Метод изучения корреляции между локальной структурой коллагена и механическими свойствами фиброзной ткани атеросклеротических бляшек

Резюме

Мы разработали конвейер механовизуализации для изучения гетерогенных структурных и механических свойств атеросклеротических бляшек. Этот трубопровод обеспечивает корреляцию локального преобладающего угла и дисперсии ориентации коллагеновых волокон, поведения при разрыве и отпечатков пальцев деформации ткани фиброзной бляшки.

Аннотация

Разрыв атеросклеротических бляшек в коронарных и сонных артериях является основной причиной фатальных сердечно-сосудистых событий. Однако механика разрыва гетерогенной ткани бляшек с высоким содержанием коллагена и то, как это связано с волокнистой структурой ткани, пока неизвестны. Существующие конвейеры по изучению механики бляшек ограничиваются получением только грубых механических характеристик ткани бляшки, исходя из предположения о структурной однородности ткани. Однако ткань фиброзных бляшек структурно неоднородна, возможно, в основном из-за локальных изменений в архитектуре коллагеновых волокон.

Описанный здесь конвейер механовизуализации был разработан для изучения гетерогенных структурных и механических свойств бляшек. В этом конвейере локальная коллагеновая архитектура ткани характеризуется с помощью многофотонной микроскопии (MPM) с генерацией второй гармоники (SHG), а поведение ткани при разрушении характеризуется в условиях одноосного испытания на растяжение с использованием анализа цифровой корреляции изображений (DIC). Этот экспериментальный конвейер позволяет коррелировать локальный преобладающий угол и дисперсию ориентации коллагеновых волокон, поведение при разрыве и отпечатки пальцев деформации ткани фиброзной бляшки. Полученные знания являются ключом к лучшему пониманию, прогнозированию и предотвращению случаев разрыва атеросклеротических бляшек.

Введение

Ишемический инсульт, часто вызванный разрывом атеросклеротических бляшек в сонных артериях, является одной из ведущих причин смертности и заболеваемости во всем мире¹. Тем не менее, современные стратегии планирования хирургического лечения для предотвращения инсульта, связанного с атеросклерозом сонных артерий, не включают оценку риска разрыва бляшки². В основном это связано с тем, что ранее предложенные биомаркеры риска, такие как толщина крышки бляшки³ и размер липидного ядра⁴, как было показано, имеют неоптимальную прогностическую ценность для будущих клинических событий ^5,6. Лучшее понимание механики бляшек и механизмов разрыва необходимо для оптимизации оценки риска разрыва бляшек и выявления новых маркеров риска атеросклеротических бляшек.

Разрыв бляшки - это локальное механическое событие, при котором высоковолокнистая ткань бляшки не выдерживает механической нагрузки, оказываемой на нее артериальным давлением, и теряет свою структурную целостность⁷. Несмотря на это, механика разрыва бляшки и ее связь с лежащей в основе микроструктурой плохо изучены⁸. В нескольких экспериментальных исследованиях, которые характеризовали разрушение ткани бляшек 9,10,11,12,13, сообщалось о грубых механических свойствах разрыва (т.е. предельном напряжении при растяжении, деформации и прочности), полученных с предположением о структурной однородности ткани. Однако ткань фиброзной бляшки структурно неоднородна, возможно, главным образом из-за локальных изменений в архитектуре коллагеновых волокон¹⁴. Более того, связь между характеристиками механического разрушения ткани бляшек и архитектурой коллагена была исследована только в недавнем исследовании Johnston et al. Авторы показали разницу между бляшками в преобладающей ориентации волокон и сообщили о более высоких предельных напряжениях и более низких предельных деформациях для образцов волокнистых бляшек с преимущественно кольцевой ориентацией волокон¹⁵. Однако исследование также было ограничено грубыми механическими и структурными свойствами.

Чтобы пролить свет на важную информацию о локальной коллагеновой архитектуре и локальных механических свойствах ткани фиброзной бляшки, в текущем исследовании мы разработали конвейер механовизуализации. Этот конвейер ex vivo позволяет количественно определять направление и дисперсию местных коллагеновых волокон, а также деформацию локального разрыва. Конвейер включает в себя визуализацию MPM с помощью SHG для визуализации коллагеновых волокон в ткани бляшки, а также ДВС-синдром и одноосные испытания на растяжение для количественной оценки характеристик разрыва ткани.

Многофотонная микроскопия генерации второй гармоники (MPM-SHG) стала популярным методом изучения коллагена в биологических тканях¹⁶. Этот метод имеет много преимуществ по сравнению с другими методами визуализации коллагена, такими как гистология¹⁷, диффузионно-тензорная визуализация (DTI)14 и малоугловое рассеяние света (SALS)¹⁵. Во-первых, визуализация MPM-SHG является неразрушающей, что делает ее идеальной для сочетания с механическими испытаниями¹⁸. Во-вторых, сигнал SHG специфичен для коллагена, и поэтому окрашивание ткани не требуется. Из-за больших длин волн возбуждения (ближний инфракрасный) глубина проникновения больше, чем при других методах микроскопии¹⁶. Высокое разрешение (на уровне мкм), достигаемое с помощью визуализации SHG, также позволяет визуализировать отдельные волокна. Это открывает множество возможностей, таких как локальное количественное определение количества коллагеновых волокон, ориентация коллагеновых волокон и распределение¹⁹.

Цифровая корреляция изображений (ДВС) в сочетании с механическими испытаниями является широко используемым методом получения локальных механических свойств биологических тканей²⁰. При использовании ДВС смещение пятен, нанесенных на поверхность ткани, отслеживается путем сравнения изображений с высокоскоростной камеры, полученных в ходе механических испытаний²⁰. Этот метод постобработки изображений используется для оценки деформаций поверхности образца²⁰ в полном поле, а также может быть использован для изучения поведения ткани²¹ при разрыве.

протокол

Все методы, описанные в этой статье, были одобрены Комитетом по этическим исследованиям в Медицинском центре Эразма в Роттердаме; Информированное согласие было получено от пациентов перед сбором образцов бляшек. Схема рабочего процесса протокола приведена на рисунке 1.

1. Забор тканей, микрокомпьютерная томография (МКТ) и подготовка тестовых образцов

1. Сбор и хранение тканей
   1. Соберите свежие образцы атеросклеротических бляшек сонной артерии человека у согласных пациентов, перенесших операцию каротидной эндартерэктомии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы бляшек, полученные в результате этой операции, состоят из пораженного интимного слоя сонной артерии, включая накопление жира (липидный пул) и кальцификаты²².
   2. Удалите остатки крови с помощью физиологического раствора с фосфатным буфером (1x PBS) и высушите образец марлевой салфеткой.
   3. Поместите образец в пробирку объемом 15 мл с помощью пинцета. Заморозьте ткань, поместив пробирку в жидкий азот на 10 минут.
   4. После мгновенного замораживания храните образец в морозильной камере при температуре -80 °C до дня получения μCT-изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мгновенное замораживание сводит к минимуму образование кристаллов, что приводит к микроструктурным повреждениям в ткани. Предыдущее исследование ткани аорты свиньи показало, что мгновенное замораживание и хранение при -80 °C не оказали существенного влияния на механические свойства ткани²³.
2. МКТ-визуализация
   1. В день КТ-визуализации извлеките образец бляшки из пробирки объемом 15 мл. Если ткань прилипает к трубке, заполните трубку PBS комнатной температуры. Оставьте ткань в PBS до тех пор, пока образец не будет извлечен из пробирки.
   2. Тщательно высушите образец налета папиросной бумагой.
   3. Включите систему μCT, нажав зеленую кнопку. Нажмите кнопку разогрева в программе CT в нижней части экрана и подождите 15 минут.
   4. Вручную поместите рентгеновский фильтр Cu 0,06 мм + Al 0,5 мм в систему μCT.
   5. Выберите папку, в которой будут храниться изображения.
   6. Выберите параметры на левой панели. С помощью выпадающих списков выберите время сканирования 4 минуты, разрешение 172 мкм, напряжение 90 кВ, силу тока 88 мА, поле зрения 86 мм и поворот на 360°.
   7. Откройте дверцу устройства. Вытащите платформу вручную.
   8. Положите парапленку на платформу и поместите образец на платформу (к дальней крайности платформы).
   9. Вручную поместите платформу в устройство и закройте дверцу.
   10. Активируйте режим реального времени (значок глаза ). Переместите платформу со стрелками в устройстве, чтобы отцентрировать образец в поле зрения.
   11. Запустите визуализацию (значок внизу посередине). После завершения визуализации нажмите значок двери внизу (под кнопкой прерывания ).
   12. После сканирования μCT снова заморозьте образец зубного налета, как описано на шаге 1.1.3. Храните его при температуре -80 °C до дня многофотонной микроскопии и механических испытаний.
   13. Откройте полученные файлы DICOM изображения μCT в программном обеспечении 3D Slicer с открытым исходным кодом²⁴.
   14. Перейдите в редактор сегментов . Выберите создать новую сегментацию | том, который будет анализироваться как главный том.
   15. Нажмите « Добавить », чтобы добавить сегмент. Нажмите на его название и цвет , чтобы изменить эти параметры.
   16. Чтобы определить сегменты, нажмите на эффекты | порог в нижней части окна. Используйте этот пороговый инструмент для дифференциации кальцинированных (>450 HU) и некальцинированных (<450 HU) областей ткани. После того, как порог выбран, нажмите «Применить» в нижней части.
   17. Нажмите «Показать 3D» (справа от кнопки «Добавить»), чтобы визуализировать сегментацию в 3D-представлении. Если есть области сегментации, которые нежелательны, удалите их с помощью эффекта ножниц.
   18. Измените непрозрачность сегментов в модуле сегментации, кликнув по названию нужной сегментации.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, визуализация μCT и просмотр изображений μCT могут быть выполнены в тот же день, что и остальная часть протокола. В этом случае пропустите шаг 1.2.12. Однако учтите, что последующие шаги этого протокола также отнимают много времени и должны выполняться в тот же день. После некоторой практики и с описанными настройками и тканью визуализация μCT должна занять ~ 45 минут, просмотр изображений μCT ~ 15 минут, подготовка тестового образца одного тестового образца ~ 1 ч, микроскопия ~ 4 ч и одноосное испытание на растяжение ~ 2 ч.
3. Подготовка тестовых образцов
   1. В день визуализации коллагена и механических испытаний разморозьте зубной налет, погрузив его в PBS при комнатной температуре примерно на 10 минут.
   2. Откройте 3D-конструкцию таблички, созданную на шагах 1.2.13-1.2.18, в программном обеспечении 3D-слайсера.
   3. Используйте естественные ориентиры ткани бляшки, чтобы определить, какие части 3D-реконструкции соответствуют реальному образцу бляшки. Определите, какая область 3D-реконструкции не содержит кальцинатов и визуально определите эту область в реальном налете.
   4. Разрежьте бляшку вдоль продольной оси артерии с помощью хирургических ножниц и пинцета. Если порез уже присутствует после операции, начните с этого разреза для оптимального использования ткани. Если образец не имеет трубчатой формы и трудно определить продольное направление, исключите образец из испытаний.
   5. Вырежьте из образцов бляшки прямоугольные испытуемые образцы. Убедитесь, что исследуемые образцы как можно больше, избегая участков тканей, содержащих разрывы или кальцификаты. Будьте осторожны во время этой резки, так как небольшой разрыв или трещина на краю испытуемого образца может привести к распространению трещины из существующей трещины во время испытания на растяжение.
   6. Убедитесь, что испытуемые образцы имеют отношение ширины к длине (WL), равное <1 калибровочной длине после установки в тестер на растяжение. Если образцы удовлетворяют этому требованию, они пригодны для соответствующих испытаний на растяжение с точки зрения граничных условий²⁵.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон размеров образца может быть большим. Образцы, которые тестировали авторы, имели длину от 3,4 до 12,9 мм и ширину от 1,6 до 6,4 мм.

2. Многофотонная микроскопия

1. Препараты
   1. Перед днем визуализации коллагена и механических испытаний разделите 40 г основы из силиконового эластомера на две пробирки по 50 мл и добавьте 2 г отвердителя в каждую пробирку (соотношение 1:10) с помощью пипетки Пастера. Смешайте два компонента пипеткой.
   2. Центрифугируйте пробирки в течение 1 мин при 700 × г , чтобы удалить как можно больше пузырьков воздуха.
   3. Заполните чашку Петри (диаметр 10 см) тонким слоем (примерно 0,5-1 см) кремния и либо выдержите в духовке при 65 ° C в течение 3 часов, либо поместите при комнатной температуре на 48 часов.
   4. Возьмите тестовый образец бляшки и прикрепите оба его конца к силикону, приколов иглы в ткани (рис. 2А). Убедитесь, что люминальная сторона образца обращена вверх. Вставьте иглы в область образца, которая будет находиться в зажимах устройства для испытания на растяжение во время механического испытания.
   5. Наденьте защитные очки. Используйте боковой резак, чтобы укоротить иглы так, чтобы они торчали менее чем на несколько миллиметров над поверхностью образца, чтобы они не повредили объектив микроскопа. Наполните чашку Петри PBS до тех пор, пока образец не будет погружен в воду.
2. Настройка микроскопии
   1. Убедитесь, что на многофотонном микроскопе установлен правильный объектив. Используйте объектив, оптимизированный для передачи инфракрасного света, с увеличением в 20 раз.
   2. Запустите систему микроскопа. Откройте операционное программное обеспечение микроскопа.
   3. Когда вас попросят инициализировать таблицу визуализации, убедитесь, что рычаг конденсатора микроскопа отодвинут назад, а объектив находится в самом нижнем положении.
   4. Активируйте многофотонный лазер.
   5. Поместите чашку Петри с тестовым образцом под объектив, как показано на рисунке 3. Убедитесь, что объектив еще не размещен над образцом, так как настройки лазера все еще нуждаются в оптимизации. В противном случае возможная высокая мощность лазерного излучения может привести к повреждению тканей.
   6. Убедитесь, что цель слегка погружена в PBS. При необходимости используйте пипетку, чтобы добавить дополнительный PBS.
   7. Установите длину волны света на 880 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта длина волны выбрана потому, что фильтр излучения SHG в используемой двухфотонной системе имеет центральную длину волны около 440 нм. Для других микроскопов другая длина волны может быть более применимой.
3. Сканирование плиток и выбор мест получения изображений
   1. Выключите многофотонный лазер и активируйте режим светлого поля микроскопа. Затем включите режим сканирования в реальном времени .
   2. Расположите столик так, чтобы объектив располагался над образцом, и сфокусируйте поверхность образца. Выключите режим сканирования в реальном времени .
   3. На вкладке « Приобретение » на второй панели измените коэффициент масштабирования на 1 , сдвинув нужную полосу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот коэффициент зума вместе с коэффициентом увеличения объектива (20x) определяют размер захваченного изображения (739 мкм x 739 мкм).
   4. На вкладке сбора данных на второй панели измените скорость сканирования на 400 Гц, среднее значение строки на 1 и разрешение на 128 x 128 пикселей на изображение (размер пикселя ~5,8 мкм x 5,8 мкм) с помощью раскрывающихся списков.
   5. На вкладке « Сбор » на первой панели щелкните символ растрового узора и дождитесь появления панели сканирования плитки .
   6. Включите режим сканирования в реальном времени . Переместите объектив в угол образца с помощью ручек на интеллектуальной панели и щелкните символ положения метки на панели мозаичного сканирования. Повторите это для каждого угла образца. Если все сделано правильно, сетка со всеми выбранными плитками для изображения будет отображаться оранжевым цветом.
   7. Отключите функцию автоматического сшивания .
   8. Нажмите кнопку «Пуск » в правом нижнем углу экрана, чтобы создать мозаичное сканирование всей поверхности образца и получить обзор геометрии образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с описанными настройками, системой тканей и микроскопа получение сканирования всей поверхности образца занимает ~ 10 минут.
   9. После сканирования плитки наблюдайте за координатами x и y верхнего левого угла каждой плитки на панели сканирования плиток, которые автоматически отображаются программным обеспечением системы микроскопии. Запишите эти координаты в электронную таблицу.
   10. В программном обеспечении микроскопа на панели сканирования плиток обратите внимание на количество плиток в направлениях x и y в поле, называемом полем сканирования. Обратите внимание на размер развертки плитки в электронной таблице. Вычислите координаты других плиток, сложив/вычтя размер плитки (739 мкм).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эти координаты необходимы для определения точного местоположения плиток, подлежащих сканированию с помощью визуализации SHG. Если общее время визуализации не имеет значения, можно отобразить все плитки, не пропуская ни одной плитки.
   11. В отсканированном виде плитки выберите плитки для изображения с помощью изображения SHG. Для этого выбора избегайте плиток, которые будут находиться в зажимах, и оставляйте по одной плитке между каждой выбранной плиткой как в продольном, так и в окружном направлении, как показано на рисунке 2B.
4. Визуализация коллагена: визуализация ГСП
   1. Выключите свет в комнате и накройте столик микроскопа плотной тканью, чтобы свет из комнаты не попадал на детектор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизация света, попадающего на детекторы, уменьшит шум во время получения изображения.
   2. Включите многофотонный (МП) лазер .
   3. Выберите детектор без сканирования (NDD), оснащенный полосовым фильтром 430–450 нм.
   4. Определите расположение плиток для изображения, используя информацию, полученную на шаге 2.3.10. Заполните координаты в обозначенных полях и нажмите Enter, чтобы цель переместилась на правую плитку. Включите режим сканирования в реальном времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С другими микроскопами или более новыми версиями операционного программного обеспечения перемещение к местам в сканировании плитки может быть выполнено автоматически. В этом случае нет необходимости отмечать координаты x и y каждой плитки (этап 2.3.10) и заполнять координаты в операционном программном обеспечении (этап 2.4.4).
   5. Увеличьте мощность MP-лазера с помощью ползунка на верхней панели в разделе «Настройки траектории луча», чтобы получить максимально возможную мощность лазера без значительного обесцвечивания. Затем отрегулируйте усиление детектора для получения ярких изображений, но без насыщенных пикселей, с помощью ручки на смарт-панели или нажав на название детектора в разделе настройки траектории луча | дополнительные каналы. Типичные значения коэффициента усиления детектора составляют от 500 до 800 В.
   6. Используйте ручку z-позиционирования на интеллектуальной панели , чтобы отрегулировать плоскость фокусировки.
   7. Переместитесь в верхнюю часть образца и установите положение верхней части z-стека, щелкнув наконечник стрелки на панели z-stack (на вкладке «Приобретение» |^3-я панель).
   8. Затем сосредоточьтесь на образце до тех пор, пока сигнал ГСП не перестанет обнаруживаться - это конец стека. Снова нажмите на наконечник стрелки на панели z-stack , чтобы установить это положение. Когда закончите, выключите режим сканирования в реальном времени .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань может быть не совсем плоской. Следовательно, поверхность образца разных областей ткани может иметь несколько разные положения в z-направлении.
   9. На вкладке « Сбор » на второй панели установите скорость сканирования на уровне 400 Гц, установите среднее значение строки на 2 и разрешение на 512 x 512 пикселей на изображение (размер пикселя ~ 1,4 мкм x 1,4 мкм) с помощью раскрывающихся списков. Переключите кнопку двунаправленного сканирования X.
   10. Нажмите на размер z-шага на панели z-стека и заполните z-шаг размером 3 мкм в поле. Нажмите «Пуск» в правом нижнем углу экрана, чтобы создать z-стек. Когда закончите, обязательно сохраните координаты тайла в имени файла или присвойте каждому тайлу свой номер (как показано на рисунке 2B).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из описанных настроек, ткани и системы микроскопа, получение z-стека одной плитки занимает ~ 10-15 минут. Подготовительные этапы (этапы 2.4.4-2.4.10) включены в эту смету времени.

3. Механические испытания

1. Подготовка одноосной установки для испытания на растяжение
   1. Подготовьте установку для горизонтальных испытаний на растяжение (рис. 4) к использованию, следуя инструкциям к тестеру на растяжение (например, включите программное обеспечение, прикрепите зажимы, прикрепите тензодатчик).
   2. Чтобы свести к минимуму проскальзывание испытуемого образца, прикрепите двухстороннюю вспененную ленту (рис. 4А,Б-2) к внутренним граням зажимов тестера на растяжение и наждачную бумагу к внутренней стороне пенопластовой ленты. В конце концов, наждачная бумага будет контактировать с испытуемым образцом.
   3. Установите нагревательную ванну (рис. 4A, B-3) на место. Наполните нагревательную ванну ПБС до уровня нижней грани хомутов, чтобы она еще не доставала до наждачной бумаги.
   4. Включите источник питания нагревательной ванны и установите температуру около 37 °C.
   5. Установите высокоскоростную камеру над системой испытаний на растяжение (рис. 4A-4), например, с помощью лабораторного стенда, а объектив с фокусным расстоянием 50 мм установите на камеру через удлинительное кольцо.
   6. Убедитесь, что зажимы находятся в фокусе и что поле зрения достаточно велико для записи образца в течение всей процедуры растяжения (ширина поля зрения: ± ширины образца; Длина поля зрения: ± 2 раза больше длины образца).
   7. Установите систему освещения (рис. 4A-5) над системой испытаний на растяжение, например, с помощью лабораторного стенда. Включите систему освещения и отрегулируйте интенсивность и расположение света так, чтобы на изображении камеры не было отражений на поверхности PBS.
   8. Отрегулируйте время экспозиции и усиление камеры, чтобы получить четкие изображения.
   9. Настройте программное обеспечение для получения изображений на съемку со скоростью 30 кадров в секунду при разрешении 5,2 МП.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Такая высокая частота кадров необходима для выполнения последующего анализа DIC и изучения поведения при разрыве.
   10. Установите скорость смещения одного из зажимов таким образом, чтобы глобальная скорость инженерной деформации во время механических испытаний была аналогична физиологической скорости деформации ткани in vivo .
       (5%/с для ткани бляшек²⁶).
2. Генерация крапчатого рисунка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол спекл-паттерна основан на предыдущей работе Уолша и ^др.27.
   1. Высушите образец, слегка промокнув его папиросной бумагой.
   2. Нанесите черный тканевый краситель в предназначенное для этого ведро аэрографа.
   3. Подключите аэрограф к компрессору. Включите компрессор аэрографа и установите давление 25 фунтов на квадратный дюйм.
   4. Попробуйте создать оптимальный крапчатый рисунок на бумаге, прежде чем распылять на ткань. Распылите несколько раз, пока не будет достигнуто соотношение черно-белого 50 :50²⁸ . Перемещайте иглу аэрографа вперед и назад, чтобы отрегулировать шероховатость пятнистого рисунка до тех пор, пока размер крапинки не станет похож на размер 3-5 пикселей высокоскоростной камеры²⁹.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крапчатый узор будет использоваться для двух разных целей. Во-первых, смещение этих пятнышек измеряется путем сравнения изображений с высокоскоростной камеры, полученных во время механических испытаний (DIC, шаг 4.2). Во-вторых, этот спекл-паттерн используется для идентификации места разрыва на изображении недеформированного состояния образца (этап 4.3.1).
   5. Держите аэрограф на расстоянии примерно 30 см от испытуемого образца и распылите на поверхность просвета.
   6. Дайте красителю сцепиться с образцом в течение 1 минуты при комнатной температуре, прежде чем погрузить образец в PBS.
3. Одноосное испытание на растяжение
   1. Поместите образец в зажимы тестера на растяжение так, чтобы окружное направление образцов совпало с направлением растяжения при растяжении, а люминальная сторона образца была обращена вверх. Убедитесь, что начальная длина калибра установлена таким образом, чтобы коэффициент WL полос составлял <1.
   2. Затяните винты захватов, приложив крутящий момент 20 сНм с помощью динамометрической отвертки. Делайте это постепенно, прикладывая небольшой крутящий момент к каждому винту, прежде чем приложить окончательный крутящий момент.
   3. Визуально проверьте, нет ли в образце разрывов, которые могут повлиять на тесты.
   4. Введите больше PBS в нагревательную ванну до тех пор, пока образец не будет погружен в воду, и подождите, пока температура PBS снова не достигнет 37 °C.
   5. Получите калибровочное изображение с помощью высокоскоростной камеры, в которую в качестве эталона включены испытуемый образец и линейка. Убедитесь, что линейка находится на том же расстоянии от объектива камеры, что и люминальная поверхность образца.
   6. Установите тензодатчик и начните регистрировать глобальные измерения силы и смещения с тензодатчика и привода тестера на растяжение.
   7. Выпрямите образец, применив предварительное растяжение 0,05 Н, чтобы избавиться от провисания образца. Выполните 10 циклов предварительного кондиционирования до 10% деформации на основе измерения длины манометра приводом после применения предварительного растяжения.
   8. Начните одноосное испытание на растяжение до полного выхода образца из строя, записывая при этом видео деформации образца с помощью высокоскоростной камеры. После разрушения тканей прекратите регистрацию измерений глобальной силы и смещения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые коммерческие тестеры на растяжение могут выполнять шаги 3.3.6-3.3.9 автоматически. Текущий протокол описывает ручные шаги, которые необходимо предпринять, если эта автоматическая опция не включена в используемый тестер на растяжение.
   9. Извлеките испытуемый образец из устройства для испытания на растяжение и выбросьте его соответствующим образом.
   10. При испытании следующего образца замените наждачную бумагу и пенопластовую ленту на зажимах.

4. Анализ данных

1. Организационный анализ коллагена
   1. Откройте z-стеки, полученные во время MPM с помощью SHG в ImageJ, и создайте проекции максимальной интенсивности (MIP) каждого z-стека.
   2. Проанализируйте каждый MIP с помощью инструмента³⁰ FOA (Fiber Orientation Analysis) с открытым исходным кодом на основе MATLAB для измерения угла ориентации отдельных коллагеновых волокон, присутствующих в плитках. Используйте следующие параметры: Шкалы: [3 4 5] или [2 4 6], в зависимости от диаметра сосуда, и Порог сосудистости: 0,999, 0,9995 или 0,9999, в зависимости от интенсивности сигнала ГСП.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о том, как использовать этот инструмент, можно найти в руководстве по программному обеспечению³¹.
   3. Используйте другой инструмент с открытым исходным кодом на основе MATLAB, FibLab³², чтобы подогнать распределение Гаусса к гистограмме углового распределения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о том, как использовать этот инструмент, можно найти в руководстве по программному обеспечению³².
   4. Из графика распределения Гаусса, полученного с помощью FibLab, извлеките из рабочей области MATLAB следующие структурные параметры: преобладающий угол волокна (μ p), который является модой распределения, стандартное отклонение (σ_p) распределения угла волокна и анизотропную фракцию (P_ani = 1 − P_iso)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изотропная фракция представляет собой площадь под базовой линией в гауссовском распределении, в то время как анизотропная фракция содержит площадь пика поверх этой базовой линии³³. Как σ_p , так и P_ani предоставляют информацию о дисперсии ориентации волокон в области плитки.
   5. Для визуального осмотра нанесите μ p с помощью ориентированных линий и σ_p и P_aniс помощью цветовых карт.
2. Анализ цифровых изображений и анализ разрывов
   1. Проведите визуальный осмотр изображений с камеры, чтобы определить кадр, в котором происходит начало разрыва. На этом кадре визуально определите место разрыва.
   2. Выполните визуальный осмотр изображений с камеры, чтобы определить любую возможную трещину или разрыв в месте разрыва в начале механического испытания. Если такой разрыв присутствует, исключите образец из анализа.
   3. Выполняйте анализ DIC с помощью программного обеспечения Ncorr (v1.2)³⁴ с открытым исходным кодом на основе MATLAB. Следуйте инструкциям, описанным в руководстве^{Ncorr 35}.
      1. Используйте изображения с камеры, записанные во время испытания на растяжение с высокоскоростной камерой для DIC. Выберите последний кадр перед окончательным растяжением до отказа (после предварительной подготовки) в качестве эталонного изображения. Для текущих изображений выберите все изображения от начала окончательного растяжения до последнего кадра перед кадром, в котором произошло начало разрыва.
      2. Выберите поверхность образца в качестве области интереса (ROI). Исключите области, которые находятся рядом (примерно 1 мм) с зажимами, так как напряжение в этих областях будет сильно зависеть от захватов.
      3. Выполните анализ DIC, используя следующие параметры: Радиус подмножества: 30 пикселей; Интервал между подмножествами: три пикселя; Отсечка итерации: 50; Норма отсечки разностного вектора: 10-5; Радиус деформации: 5; Автоматическое распространение, шаг #: 5.
      4. Из анализа ДВС-синдрома с Ncorr получите распределения ROI по шкале Грина-Лагранжа (или штамма Эйлера). Используйте эти распределения деформаций, чтобы рассчитать среднюю деформацию Грина-Лагранжа всей поверхности образца бляшки на последнем кадре перед разрывом. Рассчитайте деформацию Грина-Лагранжа в месте разрыва.
3. Корреляция структурных и механических данных в месте разрыва
   1. Используя естественные ориентиры в испытуемом образце и нанесенные пятнышки на испытуемом образце, определите место разрыва (определенное на шаге 4.2.1) на эталонном изображении (этап 4.2.3.1).
   2. Используя естественные ориентиры в тестовом образце, сделайте наложение эталонного изображения и сканирования плитки (шаг 2.3), чтобы определить место разрыва на сканировании плитки. Определите плитку MPM-SHG, где произошел разрыв. Если разрыв находится не в плитке, отсканированной с помощью MPM-SHG, определите плитку, ближайшую к месту разрыва. Получите структурные параметры, найденные на плитке, где произошел разрыв.

Результаты

Сбор тканей и подготовка проб
При сборе тканей получаются образцы волокнистой ткани бляшек, которые могут быть рассечены на отдельные тестовые образцы для структурной визуализации и одноосных испытаний на растяжение. В идеале собранный образец фиброзной ткани содержит участки практически без разрывов (рис. 5А) и макрокальцификаций (рис. 5Б). Избыток этих разрывов и кальцификаций (рис. 5C) может привести к образованию образцов бляшек, которые не соответствуют ранее упомянутым требованиям к размеру образца WL 1.

Многофотонная микроскопия
Визуализация SHG и постобработка изображений обеспечивают MIP от каждой изображенной плитки (рис. 6A, B). Дальнейшая последующая обработка путем обнаружения волокон (рис. 6C) дает гистограммы ориентации волокон (рис. 6D), из которых могут быть извлечены структурные параметры коллагена (рис. 6E). Кроме того, для визуального анализа можно получить цветовые карты, показывающие локальные структурные параметры коллагена по всему образцу бляшки (рис. 6F, G). Для репрезентативного тестового образца на рисунке 6 обнаружено большое внутривыборочное изменение структурных параметров коллагена (среднее ± SD μ p = -34° ± 32°; σ_p = 21° ± 4°; P_ani = 0,49 ± 0,14, если окружное направление определено как 0°). Эта внутривыборочная вариация подчеркивает важность получения локальных структурных параметров вместо предположения об однородности.

Механические испытания
Поведение при разрыве
Высокоскоростная камера позволяет получать изображения деформации и разрыва образцов бляшек во время механических испытаний (рис. 7). По этим изображениям можно определить место инициации разрыва и путь распространения разрыва. Результаты идентификации разрыва неоптимальны, если на изображениях камеры присутствуют пузырьки или отражения, или если разрыв распространяется слишком быстро, чтобы его можно было захватить с выбранной частотой кадров.

Паттерны локальных деформаций
Корреляционный анализ цифровых изображений на записях камер, полученных во время одноосных испытаний на растяжение, позволяет получить карты локальной деформации тканей, такие как карты деформаций Грина-Лагранжа, показанные на рисунке 8. Эти карты отображают три компонента деформации (ε_xx, ε_xy и ε_yy) в кадре до начала разрыва. Из этих карт деформаций можно извлечь средние штаммы в интересующей области и локальную деформацию в точке, например, в месте разрыва.

Для репрезентативной выборки на рисунке 8 данные о местных штаммах показывают большую внутривыборочную вариацию. Для репрезентативной тестовой выборки на рисунке 8 обнаружена большая внутривыборочная вариация местных штаммов (диапазоны наблюдаемых штаммов следующие: ε_xx = -0,30-0,17; ε_xy = -0,13-0,20; ε_yy = 0-0,40). Это подчеркивает важность получения локальных данных, а не валовых, средних значений, полученных с предположением об однородности тканей.

Корреляция механической и структурной информации о тканях
Вышеупомянутые результаты позволяют связать локальную деформацию и разрыв ткани с архитектурой коллагена. После того, как место разрыва определено на записях камеры (рис. 9A), его можно сопоставить с эталонным изображением камеры (рис. 9B) и с микроскопическим сканированием плитки (рис. 9C). Это дает плитку MPM-SHG, где произошел разрыв, и структурные параметры, обнаруженные на этой плитке (рис. 9D). Структурные параметры, обнаруженные в плитке, где произошел разрыв в репрезентативной выборке, показанной на рисунке 9, составляют μ p = 28°, σ_p = 19° и P_ani = 0,6. Та же процедура может быть применена к неразорванным тканям. Важно отметить, что отображение места разрыва на эталонном изображении из кадра разрыва может быть сложной задачей в случае плохого пятнистого рисунка и нечетких природных ориентиров. Кроме того, если естественные ориентиры ткани недостаточно четкие, совместная регистрация наложения сканирования плитки и изображений с высокоскоростной камеры может быть затруднена.

Рисунок 1: Диаграмма рабочего процесса представленного экспериментального протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Выбор плиток для визуализации SHG на основе сканирования плитки . (A) Испытуемый образец, закрепленный в кремнии. (B) Сканирование плитки испытуемого образца, полученного с помощью светлопольной микроскопии. Плитки, выбранные для визуализации SHG, помечены синими квадратами. С) Проекция максимальной интенсивности МПМ с ГСП. Масштабная линейка = 140 мкм (C). Сокращения: SHG = генерация второй гармоники; MPM = многофотонная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Образец бляшки, помещенный под объектив многофотонного микроскопа. Местоположение образца бляшки закрепляется фосфатно-буферной чашкой Петри, заполненной физиологическим раствором. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Специально разработанный одноосный тестер на растяжение с указанием различных компонентов . А) Общий обзор системы. Обратите внимание, что вставки наждачной бумаги в зажимах видны, так как прикреплены только нижние зажимы. (B) Увеличенное изображение зажимов прибора для испытания на растяжение с испытательным образцом, готовым к испытанию. Сокращения: ПВХ = поливинилхлорид; Светодиод = светодиод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Результаты сбора тканей и пробоподготовки репрезентативных образцов . (A) Свежий и неповрежденный образец бляшки, полученный от согласившихся пациентов, перенесших операцию каротидной эндартерэктомии. (B) 3D-реконструкция на основе МККТ-сканирования. Кальцинированная ткань показана светло-голубым цветом и некальцинированной красной. Оптимальный образец без кальцинированной ткани может быть получен из области между синими линиями. (C) 3D-реконструкция на основе сканирования μCT, показывающая субоптимальную бляшку с избытком кальцинированной ткани. Масштабная линейка = 3 мм. Аббревиатура: μCT = микрокомпьютерная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Результаты MPM-SHG из репрезентативной выборки. (A) Обзор сканирования плиток; Выбранные плитки для визуализации отображаются синим цветом. (B) MIP из различных плиток. (C) Обнаружение волокон с помощью инструмента FOA от выбранной плитки . (D) Гистограмма ориентации волокон из выбранной плитки. (E) Гистограмма ориентации волокон + подгонка по Гауссу, из которой можно извлечь структурные параметры коллагена из выбранной плитки. (F) Представление μ p (черная линия ориентации) и σ_p (цвет фона) по всему образцу бляшки. (G) Представление μ_p (черная линия ориентации) и P_ani (цвет фона) по всему образцу бляшки. Масштабные линейки = 140 мкм (B,C). Сокращения: MPM-SHG = многофотонная микроскопия-генерация второй гармоники; MIP = проекции максимальной интенсивности; FOA = анализ ориентации волокна; μ_p = преобладающий угол волокна; P_ani = анизотропная фракция; σ_p = стандартное отклонение распределения угла волокна; P_iso = изотропная фракция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Инициация и распространение разрыва в образце ткани бляшки во время процедуры испытания на растяжение.1) Предварительно растянутое состояние, неповрежденная ткань. 2) Инициация разрыва - первая рамка, в которой наблюдается разрыв. Место начала разрыва отмечено красным квадратом. 3 ) и 4) Распространение разрыва. 5) Полный разрыв образца бляшки. Масштабные линейки = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Паттерны деформации Грина-Лагранжа репрезентативной выборки (ε_xx, ε_xy и ε_yy) на раме до разрыва, полученные с помощью ДВС-анализа. Приведены среднее и стандартное отклонение по всей бляшке, а также деформация в месте разрыва. Сокращения: DIC = корреляция цифровых изображений; ε_xx = продольная деформация; ε_xy = сдвиг; ε_yy = деформация при растяжении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Наложение изображения места разрыва (красный квадрат) на изображения. (A) Изображение с высокоскоростной камеры, на котором идентифицирован разрыв (кадр разрыва). (B) Высокоскоростное изображение с камеры, где применяется только предварительное растяжение (система отсчета). (C) Изображение сканирования плитки, полученное с помощью микроскопии. (D) Карта с цветовой кодировкой, показывающая локальные структурные параметры коллагена на различных плитках. Представлены μ_p (черная линия ориентации) и P_ani (цвет фона) по всему образцу бляшки. Сокращения: μ_p = преобладающий угол волокна; P_ani = анизотропная дробь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Текущее исследование было сосредоточено на разработке конвейера механовизуализации для изучения корреляции между локальной ориентацией и дисперсией коллагена, локальными механическими свойствами и поведением при разрыве ткани фиброзной атеросклеротической бляшки. Протокол, описанный в настоящем документе, является инновационным по нескольким причинам. Во-первых, это первый случай, когда цифровая корреляция изображений была применена для измерения локальной деформации ткани фиброзной бляшки при механической нагрузке. Во-вторых, этот протокол предоставляет необходимую информацию для анализа связи между паттерном локальной деформации и локальной коллагеновой архитектурой ткани фиброзной бляшки. Важность локальной оценки подчеркивается как данными о штаммах, так и данными о коллагене, представленными в разделе результатов, которые показывают гетерогенную природу ткани. Поэтому для будущих исследований свойств фиброзных бляшек рекомендуется использовать методы, позволяющие проводить локальную оценку, такие как те, которые используются в этом протоколе.

Подготовка тестовых образцов является одним из важнейших этапов этого протокола. Сонные бляшки в основном представляют собой коллагеновые ткани; однако они могут содержать кальцификаты, которые, как считается, влияют на общее механическое поведение бляшек^36,37. Поскольку исследование сосредоточено на компоненте фиброзной ткани бляшки, кальцификат в исследуемых образцах избегается с помощью μCT-визуализации³⁸. Если μCT недоступна, другие методы визуализации, такие как МРТ или OCT³⁹, могут быть рассмотрены для обнаружения кальцинированных областей в бляшке. Получение тестовых образцов волокнистой ткани, которые свободны от кальцификаций и имеют достаточно большой размер, пригодный для механических испытаний, может быть сложной задачей для бляшек, которые сильно кальцинированы или содержат дисперсные кальцификаты. Еще одной сложной задачей в протоколе является создание оптимальной спекл-картины для корреляции цифровых изображений. Для оптимального DIC требуется соотношение черно-белого 50:50²⁸ и пятнышки размером от трех до пяти пикселей²⁹ для обеспечения соответствующего качества. Несоблюдение этих требований может привести к неточным локальным измерениям деформации. Наконец, сопоставление места разрыва со снимками ГСП может быть сложной задачей, если естественные ориентиры ткани неясны. Для таких образцов будет полезно нанести несколько фидуциальных маркеров на ткань перед визуализацией.

Метод MPM-SHG, используемый в текущем протоколе, превосходит многие другие методы визуализации коллагена, поскольку это неразрушающий метод с высоким разрешением и относительно большой глубиной проникновения. Тем не менее, глубина проникновения (<400 мкм) MPM-SHG представляет собой ограничение, поскольку она не позволяет визуализировать всю толщину испытуемых образцов, которая варьировалась от 0,5 до 2 мм. В недавнем исследовании с диффузионно-тензорной магнитно-резонансной томографией (ДТ-МРТ) мы продемонстрировали, что преобладающая ориентация волокон в более глубоких частях ткани бляшки может отличаться от таковой в более поверхностных, просветных частях ткани¹⁴. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для изучения локальной архитектуры коллагена в более глубоких частях образцов ткани толстых фиброзных бляшек и ее связи с местной тканевой механикой. Для этой цели может быть использована поляризованная пространственная визуализация в частотной области (pSFDI). Сообщалось, что этот недавно разработанный метод оптической визуализации может измерять ориентацию волокон на глубине до 0,8 мм в створках митрального клапана¹². pSFDI также обеспечивает быстрый сбор данных, что также может облегчить визуализацию всей области выборки, а не только набора плиток, как в случае с текущим протоколом. Еще одно ограничение действующего протокола заключается в том, что можно идентифицировать только деформацию поверхности. В будущих исследованиях в этот протокол может быть включен зеркальный мультиракурсный DIC⁴⁰ или цифровая объемная корреляция (DVC)⁴¹ для получения дополнительной информации об объемных подповерхностных деформациях.

Текущий экспериментальный протокол может быть дополнительно расширен или изменен несколькими способами для получения дополнительной информации о механике разрыва бляшки и ее связи с лежащей в основе микроструктурой. Во-первых, текущий протокол включает одноосные испытания на растяжение в окружном направлении. Этот тип механических испытаний был выбран потому, что бляшка преимущественно испытывает растяжение при растяжении по окружности in vivo. Для более полной механической характеристики этот протокол может быть дополнительно расширен для включения испытаний на инфляцию, двухосных испытаний или одноосных испытаний на растяжение в продольном направлении. Во-вторых, текущий протокол ориентирован только на получение местных штаммов через ДВС-синдром. Тем не менее, более полное представление о механическом поведении зубного налета можно получить, также включив в протокол анализ локальных напряжений, но для этого требуется характеристика локальной жесткости. Несмотря на то, что в настоящее время это сложно, это может быть достигнуто с помощью вычислительных методов, таких как обратный метод конечных элементов ^42,43 и метод⁴⁴ виртуальных полей. Помимо экспериментальной адаптации, в текущий протокол также могут быть добавлены некоторые дополнительные этапы постобработки. Во-первых, вместо того, чтобы просто определять место разрыва, траектория распространения трещины может быть идентифицирована с помощью полученных изображений с высокоскоростной камеры. Этот путь распространения может быть коррелирован с локальными структурными и механическими параметрами. Во-вторых, место начала разрыва было визуально определено в описанном протоколе. В предыдущем исследовании небиологических тканей использовались разрывы в измерениях деформации ДВС-синдрома для обнаружения разрыва⁴⁵. Применение такого автоматического обнаружения разрывов на тканях бляшек может повысить точность обнаружения разрыва. Наконец, большим преимуществом MPM-SHG по сравнению с другими методами визуализации коллагена является то, что он визуализирует отдельные коллагеновые волокна. Таким образом, данные, полученные с помощью этого протокола, также могут быть использованы для исследования дополнительных локальных характеристик коллагена, таких как содержание коллагена.

Этот протокол может быть использован для лучшего понимания местных характеристик ткани фиброзной бляшки, компонента, который механически выходит из строя при разрыве бляшки in vivo. Эта информация необходима для создания новых структурных и функциональных маркеров визуализации, которые предсказывают разрыв бляшек у пациентов. Эти новые маркеры необходимы, поскольку было показано, что ранее предложенные биомаркеры риска имеют субоптимальную прогностическую ценность для будущих клинических событий ^5,6. В будущем ОКТ и пс-ОКТ могут идентифицировать и количественно определять фиброзную ткань в артериальной системе^46,47,48. Кроме того, штамм считался суррогатным маркером для локального состава бляшек⁴⁹. Таким образом, измерения^{деформации in vivo 49} потенциально могут помочь в выявлении стабильности бляшек у пациентов. Однако следует быть осторожным с прямым переводом полученных результатов на разрыв бляшки in vivo. Во-первых, ткань фиброзной бляшки испытывает более сложную нагрузку in vivo, чем однонаправленная растягивающая нагрузка, используемая в этом протоколе. Во-вторых, атеросклеротические бляшки представляют собой многокомпонентные структуры; На распределение стресса и деформации in vivo в ткани фиброзной бляшки может влиять присутствие и расположение других компонентов бляшки, таких как кальцификаты³⁷.

Этот конвейер механовизуализации также может быть использован для изучения других коллагеновых тканей. Глобальные механические испытания и структурная визуализация коллагена уже широко используются для биологических тканей. Тем не менее, локальная оценка свойств до разрушения и разрушения, а также архитектуры коллагена имеет решающее значение для точной механической характеристики гетерогенных волокнистых тканей. Мы ожидаем, что структура этого нового протокола обеспечит дальнейшее понимание взаимодействия между микроструктурой и механикой нескольких биологических тканей.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mm extension ring	Thorlabs Inc.	CML10
15 mL tube	VWR	525-0150
20x APO water immersion objective	Leica	507701
3D Slicer software	N/A	Version 4.11
50 mL tubes	VWR	525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm	Conrad	4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating	Thorlabs
Black tissue dye	Polysciences inc	24113-2
Camera lens, focal length 50 mm	Thorlabs Inc.	MVL50M1
Camera stand	VWR	241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser	Coherent
Compressor + air hose	JUN-AIR, Conrad	B07GB9HC62, 4016138577198
Excel	Microsoft	Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm	Pattex
Heating bath	N/A		Custom made
High-speed camera + imaging software	Pixelink-Navitar Inc.	PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery)	N/A
Image J	National Institute of Health	N/A
LAS-AF	Leica	Version 2.3	Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II	Leica		Microscope used for SHG imaging
Lighting system	AMZ instruments	LED-60TB	Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB	MathWorks	Version R2021A
MATLAB-based FibLab software	Eindhoven University of Technology	N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool	Eindhoven University of Technology	N/A
MATLAB-based Ncorr software	Georgia Institute of Technology	Version 1.2
Needles	Emerald	BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter)	VWR	BRND452000
Parafilm	VWR	291-1214
Pasteur Pipettes	VWR	ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm	PerkinElmer	CLS149276
Ruler	Fine Science Tools	1800030
Sandpaper (P180)	Conrad	4.00932E+12
Side cutter	Conrad	4.25084E+12
Silicon elastomer base and curring agent (Sylgard 184)	VWR	634165S
Tensile tester + software + clamps	N/A		Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver	Garant, Hoffman group	659906