágenes por microtomografía computarizada (μCT) y preparación de muestras de prueba

1. Recolección y almacenamiento de tejidos
   1. Recolectar muestras frescas de placa aterosclerótica carotídea humana de pacientes que dieron su consentimiento y que se sometieron a cirugía de endarterectomía carotídea.
      NOTA: Las muestras de placa recuperadas de esta cirugía consisten en la capa íntima enferma de la arteria carótida, incluyendo la acumulación de grasa (la reserva lipídica) y calcificaciones²².
   2. Retire los restos de sangre con solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) y seque la muestra con una gasa.
   3. Coloque la muestra en un tubo de 15 ml con unas pinzas. Congele el tejido colocando el tubo en nitrógeno líquido durante 10 minutos.
   4. Después de la congelación rápida, guarde la muestra en un congelador de -80 °C hasta el día de la toma de imágenes por TC.
      NOTA: La congelación rápida minimiza la formación de cristales, lo que lleva a daños microestructurales en el tejido. Un estudio previo sobre tejido aórtico porcino ha demostrado que la congelación instantánea y el almacenamiento a -80 °C no tuvieron una influencia significativa en las propiedades mecánicas del tejido²³.
2. Imágenes por TC μ
   1. El día de la toma de imágenes por TC μ, saque la muestra de placa del tubo de 15 ml. Si el tejido se adhiere al tubo, llene el tubo con PBS a temperatura ambiente. Deje el tejido en PBS hasta que la muestra pueda ser extraída del tubo.
   2. Seque bien la muestra de placa con papel de seda.
   3. Encienda el sistema μCT pulsando el botón verde . Presione calentar en el software CT en la parte inferior de la pantalla y espere 15 minutos.
   4. Coloque manualmente un filtro de rayos X de Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm en el sistema μCT.
   5. Seleccione la carpeta en la que se almacenarán las imágenes.
   6. Elija los parámetros en el panel izquierdo. Utilice las listas desplegables para seleccionar un tiempo de escaneo de 4 min, una resolución de 172 μm, un voltaje de 90 kV, un amperaje de 88 mA, un campo de visión de 86 mm y una rotación de 360°.
   7. Abra la puerta del dispositivo. Extraiga la plataforma manualmente.
   8. Coloque parafilm en la plataforma y coloque la muestra en la plataforma (hacia el extremo más alejado de la plataforma).
   9. Coloque manualmente la plataforma en el dispositivo y cierre la puerta.
   10. Active el modo en vivo (icono del ojo ). Mueva la plataforma con las flechas del dispositivo para centrar la muestra en el FOV.
   11. Inicie la creación de imágenes (icono en la parte inferior central). Una vez finalizada la imagen, presione el ícono de la puerta en la parte inferior (debajo del botón de cancelación ).
   12. Después de la gammagrafía μCT, congele rápidamente la muestra de placa de nuevo como se describe en el paso 1.1.3. Almacénelo a -80 °C hasta el día de la microscopía multifotónica y las pruebas mecánicas.
   13. Abra los archivos DICOM adquiridos de la imagen μCT en el software 3D Slicer de código abierto²⁴.
   14. Vaya al editor de segmentos . Seleccione crear una nueva segmentación | el volumen que se analizará como volumen maestro.
   15. Haga clic en Agregar para agregar un segmento. Presione su nombre y color para cambiar estos parámetros.
   16. Para definir los segmentos, haga clic en efectos | umbral en la parte inferior de la ventana. Utilice esta herramienta de umbral para diferenciar entre regiones de tejido calcificado (>450 HU) y no calcificado (<450 HU). Una vez seleccionado el umbral, pulse Aplicar en la parte inferior.
   17. Pulse Mostrar 3D (justo a la derecha de Agregar) para visualizar la segmentación en la vista 3D. Si hay zonas de la segmentación que no se desean, elimínelas con el efecto tijera.
   18. Cambie la opacidad de los segmentos en el módulo de segmentación haciendo clic en el nombre de la segmentación deseada.
       NOTA: Si es posible, las imágenes de μCT y la revisión de las imágenes de μCT se pueden realizar el mismo día que el resto del protocolo. En ese caso, omita el paso 1.2.12. Sin embargo, tenga en cuenta que los pasos posteriores de este protocolo también consumen mucho tiempo y deben realizarse el mismo día. Después de un poco de práctica, y con la configuración y el tejido descritos, las imágenes de μCT deben tomar ~ 45 min, la revisión de las imágenes de μCT ~ 15 min, la preparación de la muestra de prueba de una sola muestra de prueba ~ 1 h, microscopía ~ 4 h y la prueba de tracción uniaxial ~ 2 h.
3. Preparación de muestras de prueba
   1. El día de las imágenes de colágeno y las pruebas mecánicas, descongele la placa por inmersión en PBS a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos.
   2. Abra la construcción 3D de la placa creada en los pasos 1.2.13-1.2.18 en el software de corte 3D.
   3. Utilice los puntos de referencia naturales del tejido de la placa para identificar qué partes de la reconstrucción 3D corresponden a la muestra de placa real. Identificar qué área de la reconstrucción 3D no contiene calcificaciones e identificar visualmente esta área en la placa real.
   4. Corte la placa abierta a lo largo del eje longitudinal de la arteria con tijeras quirúrgicas y pinzas. Si ya hay un corte presente de la cirugía, comience desde este corte para un uso óptimo del tejido. Si la muestra no tiene forma tubular y es difícil definir la dirección longitudinal, excluir la muestra de la prueba.
   5. Recorte muestras de prueba rectangulares de las muestras de placa. Asegúrese de que las muestras de prueba sean lo más grandes posible y evite las regiones de tejido que contengan desgarros o calcificaciones. Tenga cuidado durante este corte, ya que un pequeño desgarro o grieta en el borde de la muestra de prueba puede provocar la propagación de grietas a partir de la grieta existente durante la prueba de tracción.
   6. Asegúrese de que las muestras de prueba tengan una relación ancho-longitud (WL) de <1 en la longitud del medidor una vez montadas en el probador de tracción. Si las muestras cumplen este requisito, son adecuadas para ensayos de tracción apropiados en términos de condiciones límite²⁵.
      NOTA: El rango en las dimensiones de la muestra puede ser grande. Las muestras que los autores probaron tenían una longitud de calibre que oscilaba entre 3,4 y 12,9 mm y un ancho que oscilaba entre 1,6 y 6,4 mm.

2. Imágenes de microscopía multifotónica

1. Preparativos
   1. Antes del día de las imágenes de colágeno y las pruebas mecánicas, divida 40 g de una base de elastómero de silicona en dos tubos de 50 ml y agregue 2 g del agente de curado a cada tubo (proporción de 1:10) con una pipeta Pasteur. Mezclar los dos componentes con la pipeta.
   2. Centrifugar los tubos durante 1 min a 700 × g para eliminar tantas burbujas de aire como sea posible.
   3. Llenar una placa de Petri (10 cm de diámetro) con una capa fina (aproximadamente 0,5-1 cm) de silicio e incubarla en el horno a 65 °C durante 3 h o colocarla a temperatura ambiente durante 48 h.
   4. Tome una muestra de prueba de placa y fije ambos extremos al silicio clavando agujas en el tejido (Figura 2A). Asegúrese de que el lado luminal de la muestra esté orientado hacia arriba. Inserte las agujas en la región de la muestra que estará en las abrazaderas del dispositivo de prueba de tracción durante la prueba mecánica.
   5. Póngase gafas de seguridad. Use un cortador lateral para acortar las agujas de modo que sobresalgan a menos de unos pocos milímetros por encima de la superficie de la muestra, para evitar que dañen el objetivo del microscopio. Llene la placa de Petri con PBS hasta que la muestra esté sumergida.
2. Configuración de microscopía
   1. Asegúrese de que un objetivo adecuado está montado en el microscopio multifotónico. Utilice un objetivo optimizado para transmitir luz infrarroja, con un aumento de 20x.
   2. Ponga en marcha el sistema de microscopio. Abra el software operativo del microscopio.
   3. Cuando se le pida que inicialice la tabla de imágenes, asegúrese de que el brazo del condensador del microscopio esté empujado hacia atrás y que el objetivo esté en la posición más baja.
   4. Activa el láser multifotón.
   5. Coloque la placa de Petri con la muestra de prueba debajo del objetivo, como en la figura 3. Asegúrese de no colocar el objetivo sobre la muestra todavía, ya que la configuración del láser aún debe optimizarse. De lo contrario, la posible alta potencia de la luz láser puede provocar daños en el tejido.
   6. Asegúrese de que el objetivo esté ligeramente inmerso en PBS. Use una pipeta para agregar PBS adicional si es necesario.
   7. Establezca la longitud de onda de la luz en 880 nm.
      NOTA: Esta longitud de onda se elige porque el filtro de emisión SHG en el sistema de dos fotones utilizado tiene una longitud de onda central de aproximadamente 440 nm. Para otros microscopios, una longitud de onda diferente podría ser más aplicable.
3. Escaneo de mosaicos y selección de ubicaciones de imágenes
   1. Apague el láser multifotón y active el modo de campo claro del microscopio. Luego, active el modo de escaneo en vivo .
   2. Coloque la etapa de tal manera que el objetivo esté situado por encima de la muestra y enfoque la superficie de la muestra. Desactive el modo de escaneo en vivo .
   3. En la pestaña de adquisición , en el segundo panel, cambie el factor de zoom a 1 deslizando la barra deseada.
      NOTA: Este factor de zoom, junto con el factor de ampliación del objetivo (20x), determina el tamaño de la imagen capturada (739 μm x 739 μm).
   4. En la pestaña de adquisición, en el segundo panel, cambie la velocidad de escaneo a 400 Hz, el promedio de línea a 1 y la resolución a 128 x 128 píxeles por imagen (tamaño de píxel de ~ 5.8 μm x 5.8 μm) utilizando las listas desplegables.
   5. En la pestaña de adquisición , en el primer panel, haga clic en el símbolo de patrón ráster y espere a que aparezca un panel de escaneo de mosaico .
   6. Active el modo de escaneo en vivo . Mueva el objetivo a una esquina de la muestra con las perillas del panel inteligente y haga clic en el símbolo de posición de marca en el panel de escaneo de mosaico. Repita esto para cada esquina de la muestra. Si se realiza correctamente, aparecerá una cuadrícula con todos los mosaicos seleccionados para la creación de imágenes en naranja.
   7. Desactiva la función de unión automática .
   8. Haga clic en Inicio en la esquina inferior derecha de la pantalla para crear un escaneo en mosaico de toda la superficie de la muestra para obtener una visión general de la geometría de la muestra.
      NOTA: Según la configuración descrita, el tejido y el sistema de microscopio, la adquisición de un escaneo de mosaico de toda la superficie de la muestra toma ~ 10 minutos.
   9. Después del escaneo de mosaicos, observe las coordenadas x e y de la esquina superior izquierda de cada mosaico en el panel de escaneo de mosaico, que se muestran automáticamente por el software del sistema de microscopía. Anote estas coordenadas en una hoja de cálculo.
   10. En el software del microscopio, en el panel de escaneo de mosaicos, observe el número de mosaicos en las direcciones x e y en la caja llamada scanfield. Tenga en cuenta el tamaño del escaneo de mosaico en la hoja de cálculo. Calcula las coordenadas de las otras fichas sumando/restando el tamaño de la baldosa (739 μm).
       NOTA: Estas coordenadas son necesarias para identificar la ubicación exacta de los mosaicos que se van a escanear con imágenes SHG. Si el tiempo total de creación de imágenes no es una preocupación, se pueden crear imágenes de todos los mosaicos sin omitir ningún mosaico.
   11. En el escaneo de mosaicos, seleccione los mosaicos de los que se desea obtener una imagen con imágenes SHG. Para esta selección, evite las baldosas que estarán en las abrazaderas y deje una baldosa entre cada baldosa seleccionada tanto en la dirección longitudinal como en la circunferencial, como se muestra en la Figura 2B.
4. Visualización del colágeno: imágenes SHG
   1. Apague las luces de la habitación y cubra la etapa del microscopio con tela opaca también para que ninguna luz de la habitación llegue al detector.
      NOTA: Minimizar la luz que llega a los detectores disminuirá el ruido durante la adquisición de imágenes.
   2. Encienda el láser multifotón (MP).
   3. Seleccione el detector de detección no escaneada (NDD) que está equipado con un filtro de paso de banda de 430-450 nm.
   4. Identifique la ubicación de los mosaicos de los que se va a crear una imagen utilizando la información adquirida en el paso 2.3.10. Rellene las coordenadas en los cuadros designados y haga clic en enter, para que el objetivo se mueva al mosaico derecho. Active el modo de escaneo en vivo.
      NOTA: Con otros microscopios o versiones más recientes del software operativo, el movimiento a ubicaciones dentro del escaneo de mosaico se puede hacer automáticamente. En este caso, no es necesario anotar las coordenadas x e y de cada mosaico (paso 2.3.10) y completar las coordenadas en el software operativo (paso 2.4.4).
   5. Aumente la potencia del láser MP utilizando el control deslizante en el panel superior debajo de la configuración de la trayectoria del haz para obtener la mayor potencia láser posible sin blanqueamiento significativo. Luego, ajuste la ganancia del detector para obtener imágenes brillantes, pero sin píxeles saturados, usando la perilla en el panel inteligente o haciendo clic en el nombre del detector en la configuración de la trayectoria del haz | canales adicionales. Los valores típicos para la ganancia del detector están entre 500 y 800 V.
   6. Utilice la perilla de posición z del panel inteligente para ajustar el plano de enfoque.
   7. Desplácese a la parte superior de la muestra y establezca las posiciones de la parte superior de la pila z haciendo clic en la punta de flecha en el panel de la pila z (en la pestaña adquisición |^3º panel).
   8. Luego, concéntrese en la muestra hasta que la señal SHG ya no se detecte, este es el final de la pila. Nuevamente, haga clic en la punta de flecha en el panel z-stack para establecer esta posición. Cuando haya terminado, desactive el modo de escaneo en vivo .
      NOTA: El tejido puede no ser completamente plano. Por lo tanto, la superficie de la muestra de diferentes regiones dentro del tejido puede tener posiciones ligeramente diferentes en la dirección z.
   9. En la pestaña de adquisición, en el segundo panel, mantenga la velocidad de escaneo en 400 Hz, establezca el promedio de línea en 2 y la resolución en 512 x 512 píxeles por imagen (tamaño de píxel de ~ 1.4 μm x 1.4 μm) utilizando las listas desplegables. Active el botón de escaneo X bidireccional.
   10. Haga clic en el tamaño del paso z en el panel z-stack y rellene un tamaño de paso z de 3 μm en el cuadro. Haga clic en Inicio en la esquina inferior derecha de la pantalla para crear una pila z. Cuando haya terminado, asegúrese de guardar las coordenadas del mosaico en el nombre de archivo o asigne a cada mosaico su propio número (como en la Figura 2B).
       NOTA: Según la configuración descrita, el tejido y el sistema de microscopio, la adquisición de una pila z de una sola baldosa toma ~ 10-15 min. Los pasos de preparación (pasos 2.4.4-2.4.10) se incluyen dentro de esta estimación de tiempo.

3. Ensayos mecánicos

1. Preparación de la configuración de prueba de tracción uniaxial
   1. Prepare la configuración de la prueba de tracción horizontal (Figura 4) para su uso, siguiendo las instrucciones para el probador de tracción (por ejemplo, encienda el software, conecte las abrazaderas, conecte la célula de carga).
   2. Para minimizar el deslizamiento de la muestra de ensayo, fije cinta de espuma de dos caras (Figura 4A, B-2) a las caras internas de las abrazaderas del probador de tracción y papel de lija al lado interior de la cinta de espuma. Eventualmente, el papel de lija estará en contacto con la muestra de prueba.
   3. Coloque el baño de calentamiento (Figura 4A, B-3) en su posición. Llene el baño de calentamiento con PBS hasta el nivel de la cara inferior de las abrazaderas, para que aún no llegue al papel de lija.
   4. Encienda la fuente de alimentación del baño de calefacción y ajuste la temperatura a alrededor de 37 ° C.
   5. Monte la cámara de alta velocidad por encima del sistema de prueba de tracción (Figura 4A-4), por ejemplo, utilizando un soporte de laboratorio, y monte una lente con una distancia focal de 50 mm en la cámara a través de un anillo de extensión.
   6. Asegúrese de que las pinzas estén enfocadas y que el campo de visión sea lo suficientemente grande como para registrar la muestra durante todo el procedimiento de estiramiento (ancho de campo de visión: ± el ancho de la muestra; Longitud del campo de visión: ± 2 veces la longitud de la muestra).
   7. Monte el sistema de iluminación (Figura 4A-5) sobre el sistema de prueba de tracción, por ejemplo, utilizando un soporte de laboratorio. Encienda el sistema de iluminación y ajuste la intensidad y la ubicación de la luz para que no haya reflejos en la superficie PBS que se observen en la imagen de la cámara.
   8. Ajuste el tiempo de exposición y la ganancia de la cámara para obtener imágenes claras.
   9. Configure el software de adquisición de imágenes para capturar a 30 fotogramas/s con una resolución de 5,2 MP.
      NOTA: Esta alta velocidad de fotogramas es necesaria para realizar el análisis DIC posterior y estudiar el comportamiento de ruptura.
   10. Establezca la velocidad de desplazamiento de una de las abrazaderas de tal manera que la velocidad de deformación de ingeniería global durante las pruebas mecánicas sea similar a la velocidad de esfuerzo fisiológico in vivo del tejido
       (5%/s para tejido de placa²⁶).
2. Generación de patrón moteado
   NOTA: Este protocolo de patrón de moteado se basa en trabajos previos de Walsh et ^al.27.
   1. Seque la muestra frotándola ligeramente con papel de seda.
   2. Coloque el tinte de tejido negro en el cubo previsto del aerógrafo.
   3. Conecte el aerógrafo al compresor. Encienda el compresor del aerógrafo y ajuste la presión a 25 PSI.
   4. Intente crear un patrón de moteado óptimo en papel antes de rociar sobre el tejido. Rocíe varias veces hasta que se cumpla una proporción de blanco y negro de 50 :50²⁸ . Mueva la aguja del aerógrafo hacia adelante y hacia atrás para ajustar la rugosidad del patrón de moteado hasta que el tamaño de un moteado sea similar al tamaño de 3-5 píxeles de la cámara de alta velocidad²⁹.
      NOTA: El patrón de moteado se utilizará para dos propósitos diferentes. En primer lugar, el desplazamiento de estas manchas se mide comparando las imágenes de cámara de alta velocidad adquiridas durante las pruebas mecánicas (DIC, paso 4.2). En segundo lugar, este patrón de moteado se utiliza para identificar la ubicación de ruptura en la imagen del estado no deformado de la muestra (paso 4.3.1).
   5. Sujete el aerógrafo a unos 30 cm de distancia de la muestra problema y rocíe sobre la superficie luminal.
   6. Deje que el tinte se adhiera a la muestra durante 1 minuto a temperatura ambiente antes de sumergir la muestra en PBS.
3. Ensayo de tracción uniaxial
   1. Coloque la muestra en las abrazaderas del probador de tracción, con la dirección circunferencial de las muestras alineada con la dirección de estiramiento de tracción y el lado luminal de la muestra hacia arriba. Asegúrese de que la longitud del calibre inicial esté configurada de tal manera que la relación WL de las tiras sea <1.
   2. Apriete los tornillos de las empuñaduras aplicando un par de 20 cNm con un destornillador dinamométrico. Haga esto gradualmente aplicando un pequeño par a cada tornillo antes de aplicar el par final.
   3. Inspeccione visualmente si la muestra contiene desgarros que puedan influir en las pruebas.
   4. Introducir más PBS en el baño de calentamiento hasta que la muestra esté sumergida y esperar hasta que la temperatura del PBS haya alcanzado de nuevo los 37 °C.
   5. Adquiera una imagen de calibración con la cámara de alta velocidad, en la que se incluyen como referencia la muestra de prueba y una regla. Asegúrese de que la regla esté a la misma distancia del objetivo de la cámara que la superficie luminal de la muestra.
   6. Coloca la célula de carga y comienza a registrar las mediciones globales de fuerza y desplazamiento de la célula de carga y el actuador del probador de tracción.
   7. Enderezar la muestra aplicando un preestiramiento de 0,05 N para eliminar la holgura de la muestra. Realice 10 ciclos de preacondicionamiento de hasta un 10% de deformación basado en la medición de la longitud del medidor por el actuador después de la aplicación del preestirado.
   8. Inicie la prueba de tracción uniaxial hasta el fallo completo de la muestra, mientras graba un video de la deformación de la muestra con la cámara de alta velocidad. Después de la falla del tejido, deje de registrar las mediciones globales de fuerza y desplazamiento.
      NOTA: Algunos probadores de tracción comerciales pueden realizar los pasos 3.3.6-3.3.9 automáticamente. El protocolo actual describe los pasos manuales que deben seguirse si esta opción automática no está incluida en el probador de tracción que se está utilizando.
   9. Extraiga la muestra de ensayo del dispositivo de ensayo de tracción y deséchela adecuadamente.
   10. Cuando pruebe la siguiente muestra, reemplace el papel de lija y la cinta de espuma en las abrazaderas.

4. Análisis de datos

1. Análisis de la organización del colágeno
   1. Abra las pilas z obtenidas durante MPM con SHG en ImageJ y cree proyecciones de intensidad máxima (MIP) de cada pila z.
   2. Analice cada MIP con la herramienta FOA (Fiber Orientation Analysis)³⁰ basada en MATLAB de código abierto para medir el ángulo de orientación de las fibras de colágeno individuales presentes en las baldosas. Utilice los siguientes parámetros: Escalas: [3 4 5] o [2 4 6], dependiendo del diámetro del vaso, y Umbral de vaso: 0,999, 0,9995 o 0,9999, dependiendo de la intensidad de la señal SHG.
      NOTA: Puede encontrar más detalles sobre cómo utilizar esta herramienta en el manual³¹ del software.
   3. Utilice otra herramienta de código abierto basada en MATLAB, FibLab³², para ajustar una distribución gaussiana al histograma de distribución de ángulos.
      NOTA: Puede encontrar más detalles sobre cómo utilizar esta herramienta en el manual³² del software.
   4. De la gráfica de distribución gaussiana obtenida utilizando FibLab, extraer los siguientes parámetros estructurales del espacio de trabajo de MATLAB: el ángulo de fibra predominante (μ p), que es el modo de la distribución, la desviación estándar (σ _p) de la distribución del ángulo de la fibra y la fracción anisotrópica (P_ani = 1 − P_iso).
      NOTA: La fracción isotrópica es el área bajo la línea de base en la distribución gaussiana, mientras que la fracción anisotrópica contiene el área del pico en la parte superior de esa línea de base³³. Tanto σ_p como P_ani proporcionan información sobre la dispersión de la orientación de las fibras en la región de las baldosas.
   5. Para la inspección visual, trace μp usando líneas orientadas y σ_p y P_aniusando mapas de color.
2. Análisis de imágenes digitales y análisis de ruptura
   1. Realice una inspección visual de las imágenes de la cámara para identificar el fotograma en el que se produce el inicio de la ruptura. En este marco, identifique visualmente la ubicación de la ruptura.
   2. Realice una inspección visual de las imágenes de la cámara para identificar cualquier grieta o desgarro eventual en el lugar de la ruptura al inicio de las pruebas mecánicas. Si tal desgarro está presente, excluya la muestra del análisis.
   3. Realice el análisis DIC con el software de código abierto basado en MATLAB Ncorr (v1.2)³⁴. Siga los pasos del manual³⁵ de Ncorr.
      1. Utilice las imágenes de la cámara grabadas durante la prueba de tracción con la cámara de alta velocidad para DIC. Seleccione el último fotograma antes del estiramiento final hasta el fallo (después del preacondicionamiento) como imagen de referencia. Para las imágenes actuales, seleccione todas las imágenes desde el inicio del estiramiento final hasta el último fotograma antes del fotograma en el que se produjo el inicio de la ruptura.
      2. Seleccione la superficie de la muestra como región de interés (ROI). Excluya las áreas que están cerca (aproximadamente 1 mm) de las abrazaderas, ya que las tensiones en estas áreas estarán muy influenciadas por los agarres.
      3. Realice el análisis DIC utilizando los siguientes parámetros: Radio del subconjunto: 30 píxeles; Espaciado entre subconjuntos: tres píxeles; Corte de iteración: 50; Norma del punto de corte del vector diferencial: 10-5; Radio de deformación: 5; Propagación automática, paso #: 5.
      4. A partir del análisis DIC con Ncorr, obtener las distribuciones Green-Lagrange (o cepa euleriana) del ROI. Utilice estas distribuciones de deformación para calcular la deformación promedio de Green-Lagrange de toda la superficie de la muestra de placa en el último fotograma antes de la ruptura. Calcule la tensión de Green-Lagrange en el lugar de ruptura.
3. Correlación de datos estructurales y mecánicos en el lugar de ruptura
   1. Utilizando los puntos de referencia naturales de la muestra problema y las manchas aplicadas en la muestra problema, identifique la ubicación de la ruptura (identificada en el paso 4.2.1) en la imagen de referencia (paso 4.2.3.1).
   2. Utilizando los puntos de referencia naturales de la muestra de prueba, realice una superposición de la imagen de referencia y el escaneo de mosaico (paso 2.3) para identificar la ubicación de ruptura en el escaneo de mosaico. Identifique el mosaico MPM-SHG donde ocurrió la ruptura. Si la ruptura no está en una baldosa escaneada con el MPM-SHG, identifique la baldosa más cercana a la ubicación de la ruptura. Obtenga los parámetros estructurales encontrados en la baldosa donde se produjo la ruptura.

Resultados

Recolección de tejido y preparación de muestras de prueba
La colección de tejido produce muestras de tejido fibroso de placa que se pueden diseccionar en muestras de prueba individuales para imágenes estructurales y pruebas de tracción uniaxial. Idealmente, una muestra de tejido fibroso recolectada contiene áreas con poco o ningún desgarro (Figura 5A) y macrocalcificaciones (Figura 5B). Un exceso de estos desgarros y calcificaciones (Figura 5C) puede dar lugar a muestras de placa que no cumplen con el requisito de dimensión de la muestra mencionado anteriormente de WL 1.

Imágenes de microscopía multifotónica
Las imágenes de SHG y el posprocesamiento de imágenes proporcionan MIP de cada mosaico de imagen (Figura 6A, B). El postprocesamiento adicional mediante detección de fibra (Figura 6C) produce histogramas de orientación de fibra (Figura 6D) de los cuales se pueden extraer parámetros estructurales de colágeno (Figura 6E). Además, se pueden obtener mapas de color que muestran los parámetros estructurales locales de colágeno en toda la muestra de placa para el análisis visual (Figura 6F, G). Para la muestra de ensayo representativa de la figura 6, se encuentra una gran variación intramuestra en los parámetros estructurales del colágeno (media ± DE de μ p = -34° ± 32°; σ_p = 21° ± 4°; P_ani = 0,49 ± 0,14, si la dirección circunferencial se define como 0°). Esta variación intramuestra enfatiza la importancia de obtener parámetros estructurales locales en lugar de asumir homogeneidad.

Ensayos mecánicos
Comportamiento de ruptura
La cámara de alta velocidad proporciona imágenes del comportamiento de deformación y ruptura de las muestras de placa durante las pruebas mecánicas (Figura 7). A partir de estas imágenes, se puede identificar la ubicación del inicio de la ruptura y la trayectoria de propagación de la ruptura. Los resultados de identificación de ruptura son subóptimos si hay burbujas o reflejos en las imágenes de la cámara, o si la ruptura se propaga demasiado rápido para ser capturada por la velocidad de fotogramas elegida.

Patrones de cepas locales
El análisis de correlación de imágenes digitales en las grabaciones de cámara adquiridas durante la prueba de tracción uniaxial proporciona los mapas locales de deformación tisular, como los mapas de deformación de Green-Lagrange que se muestran en la Figura 8. Estos mapas muestran los tres componentes de deformación (ε_xx, ε_{xy y ε yy}) en el fotograma antes del inicio de la ruptura. A partir de estos mapas de cepas, se pueden extraer las cepas promedio en una región de interés y la cepa local en un lugar, como la ubicación de la ruptura.

Para la muestra representativa de la Figura 8, los datos de la cepa local muestran una gran variación intramuestra. Para la muestra de ensayo representativa de la figura 8, se encuentra una gran variación intramuestra en las cepas locales (los rangos de las cepas observadas son los siguientes: ε_xx = -0,30-0,17; ε_xy = -0,13-0,20; ε_yy = 0-0,40). Esto enfatiza la importancia de obtener datos locales en lugar de valores brutos y promedio obtenidos con el supuesto de homogeneidad tisular.

Correlación de la información del tejido mecánico y estructural
Los resultados mencionados anteriormente permiten la asociación de la deformación local y el comportamiento de ruptura del tejido a la arquitectura del colágeno. Una vez que se identifica la ubicación de la ruptura en las grabaciones de la cámara (Figura 9A), se puede asignar de nuevo a la imagen de la cámara de referencia (Figura 9B) y a la exploración de mosaico de microscopía (Figura 9C). Esto proporciona la baldosa MPM-SHG donde ocurrió la ruptura y los parámetros estructurales encontrados en esta baldosa (Figura 9D). Los parámetros estructurales encontrados en la baldosa donde ocurrió la ruptura en una muestra representativa, mostrados en la Figura 9, son_μ p = 28°, σ_p = 19° y P_ani = 0.6. El mismo procedimiento también se puede aplicar a las ubicaciones de tejido no roto. Es importante tener en cuenta que mapear la ubicación de ruptura en la imagen de referencia del marco de ruptura puede ser un desafío en caso de un patrón de moteado deficiente y puntos de referencia naturales poco claros. Además, si los puntos de referencia naturales del tejido no son lo suficientemente claros, el registro conjunto de la superposición de escaneo de mosaicos y las imágenes de la cámara de alta velocidad puede ser difícil.

Figura 1: Gráfico de flujo de trabajo del protocolo experimental presentado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Selección de mosaicos para imágenes SHG del escaneo de mosaicos . (A) Muestra de prueba fijada en silicio. (B) Escaneo en mosaico de la muestra de prueba obtenida por microscopía de campo claro. Los mosaicos seleccionados para la creación de imágenes SHG están marcados con cuadrados azules. (C) Proyección de intensidad máxima del MPM con SHG. Barra de escala = 140 μm (C). Abreviaturas: SHG = segunda generación armónica; MPM = microscopía multifotónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Muestra de placa colocada bajo el objetivo del microscopio multifotónico. La ubicación de la muestra de placa está asegurada por una placa de Petri llena de solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Probador de tracción uniaxial diseñado a medida con sus diferentes componentes indicados . (A) Visión general total del sistema. Tenga en cuenta que los insertos de papel de lija en las abrazaderas son visibles, ya que solo se adjuntan las abrazaderas inferiores. (B) Imagen ampliada de las abrazaderas del probador de tracción con la muestra de prueba lista para la prueba. Abreviaturas: PVC = cloruro de polivinilo; LED = diodo emisor de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Resultados de la recolección de tejido y la preparación de muestras a partir de muestras representativas . (A) Muestra de placa fresca e intacta, recuperada de pacientes que dieron su consentimiento y que se sometieron a cirugía de endarterectomía carotídea. (B) Reconstrucción 3D a partir de una tomografía computarizada μ. El tejido calcificado se muestra en azul claro y no calcificado en rojo. Se podría obtener una muestra óptima sin tejido calcificado del área entre las líneas azules. (C) Reconstrucción 3D de la tomografía computarizada μ que muestra una placa subóptima con un exceso de tejido calcificado. Barra de escala = 3 mm. Abreviatura: μCT = tomografía microcomputarizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Resultados de MPM-SHG de una muestra representativa. (A) Descripción general del escaneo de mosaicos; Los mosaicos seleccionados para la creación de imágenes se muestran en azul. (B) MIP de varios mosaicos. (C) Detección de fibra por la herramienta FOA de una baldosa seleccionada . (D) Histograma de orientación de fibra de una baldosa seleccionada. (E) Histograma de orientación de fibra + ajuste gaussiano, del cual se pueden extraer parámetros estructurales de colágeno de una baldosa seleccionada. (F) Representación de la μ p (línea negra de orientación) y σ_p (color de fondo) en toda la muestra de placa. (G) Representación de la μ_p (línea negra de orientación) y P_ani (color de fondo) en toda la muestra de placa. Barras de escala = 140 μm (B,C). Abreviaturas: MPM-SHG = microscopía multifotónica-segunda generación armónica; PDM = proyecciones de intensidad máxima; FOA = análisis de orientación de fibra; μ_p = ángulo de fibra predominante; P_ani = fracción anisotrópica; σ_p = desviación estándar de la distribución del ángulo de la fibra; P_iso = fracción isotrópica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Inicio y propagación de la ruptura en una muestra de tejido de placa durante el procedimiento de prueba de tracción.1) Estado preestirado, tejido intacto. 2) Iniciación de la ruptura: primer marco en el que se observa la ruptura. La ubicación de inicio de la ruptura está marcada con un cuadrado rojo. 3 ) y 4) Propagación de la ruptura. 5) Ruptura completa de la muestra de placa. Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Patrones de deformación de Green-Lagrange de una muestra representativa (ε_xx, ε_xy y_{ε yy}) en el marco antes de la ruptura, obtenidos con análisis DIC. Se da una desviación media y estándar sobre toda la placa, junto con la tensión en el lugar de la ruptura. Abreviaturas: DIC = correlación de imagen digital; ε_xx = deformación longitudinal; ε_xy = cizalladura; ε_yy = deformación a tracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Imagen superpuesta de la ubicación de ruptura (cuadrado rojo) en las imágenes. (A) Imagen de cámara de alta velocidad, donde se identifica la ruptura (marco de ruptura). (B) Imagen de cámara de alta velocidad, donde solo se aplica preestiramiento (sistema de referencia). (C) La imagen de escaneo de mosaico obtenida mediante microscopía. (D) Un mapa codificado por colores que muestra los parámetros estructurales locales de colágeno en varias baldosas. Se presentan los μ_p (línea negra de orientación) y P_ani (color de fondo) en toda la muestra de placa. Abreviaturas: μ_p = ángulo de fibra predominante; P_ani = fracción anisotrópica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El estudio actual se centró en el desarrollo de una tubería de imágenes mecanográficas para estudiar la correlación entre la orientación y dispersión local del colágeno, las propiedades mecánicas locales y el comportamiento de ruptura del tejido fibroso de la placa aterosclerótica. El protocolo descrito en este documento es innovador por varias razones. En primer lugar, esta es la primera vez que se aplica la correlación de imágenes digitales para medir la deformación local del tejido de placa fibrosa bajo carga mecánica. En segundo lugar, este protocolo proporciona la información necesaria para analizar la asociación entre el patrón de deformación local y la arquitectura local de colágeno del tejido fibroso de la placa. La importancia de la evaluación local se enfatiza tanto por los datos de cepa como por los datos de colágeno presentados en la sección de resultados, que muestran la naturaleza heterogénea del tejido. Por lo tanto, se recomienda el uso de técnicas que permitan la evaluación local, como las utilizadas en este protocolo, para futuros estudios de las propiedades de la placa fibrosa.

La preparación de muestras de prueba es uno de los pasos críticos de este protocolo. Las placas carotídeas son principalmente tejidos colágenos; sin embargo, pueden contener calcificaciones que se considera que afectan el comportamiento mecánico general de la placa^36,37. Como el estudio se centra en el componente de tejido fibroso de la placa, se evitan calcificaciones en las muestras de prueba mediante el uso de imágenes μCT³⁸. Si la μCT no está disponible, se pueden considerar otras técnicas de imagen como la resonancia magnética o la OCT³⁹ para detectar las regiones calcificadas en la placa. La obtención de muestras de prueba de tejido fibroso que estén libres de calcificaciones y sean de un tamaño lo suficientemente grande como para que sea viable para pruebas mecánicas puede ser una tarea difícil para las placas que están muy calcificadas o contienen calcificaciones dispersas. Otra tarea desafiante en el protocolo es generar un patrón de moteado óptimo para la correlación de imágenes digitales. El DIC óptimo requiere una relación blanco/negro de 50:50²⁸ y motea el tamaño de tres a cinco píxeles²⁹ para garantizar una calidad adecuada. El incumplimiento de estos requisitos puede dar lugar a mediciones de deformación local inexactas. Finalmente, mapear la ubicación de la ruptura con las imágenes de SHG puede ser un desafío si los puntos de referencia naturales de un tejido no están claros. Para tales muestras, la aplicación de varios marcadores fiduciales al tejido antes de la obtención de imágenes será útil.

La técnica MPM-SHG utilizada en el protocolo actual es superior a muchas otras técnicas de imagen de colágeno, ya que es una técnica de alta resolución y no destructiva con una profundidad de penetración relativamente grande. Sin embargo, la profundidad de penetración (<400 μm) de MPM-SHG plantea una limitación, ya que no permite obtener imágenes de todo el espesor de las muestras de prueba, que oscilaban entre 0,5 y 2 mm. En un estudio reciente con resonancia magnética con tensor de difusión (DT-MRI), hemos demostrado que la orientación predominante de la fibra en las partes más profundas del tejido de la placa puede ser diferente de la de las partes más superficiales y luminales del tejido¹⁴. Por lo tanto, se justifican estudios adicionales para investigar la arquitectura local del colágeno en las partes más profundas de las muestras gruesas de tejido fibroso y su relación con la mecánica tisular local. Para este propósito, se pueden utilizar imágenes polarizadas en el dominio de la frecuencia espacial (pSFDI). Se informó que esta técnica de imagen óptica recientemente desarrollada tiene el potencial de medir la orientación de la fibra a una profundidad de hasta 0,8 mm en las valvas de la válvula mitral¹². El pSFDI también ofrece una adquisición rápida, lo que también podría facilitar la visualización de toda el área de muestra en lugar de solo una selección de mosaicos, como es el caso en el protocolo actual. Otra limitación del protocolo actual es que solo se puede identificar la deformación superficial. En estudios futuros, la DIC⁴⁰ multivista asistida por espejo o la correlación digital de volumen (DVC)⁴¹ pueden incluirse en este protocolo para obtener información adicional sobre las deformaciones volumétricas del subsuelo.

El protocolo experimental actual se puede ampliar o modificar de varias maneras para obtener información adicional sobre la mecánica de ruptura de placa y su relación con la microestructura subyacente. En primer lugar, el protocolo actual incluye pruebas de tracción uniaxial en la dirección circunferencial. Se eligió este tipo de prueba mecánica ya que la placa experimenta predominantemente estiramiento por tracción en la dirección circunferencial in vivo. Para una caracterización mecánica más completa, este protocolo se puede ampliar aún más para incorporar pruebas de inflado, pruebas biaxiales o pruebas de tracción uniaxiales en la dirección longitudinal. En segundo lugar, el protocolo actual solo se centra en la obtención de cepas locales a través de CID. Sin embargo, se puede obtener una visión más completa del comportamiento mecánico de la placa al incluir también el análisis de estrés local en el protocolo, sin embargo, esto requiere la caracterización de la rigidez local. Aunque actualmente es un desafío, esto se puede lograr mediante técnicas computacionales como el método de elementos finitos inversos ^42,43 y el método de campos virtuales⁴⁴. Además de la adaptación experimental, también se pueden agregar algunos pasos adicionales de posprocesamiento al protocolo actual. En primer lugar, en lugar de identificar solo la ubicación de la ruptura, la ruta de propagación de grietas se puede identificar a través de las imágenes de cámara de alta velocidad obtenidas. Esta ruta de propagación se puede correlacionar con parámetros estructurales y mecánicos locales. En segundo lugar, la ubicación de inicio de la ruptura se identificó visualmente en el protocolo descrito. Un estudio previo sobre tejidos no biológicos ha utilizado discontinuidades en las mediciones de deformación DIC para detectar la ruptura⁴⁵. La aplicación de dicha detección automatizada de rupturas en los tejidos de la placa puede mejorar la precisión de la detección de rupturas. Finalmente, una gran ventaja de MPM-SHG en comparación con otras técnicas de imagen de colágeno es que visualiza fibras de colágeno individuales. Por lo tanto, los datos obtenidos a través de este protocolo también se pueden utilizar para investigar características locales adicionales de colágeno, como el contenido de colágeno.

Este protocolo se puede utilizar para proporcionar una mejor comprensión de las características locales del tejido fibroso de la placa, el componente que falla mecánicamente en la ruptura de la placa in vivo. Esta información es necesaria para establecer nuevos marcadores de imagen estructurales y funcionales que predicen la ruptura de placa en los pacientes. Estos nuevos marcadores son necesarios, ya que los biomarcadores de riesgo previamente sugeridos han demostrado tener un valor predictivo subóptimo para futuros eventos clínicos ^5,6. En el futuro, la OCT y la ps-OCT pueden identificar y cuantificar el tejido fibroso en el sistema arterial^46,47,48. Además, la cepa fue considerada un marcador sustituto para la composición local de la placa⁴⁹. Por lo tanto, las mediciones de deformación in vivo ⁴⁹ podrían ayudar potencialmente en la identificación de la estabilidad de la placa en los pacientes. Sin embargo, se debe tener cuidado con la traducción directa de los resultados obtenidos a la ruptura de placa in vivo. En primer lugar, el tejido de la placa fibrosa experimenta una carga más compleja in vivo que la carga de tracción unidireccional utilizada en este protocolo. En segundo lugar, las placas ateroscleróticas son estructuras multicomponentes; Las distribuciones in vivo de estrés y deformación en el tejido fibroso de la placa pueden verse afectadas por la presencia y localización de los otros componentes de la placa, como las calcificaciones³⁷.

Esta tubería de imágenes mecánicas también se puede utilizar para estudiar otros tejidos colágenos. Las pruebas mecánicas globales y las imágenes estructurales de colágeno ya se utilizan ampliamente para los tejidos biológicos. Sin embargo, la evaluación local de las propiedades previas y de falla, así como la arquitectura del colágeno, es fundamental para la caracterización mecánica precisa de tejidos fibrosos heterogéneos. Anticipamos que la estructura de este nuevo protocolo proporcionará más información sobre la interacción entre la microestructura y la mecánica de varios tejidos biológicos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mm extension ring	Thorlabs Inc.	CML10
15 mL tube	VWR	525-0150
20x APO water immersion objective	Leica	507701
3D Slicer software	N/A	Version 4.11
50 mL tubes	VWR	525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm	Conrad	4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating	Thorlabs
Black tissue dye	Polysciences inc	24113-2
Camera lens, focal length 50 mm	Thorlabs Inc.	MVL50M1
Camera stand	VWR	241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser	Coherent
Compressor + air hose	JUN-AIR, Conrad	B07GB9HC62, 4016138577198
Excel	Microsoft	Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm	Pattex
Heating bath	N/A		Custom made
High-speed camera + imaging software	Pixelink-Navitar Inc.	PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery)	N/A
Image J	National Institute of Health	N/A
LAS-AF	Leica	Version 2.3	Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II	Leica		Microscope used for SHG imaging
Lighting system	AMZ instruments	LED-60TB	Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB	MathWorks	Version R2021A
MATLAB-based FibLab software	Eindhoven University of Technology	N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool	Eindhoven University of Technology	N/A
MATLAB-based Ncorr software	Georgia Institute of Technology	Version 1.2
Needles	Emerald	BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter)	VWR	BRND452000
Parafilm	VWR	291-1214
Pasteur Pipettes	VWR	ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm	PerkinElmer	CLS149276
Ruler	Fine Science Tools	1800030
Sandpaper (P180)	Conrad	4.00932E+12
Side cutter	Conrad	4.25084E+12
Silicon elastomer base and curring agent (Sylgard 184)	VWR	634165S
Tensile tester + software + clamps	N/A		Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver	Garant, Hoffman group	659906