Um método para estudar a correlação entre a estrutura local do colágeno e as propriedades mecânicas do tecido fibroso da placa aterosclerótica

Resumo

Desenvolvemos um pipeline de mecano-imagem para estudar as propriedades heterogêneas da placa aterosclerótica estrutural e mecânica. Essa tubulação permite a correlação do ângulo local predominante e da dispersão da orientação da fibra de colágeno, o comportamento de ruptura e as impressões digitais de deformação do tecido fibroso da placa.

Resumo

A ruptura de placas ateroscleróticas nas artérias coronárias e carótidas é a principal causa de eventos cardiovasculares fatais. No entanto, a mecânica de ruptura do tecido da placa heterogênea e altamente colágena, e como isso está relacionado à estrutura fibrosa do tecido, ainda não são conhecidos. As tubulações existentes para estudar a mecânica da placa limitam-se a obter apenas características mecânicas grosseiras do tecido da placa, com base na suposição de homogeneidade estrutural do tecido. No entanto, o tecido da placa fibrosa é estruturalmente heterogêneo, sem dúvida principalmente devido à variação local na arquitetura da fibra de colágeno.

O pipeline de mecano-imagem aqui descrito foi desenvolvido para estudar as propriedades heterogêneas da placa estrutural e mecânica. Neste pipeline, a arquitetura local de colágeno do tecido é caracterizada usando microscopia multifóton (MPM) com segunda geração harmônica (SHG), e o comportamento de falha do tecido é caracterizado sob condições de teste de tração uniaxial usando análise de correlação de imagem digital (DIC). Este pipeline experimental permite a correlação do ângulo local predominante e a dispersão da orientação da fibra de colágeno, o comportamento de ruptura e as impressões digitais de deformação do tecido fibroso da placa. O conhecimento obtido é fundamental para melhor compreender, prever e prevenir eventos de ruptura da placa aterosclerótica.

Introdução

O acidente vascular cerebral isquêmico, muitas vezes desencadeado pela ruptura da placa aterosclerótica nas artérias carótidas, é uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo¹. No entanto, as atuais estratégias de planejamento do tratamento cirúrgico para prevenir o AVC relacionado à aterosclerose carotídea não incluem avaliação do risco de ruptura da placa². Isso ocorre principalmente porque os biomarcadores de risco sugeridos anteriormente, como a espessura da tampa da placa³ e o tamanho do núcleo lipídico⁴, demonstraram ter valor preditivo subótimo para eventos clínicos futuros ^5,6. Uma melhor compreensão da mecânica da placa e dos mecanismos de ruptura é necessária para otimizar a avaliação do risco de ruptura da placa e identificar novos marcadores de risco das placas ateroscleróticas.

A ruptura da placa é um evento mecânico local em que o tecido da placa altamente fibrosa não suporta a carga mecânica exercida sobre ele pela pressão arterial e perde sua integridade estrutural⁷. Apesar disso, a mecânica do evento de ruptura da placa e sua ligação com a microestrutura subjacente são pouco compreendidas⁸. Os poucos estudos experimentais que caracterizaram a falência tecidual da placa 9,10,11,12,13 relataram propriedades de ruptura mecânica grosseira (isto é^, deformação e resistência à falha de tração final), derivadas com a suposição de homogeneidade estrutural do tecido. No entanto, o tecido da placa fibrosa é estruturalmente heterogêneo, possivelmente devido principalmente à variação local na arquitetura da fibra colágena¹⁴. Além disso, a ligação entre as características de falha mecânica do tecido da placa e a arquitetura do colágeno só foi investigada em um estudo recente de Johnston et al. Os autores mostraram uma diferença entre placas na orientação predominante da fibra e relataram maiores tensões finais e menores deformações finais para amostras de tampão de placa fibrosa com orientação predominantemente circunferencial da fibra¹⁵. No entanto, o estudo também se limitou às propriedades mecânicas e estruturais grosseiras.

Para lançar luz sobre as informações essenciais sobre a arquitetura local do colágeno e as propriedades mecânicas locais do tecido da placa fibrosa, no presente estudo, desenvolvemos um pipeline de imagem mecano. Esta tubulação ex vivo permite a quantificação da direção e dispersão da fibra de colágeno local, bem como da tensão de ruptura local. O pipeline envolve imagens MPM com SHG para visualizar fibras colágenas no tecido da placa, bem como testes de tração DIC e uniaxial para quantificar as características de ruptura do tecido.

A microscopia multifóton-segunda-geração harmônica (MPM-SHG) tornou-se uma técnica popular para estudar o colágeno em tecidos biológicos¹⁶. A técnica apresenta muitas vantagens em relação a outras técnicas de imagem de colágeno, como histologia¹⁷, imagem de tensor de difusão (DTI)14 e espalhamento de luz de pequeno ângulo (SALS)¹⁵. Em primeiro lugar, a imagem MPM-SHG não é destrutiva, o que a torna ideal para combinar com ensaios mecânicos¹⁸. Em segundo lugar, o sinal SHG é específico para o colágeno e, portanto, nenhuma coloração do tecido é necessária. Devido aos longos comprimentos de onda de excitação (infravermelho próximo), a profundidade de penetração é maior do que com outras técnicas de microscopia¹⁶. A alta resolução (nível μm) alcançada com a imagem SHG também permite a visualização de fibras individuais. Isso oferece muitas possibilidades, como quantificação local do número de fibras colágenas, orientação das fibras colágenas e distribuição¹⁹.

A correlação digital de imagens (CIVD) combinada com testes mecânicos é um método amplamente utilizado para a obtenção de propriedades mecânicas locais de tecidos biológicos²⁰. Com a CIVD, o deslocamento das manchas aplicadas na superfície do tecido é rastreado pela comparação de imagens de câmeras de alta velocidade adquiridas durante testes mecânicos²⁰. Este método de pós-processamento de imagem é utilizado para estimar as deformações superficiais de campo completo do corpo de prova²⁰ e também pode ser utilizado para estudar o comportamento de ruptura do tecido²¹.

Protocolo

Todos os métodos descritos neste artigo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Erasmus Medical Center, em Roterdã; o consentimento informado foi obtido dos pacientes antes da coleta do espécime em placa. Um gráfico de fluxo de trabalho do protocolo é fornecido na Figura 1.

1. Coleta de tecidos, tomografia microcomputadorizada (μCT) e preparação da amostra de teste

1. Coleta e armazenamento de tecidos
   1. Coletar amostras frescas de placa aterosclerótica da carótida humana de pacientes consensuais submetidos à cirurgia de endarterectomia carotídea.
      NOTA: As amostras de placas recuperadas desta cirurgia consistem na camada íntima doente da artéria carótida, incluindo o acúmulo de gordura (o pool lipídico) e calcificações²².
   2. Remova os restos de sangue usando solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) e seque a amostra com uma gaze.
   3. Coloque o provete num tubo de 15 ml utilizando uma pinça. Congele o tecido colocando o tubo em nitrogênio líquido por 10 min.
   4. Após o snap-freezing, conservar a amostra num congelador a -80 °C até ao dia da imagem μCT.
      NOTA: O congelamento instantâneo minimiza a formação de cristais, levando a danos microestruturais no tecido. Estudo prévio em tecido aórtico suíno mostrou que o snap-freezing e o armazenamento a -80 °C não tiveram influência significativa nas propriedades mecânicas do tecido²³.
2. Imagem μCT
   1. No dia da imagem μCT, retire a amostra de placa do tubo de 15 mL. Se o tecido aderir ao tubo, encha o tubo com PBS à temperatura ambiente. Deixe o tecido em PBS até que a amostra possa ser retirada do tubo.
   2. Seque bem a amostra da placa com papel de seda.
   3. Ligue o sistema μCT pressionando o botão verde . Pressione o aquecimento no software de TC na parte inferior da tela e aguarde 15 min.
   4. Coloque manualmente um filtro de raios-X de 0,06 mm + Al 0,5 mm no sistema μCT.
   5. Selecione a pasta na qual as imagens devem ser armazenadas.
   6. Escolha os parâmetros no painel esquerdo. Use as listas suspensas para selecionar um tempo de varredura de 4 min, uma resolução de 172 μm, uma tensão de 90 kV, uma amperagem de 88 mA, um campo de visão de 86 mm e uma rotação de 360°.
   7. Abra a porta do dispositivo. Puxe a plataforma manualmente.
   8. Coloque o parafilme na plataforma e coloque a amostra na plataforma (em direção ao extremo mais distante da plataforma).
   9. Coloque manualmente a plataforma no dispositivo e feche a porta.
   10. Ative o modo ao vivo (ícone de olho ). Mova a plataforma com as setas no dispositivo para centralizar a amostra no FOV.
   11. Inicie a criação de imagens (ícone na parte inferior e média). Quando a imagem estiver concluída, pressione o ícone da porta na parte inferior (sob o botão abortar ).
   12. Após a μtomografia computadorizada, congelar novamente a amostra da placa, conforme descrito na etapa 1.1.3. Armazene-o a -80 °C até o dia da microscopia multifóton e testes mecânicos.
   13. Abra os arquivos DICOM adquiridos da imagem μCT no software 3D Slicer de código aberto²⁴.
   14. Vá para Editor de segmentos. Selecione criar uma nova segmentação | o volume a ser analisado como um volume mestre.
   15. Clique em Adicionar para adicionar um segmento. Pressione seu nome e cor para alterar esses parâmetros.
   16. Para definir os segmentos, clique em efeitos | limite na parte inferior da janela. Use esta ferramenta de limiar para diferenciar entre regiões teciduais calcificadas (>450 UH) e não calcificadas (<450 UH). Depois que o limite for selecionado, pressione Aplicar na parte inferior.
   17. Pressione Mostrar 3D (à direita de Adicionar) para visualizar a segmentação na visualização 3D. Se houver áreas da segmentação que não são desejadas, remova-as com o efeito tesoura.
   18. Altere a opacidade dos segmentos no módulo de segmentação clicando no nome da segmentação desejada.
       NOTA: Se possível, a imagem μCT e a revisão das imagens μCT podem ser realizadas no mesmo dia que o resto do protocolo. Nesse caso, pule a etapa 1.2.12. No entanto, tenha em conta que os passos subsequentes deste protocolo também são demorados e devem ser realizados no mesmo dia. Após alguma prática, e com as configurações e tecidos descritos, a imagem μCT deve levar ~45 min, revisão das imagens μCT ~15 min, preparação da amostra de teste de uma única amostra de teste ~1 h, microscopia ~4 h e teste de tração uniaxial ~2 h.
3. Preparação da amostra de teste
   1. No dia da imagem de colágeno e testes mecânicos, descongele a placa por submersão em PBS à temperatura ambiente por aproximadamente 10 min.
   2. Abra a construção 3D da placa criada nas etapas 1.2.13-1.2.18 no software de fatiamento 3D.
   3. Use os marcos naturais do tecido da placa para identificar quais partes da reconstrução 3D correspondem à amostra real da placa. Identifique qual área da reconstrução 3D não contém calcificações e identifique visualmente essa área na placa real.
   4. Corte a placa aberta ao longo do eixo longitudinal da artéria usando tesoura cirúrgica e pinça. Se um corte já estiver presente a partir da cirurgia, comece a partir deste corte para o uso ideal do tecido. Se a amostra não tiver uma forma tubular e for difícil definir a direcção longitudinal, exclua a amostra do ensaio.
   5. Recortar amostras de ensaio retangulares dos corpos de prova em placa. Certifique-se de que as amostras de teste sejam as maiores possíveis, evitando regiões de tecido contendo lágrimas ou calcificações. Tenha cuidado durante este corte, pois uma pequena ruptura ou rachadura na borda da amostra de teste pode resultar na propagação de rachaduras a partir da rachadura existente durante o teste de tração.
   6. Certifique-se de que as amostras de teste tenham uma relação largura-comprimento (WL) de <1 no comprimento do medidor, uma vez montadas no testador de tração. Se as amostras satisfizerem este requisito, são adequadas para ensaios de tracção adequados em termos de condições-limite²⁵.
      NOTA: O intervalo nas dimensões da amostra pode ser grande. As amostras testadas pelos autores tinham um comprimento de calibre que variava entre 3,4 e 12,9 mm e uma largura que variava entre 1,6 e 6,4 mm.

2. Imagem por microscopia multifóton

1. Preparações
   1. Antes do dia de imagem de colágeno e testes mecânicos, divida 40 g de uma base de elastômero de silicone em dois tubos de 50 mL e adicione 2 g do agente de cura a cada tubo (proporção de 1:10) usando uma pipeta Pasteur. Misture os dois componentes com a pipeta.
   2. Centrifugar os tubos por 1 min a 700 × g para remover o maior número possível de bolhas de ar.
   3. Encher uma placa de Petri (10 cm de diâmetro) com uma camada fina (aproximadamente 0,5-1 cm) de silício e incubá-la no forno a 65 °C durante 3 h ou colocá-la à temperatura ambiente durante 48 h.
   4. Pegue uma amostra de teste de placa e fixe ambas as extremidades no silício prendendo agulhas no tecido (Figura 2A). Certifique-se de que o lado luminal da amostra está voltado para cima. Insira as agulhas na região da amostra que estarão nas braçadeiras do dispositivo de ensaio de tração durante o ensaio mecânico.
   5. Coloque óculos de segurança. Use um cortador lateral para encurtar as agulhas para que elas se destaquem a menos de alguns milímetros acima da superfície da amostra, para evitar que danifiquem a objetiva do microscópio. Encha a placa de Petri com PBS até que a amostra esteja submersa.
2. Configuração da microscopia
   1. Certifique-se de que uma objetiva adequada esteja montada no microscópio multifóton. Use um objetivo otimizado para transmitir luz infravermelha, com uma ampliação de 20x.
   2. Inicie o sistema de microscópio. Abra o software de operação do microscópio.
   3. Quando solicitado a inicializar a tabela de imagem, certifique-se de que o braço do condensador do microscópio seja empurrado para trás e que a objetiva esteja na posição mais baixa.
   4. Ative o laser multifóton.
   5. Coloque a placa de Petri com a amostra de teste embaixo da objetiva, como na Figura 3. Certifique-se de não colocar a objetiva acima da amostra ainda, pois as configurações do laser ainda precisam ser otimizadas. Caso contrário, a possível alta potência da luz laser pode levar a danos ao tecido.
   6. Certifique-se de que o objetivo esteja ligeiramente imerso no PBS. Use um pipet para adicionar PBS extra, se necessário.
   7. Defina o comprimento de onda da luz para 880 nm.
      NOTA: Este comprimento de onda é escolhido porque o filtro de emissão SHG no sistema de dois fótons usado tem um comprimento de onda central de aproximadamente 440 nm. Para outros microscópios, um comprimento de onda diferente pode ser mais aplicável.
3. Varredura de blocos e seleção de locais de imagem
   1. Desligue o laser multifóton e ative o modo de campo brilhante do microscópio. Em seguida, ative o modo de varredura ao vivo .
   2. Posicione o estágio de modo que o objetivo esteja localizado acima da amostra e coloque a superfície da amostra em foco. Desative o modo de varredura ao vivo .
   3. Na guia aquisição , no segundo painel, altere o fator de zoom para 1 deslizando a barra pretendida.
      NOTA: Este fator de zoom, juntamente com o fator de ampliação da objetiva (20x), determinam o tamanho da imagem capturada (739 μm x 739 μm).
   4. Na guia aquisição , no segundo painel, altere a velocidade de digitalização para 400 Hz, a média da linha para 1 e a resolução para 128 x 128 pixels por imagem (tamanho de pixel de ~5,8 μm x 5,8 μm) usando as listas suspensas.
   5. Na guia aquisição , no primeiro painel, clique no símbolo de padrão raster e aguarde até que um painel de verificação de bloco apareça.
   6. Ative o modo de varredura ao vivo . Mova o objetivo para um canto da amostra usando os botões no painel inteligente e clique no símbolo de posição da marca no painel de digitalização de blocos. Repita isso para cada canto da amostra. Se executada corretamente, uma grade com todos os blocos selecionados para geração de imagens aparecerá em laranja.
   7. Desative a função de costura automática.
   8. Clique em Iniciar no canto inferior direito da tela para criar uma varredura de bloco de toda a superfície da amostra para obter uma visão geral da geometria da amostra.
      NOTA: Com base nas configurações, tecido e sistema de microscópio descritos, a aquisição de uma varredura de telha de toda a superfície da amostra leva ~ 10 minutos.
   9. Após a varredura do bloco, observe as coordenadas x e y do canto superior esquerdo de cada bloco no painel de digitalização do bloco, mostradas automaticamente pelo software do sistema de microscopia. Observe essas coordenadas em uma planilha.
   10. No software do microscópio, no painel de varredura de telhas, observe o número de telhas nas direções x e y na caixa chamada campo de varredura. Observe o tamanho da verificação de bloco na planilha. Calcule as coordenadas dos outros blocos adicionando/subtraindo o tamanho do bloco (739 μm).
       NOTA: Essas coordenadas são necessárias para identificar a localização exata dos blocos a serem verificados com imagens SHG. Se o tempo total de geração de imagens não for uma preocupação, todos os blocos poderão ser fotografados sem ignorar nenhum bloco.
   11. Na varredura de blocos, selecione os blocos a serem visualizados com imagens SHG. Para essa seleção, evite telhas que estarão nas braçadeiras e deixe uma telha entre cada telha selecionada no sentido longitudinal e circunferencial, como mostra a Figura 2B.
4. Visualizando colágeno: imagem SHG
   1. Desligue as luzes da sala e cubra o estágio do microscópio com tecido blackout também para que nenhuma luz da sala atinja o detector.
      NOTA: Minimizar a luz que atinge os detectores diminuirá o ruído durante a aquisição da imagem.
   2. Ligue o laser multifóton (MP ).
   3. Selecione o detector de detecção não desmarcada (NDD) equipado com um filtro passa-banda de 430-450 nm.
   4. Identifique a localização dos blocos a serem fotografados usando as informações adquiridas na etapa 2.3.10. Preencha as coordenadas nas caixas designadas e clique em enter, para que o objetivo se mova para o bloco direito. Ative o modo de varredura ao vivo.
      NOTA: Com outros microscópios ou versões mais recentes do software operacional, a mudança para locais dentro da varredura de telhas pode ser feita automaticamente. Nesse caso, observar as coordenadas x e y de cada bloco (etapa 2.3.10) e preencher as coordenadas no software operacional (etapa 2.4.4) não é necessário.
   5. Aumente a potência do laser MP usando o controle deslizante no painel superior sob as configurações do caminho do feixe para obter a maior potência de laser possível sem branqueamento significativo. Em seguida, ajuste o ganho do detector para obter imagens brilhantes, mas sem pixels saturados, usando o botão no painel inteligente ou clicando no nome do detector nas configurações do caminho do feixe | canais adicionais. Os valores típicos para o ganho do detector estão entre 500 e 800 V.
   6. Use o botão de posição z no painel inteligente para ajustar o plano de foco.
   7. Mova para o topo da amostra e defina as posições da parte superior da pilha z clicando na ponta da seta no painel da pilha z (na guia aquisição |^3º painel).
   8. Em seguida, concentre-se na amostra até que o sinal SHG não seja mais detectado - este é o fim da pilha. Novamente, clique na ponta da seta no painel z-stack para definir essa posição. Quando terminar, desative o modo de varredura ao vivo .
      NOTA: O tecido pode não ser totalmente plano. Portanto, a superfície da amostra de diferentes regiões dentro do tecido pode ter posições ligeiramente diferentes na direção z.
   9. Na guia aquisição , no segundo painel, mantenha a velocidade de digitalização em 400 Hz, defina a média da linha como 2 e a resolução para 512 x 512 pixels por imagem (tamanho de pixel de ~1,4 μm x 1,4 μm) usando as listas suspensas. Ative o botão de varredura X bidirecional.
   10. Clique em z-step size no painel z-stack e preencha um z-step size de 3 μm na caixa. Clique em Iniciar no canto inferior direito da tela para criar uma pilha z. Quando terminar, salve as coordenadas do bloco no nome do arquivo ou dê a cada bloco seu próprio número (como na Figura 2B).
       NOTA: Com base nas configurações, tecido e sistema de microscópio descritos, a aquisição de uma pilha z de uma única telha leva ~ 10-15 min. As etapas de preparação (etapas 2.4.4-2.4.10) estão incluídas nessa estimativa de tempo.

3. Ensaios mecânicos

1. Preparação da configuração de ensaio de tração uniaxial
   1. Prepare a configuração de teste de tração horizontal (Figura 4) para uso, seguindo as instruções do testador de tração (por exemplo, ligue o software, conecte braçadeiras, conecte a célula de carga).
   2. Para minimizar o deslizamento da amostra de ensaio, fixe a fita de espuma frente e verso (Figura 4A,B-2) nas faces internas das braçadeiras do testador de tracção e a lixa ao lado interior da fita de espuma. Eventualmente, a lixa estará em contato com a amostra de teste.
   3. Colocar o banho de aquecimento (Figura 4A,B-3) na posição. Encha o banho de aquecimento com PBS até o nível da face inferior dos grampos, para que ele não atinja a lixa ainda.
   4. Ligue a fonte de alimentação do banho de aquecimento e ajuste a temperatura para cerca de 37 °C.
   5. Monte a câmera de alta velocidade acima do sistema de teste de tração (Figura 4A-4), por exemplo, usando um suporte de laboratório, e monte uma lente com uma distância focal de 50 mm na câmera através de um anel de extensão.
   6. Certifique-se de que as braçadeiras estão em foco e que o campo de visão é grande o suficiente para registrar a amostra durante todo o procedimento de alongamento (largura FOV: ± largura da amostra; Comprimento FOV: ± 2x o comprimento da amostra).
   7. Monte o sistema de iluminação (Figura 4A-5) acima do sistema de ensaio de tração, por exemplo, utilizando um suporte de laboratório. Ligue o sistema de iluminação e ajuste a intensidade e a localização da luz para que não haja reflexos na superfície PBS a serem observados na imagem da câmera.
   8. Ajuste o tempo de exposição e o ganho da câmera para obter imagens claras.
   9. Defina o software de aquisição de imagem para capturar a 30 quadros / s a uma resolução de 5,2 MP.
      NOTA: Essa alta taxa de quadros é necessária para executar a análise DIC subsequente e estudar o comportamento de ruptura.
   10. Defina a velocidade de deslocamento de um dos grampos de tal forma que a taxa global de deformação de engenharia durante o teste mecânico seja semelhante à taxa de esforço fisiológico in vivo do tecido
       (5%/s para o tecido da placa²⁶).
2. Geração de padrão de manchas
   NOTA: Este protocolo de padrão speckle é baseado em trabalhos anteriores de Walsh et ^al.27.
   1. Seque a amostra esfregando-a levemente com papel de seda.
   2. Coloque o corante de tecido preto no balde pretendido do aerógrafo.
   3. Conecte o aerógrafo ao compressor. Ligue o compressor do aerógrafo e ajuste a pressão para 25 PSI.
   4. Tente criar um padrão de salpicos ideal no papel antes de pulverizar no tecido. Pulverize algumas vezes até que uma relação preto/branco de 50 :50²⁸ seja atendida. Mova a agulha do aerógrafo para frente e para trás para ajustar a rugosidade do padrão de manchas até que o tamanho de uma mancha seja semelhante ao tamanho de 3-5 pixels da câmera de alta velocidade²⁹.
      NOTA: O padrão speckle será usado para duas finalidades diferentes. Primeiro, o deslocamento dessas manchas é medido comparando imagens de câmeras de alta velocidade adquiridas durante testes mecânicos (DIC, etapa 4.2). Em segundo lugar, esse padrão de manchas é usado para identificar o local de ruptura na imagem do estado não deformado da amostra (etapa 4.3.1).
   5. Segure o aerógrafo a aproximadamente 30 cm de distância da amostra de ensaio e pulverize na superfície luminal.
   6. Deixar o corante ligar-se à amostra durante 1 min à temperatura ambiente antes de submergir a amostra em PBS.
3. Ensaio de tração uniaxial
   1. Colocar a amostra nas braçadeiras do testador de tracção, com a direcção circunferencial das amostras alinhada com a direcção de alongamento da tracção e o lado luminal da amostra virado para cima. Certifique-se de que o comprimento do medidor inicial esteja definido de tal forma que a relação WL das tiras seja <1.
   2. Aperte os parafusos das alças aplicando um torque de 20 cNm usando uma chave de fenda de torque. Faça isso gradualmente, aplicando um pequeno torque em cada parafuso antes de aplicar o torque final.
   3. Inspecione visualmente se a amostra contém algum rasgo que possa influenciar os testes.
   4. Introduzir mais PBS no banho de aquecimento até que a amostra esteja submersa e esperar até que a temperatura do PBS atinja novamente os 37 °C.
   5. Adquira uma imagem de calibração com a câmera de alta velocidade, na qual a amostra de teste e uma régua são incluídas como referência. Verifique se a régua está na mesma distância da objetiva da câmera que a superfície luminal da amostra.
   6. Reboque da célula de carga e comece a registrar as medições globais de força e deslocamento da célula de carga e do atuador do testador de tração.
   7. Endireitar a amostra aplicando um pré-alongamento de 0,05 N para se livrar da folga na amostra. Realizar 10 ciclos de pré-condicionamento até 10% de deformação com base na medição do comprimento do medidor pelo atuador após a aplicação do pré-alongamento.
   8. Inicie o ensaio de tração uniaxial até a falha completa da amostra, enquanto grava um vídeo da deformação da amostra com a câmera de alta velocidade. Após a falha tecidual, pare de registrar as medições globais de força e deslocamento.
      NOTA: Alguns testadores de tração comerciais podem executar as etapas 3.3.6-3.3.9 automaticamente. O protocolo atual descreve as etapas manuais a serem tomadas se essa opção automática não estiver incluída no testador de tração que está sendo usado.
   9. Remova a amostra de ensaio do dispositivo de ensaio de tracção e elimine-a adequadamente.
   10. Ao testar a próxima amostra, substitua a lixa e a fita de espuma nas braçadeiras.

4. Análise dos dados

1. Análise da organização do colágeno
   1. Abra as z-stacks obtidas durante o MPM com SHG no ImageJ e crie projeções de intensidade máxima (MIPs) de cada z-stack.
   2. Analise cada MIP com a ferramenta FOA (Fiber Orientation Analysis)³⁰ baseada em MATLAB de código aberto para medir o ângulo de orientação das fibras de colágeno individuais presentes nas telhas. Use os seguintes parâmetros: Escalas: [3 4 5] ou [2 4 6], dependendo do diâmetro do vaso, e Limiar de vaso: 0,999, 0,9995 ou 0,9999, dependendo da intensidade do sinal SHG.
      NOTA: Mais detalhes sobre como usar esta ferramenta podem ser encontrados no manual do software³¹.
   3. Use outra ferramenta baseada em MATLAB de código aberto, o FibLab³², para ajustar uma distribuição gaussiana ao histograma de distribuição de ângulo.
      NOTA: Mais detalhes sobre como usar esta ferramenta podem ser encontrados no manual do software³².
   4. Do gráfico de distribuição gaussiano obtido usando FibLab, extraia os seguintes parâmetros estruturais do espaço de trabalho do MATLAB: o ângulo predominante da fibra (μ p), que é o modo da distribuição, o desvio padrão (σ_p) da distribuição do ângulo da fibra e a fração anisotrópica (P_ani = 1 − P_iso).
      NOTA: A fração isotrópica é a área sob a linha de base na distribuição gaussiana, enquanto a fração anisotrópica contém a área do pico em cima dessa linha de base³³. Tanto σ_p quanto P_ani fornecem informações sobre a dispersão da orientação das fibras na região da telha.
   5. Para inspeção visual, plote μp usando linhas orientadas e σ_p e P_aniusando mapas de cores.
2. Análise de imagem digital e análise de ruptura
   1. Execute a inspeção visual nas imagens da câmera para identificar o quadro no qual ocorre o início da ruptura. Neste quadro, identifique visualmente o local de ruptura.
   2. Realize inspeção visual nas imagens da câmera para identificar qualquer eventual rachadura ou ruptura no local da ruptura no início do teste mecânico. Se tal ruptura estiver presente, exclua a amostra da análise.
   3. Execute a análise DIC com o software de código aberto baseado em MATLAB Ncorr (v1.2)³⁴. Siga os passos no manual Ncorr³⁵.
      1. Use as imagens da câmera gravadas durante o teste de tração com a câmera de alta velocidade para DIC. Selecione o último quadro antes do alongamento final até a falha (após o pré-condicionamento) como a imagem de referência. Para as imagens atuais, selecione todas as imagens desde o início do alongamento final até o último quadro antes do quadro no qual ocorreu o início da ruptura.
      2. Selecione a superfície da amostra como a região de interesse (ROI). Exclua as áreas que estão próximas (aproximadamente 1 mm) dos grampos, pois as tensões nessas áreas serão altamente influenciadas pelas alças.
      3. Execute a análise DIC usando os seguintes parâmetros: Raio do subconjunto: 30 pixels; Espaçamento entre subconjuntos: três pixels; Ponto de corte de iteração: 50; Norma de corte do vetor de diferença: 10-5; Raio de deformação: 5; Propagação automática, passo #: 5.
      4. A partir da análise DIC com Ncorr, obtenha-se as distribuições Green-Lagrange (ou cepa euleriana) do ROI. Use essas distribuições de deformação para calcular a deformação média de Green-Lagrange de toda a superfície da amostra de placa no último quadro antes da ruptura. Calcule a deformação Green-Lagrange no local de ruptura.
3. Correlacionando dados estruturais e mecânicos no local da ruptura
   1. Usando os marcos naturais na amostra de teste e as manchas aplicadas na amostra de teste, identifique o local de ruptura (identificado na etapa 4.2.1) na imagem de referência (etapa 4.2.3.1).
   2. Usando os pontos de referência naturais na amostra de teste, faça uma sobreposição da imagem de referência e da varredura do bloco (etapa 2.3) para identificar o local de ruptura na varredura do bloco. Identifique a telha MPM-SHG onde a ruptura aconteceu. Se a ruptura não estiver em uma telha digitalizada com o MPM-SHG, identifique a telha mais próxima do local de ruptura. Obtenha os parâmetros estruturais encontrados na telha onde ocorreu a ruptura.

Resultados

Coleta de tecidos e preparação da amostra de teste
A coleção de tecidos produz amostras de tecido fibroso em placa que podem ser dissecadas em amostras de teste individuais para imagens estruturais e testes de tração uniaxial. Idealmente, uma amostra de tecido fibroso coletada contém áreas com pouca ou nenhuma ruptura (Figura 5A) e macrocalcificações (Figura 5B). Um excesso dessas lágrimas e calcificações (Figura 5C) pode levar a amostras de placas que não atendem ao requisito de dimensão amostral 1 mencionado anteriormente.

Imagem por microscopia multifóton
A imagem SHG e o pós-processamento de imagens fornecem MIPs de cada bloco com imagem (Figura 6A,B). O pós-processamento adicional por detecção de fibras (Figura 6C) produz histogramas de orientação de fibra (Figura 6D) dos quais os parâmetros estruturais do colágeno podem ser extraídos (Figura 6E). Além disso, mapas coloridos mostrando os parâmetros estruturais locais de colágeno em toda a amostra de placa podem ser obtidos para análise visual (Figura 6F,G). Para a amostra de teste representativa na Figura 6, verifica-se uma grande variação intraamostra nos parâmetros estruturais de colágeno (média ± DP de μ p = -34° ± 32°; σ_p = 21° ± 4°; P_ani = 0,49 ± 0,14, se a direção circunferencial for definida como 0°). Essa variação intraamostra enfatiza a importância da obtenção de parâmetros estruturais locais em vez de assumir homogeneidade.

Ensaios mecânicos
Comportamento de ruptura
A câmera de alta velocidade fornece imagens do comportamento de deformação e ruptura das amostras de placa durante os ensaios mecânicos (Figura 7). A partir dessas imagens, o local de início da ruptura e o caminho de propagação da ruptura podem ser identificados. Os resultados de identificação de ruptura são subótimos se bolhas ou reflexos estiverem presentes nas imagens da câmera ou se a ruptura se propagar muito rápido para ser capturada pela taxa de quadros escolhida.

Padrões de deformação locais
A análise de correlação de imagem digital nas gravações da câmera adquiridas durante o teste de tração uniaxial fornece os mapas de deformação tecidual local, como os mapas de deformação de Green-Lagrange mostrados na Figura 8. Esses mapas exibem os três componentes de deformação (ε_xx, ε_xy e ε_yy) no quadro antes do início da ruptura. A partir desses mapas de deformação, as deformações médias em uma região de interesse e a tensão local em um ponto, como o local de ruptura, podem ser extraídas.

Para a amostra representativa da Figura 8, os dados de deformação local mostram uma grande variação intraamostral. Para a amostra de teste representativa na Figura 8, encontra-se uma grande variação intraamostra nas cepas locais (os intervalos das cepas observadas são os seguintes: ε_xx = -0,30-0,17; ε_xy = -0,13-0,20; ε_yy = 0-0,40). Isso enfatiza a importância da obtenção de dados locais em vez de valores médios brutos obtidos com a suposição de homogeneidade tecidual.

Correlacionando informações mecânicas e estruturais de tecidos
Os resultados acima mencionados permitem associar o comportamento local de deformação e ruptura do tecido à arquitetura do colágeno. Uma vez que o local de ruptura é identificado nas gravações da câmera (Figura 9A), ele pode ser mapeado de volta para a imagem da câmera de referência (Figura 9B) e para a varredura do bloco de microscopia (Figura 9C). Isso fornece a telha MPM-SHG onde ocorreu a ruptura e os parâmetros estruturais encontrados nesta telha (Figura 9D). Os parâmetros estruturais encontrados na telha onde ocorreu ruptura em uma amostra representativa, mostrados na Figura 9, são μ p = 28°, σ_p = 19° e P_ani = 0,6. O mesmo procedimento também pode ser aplicado aos locais de tecido não rompidos. É importante notar que mapear o local de ruptura na imagem de referência a partir do quadro de ruptura pode ser um desafio no caso de um padrão de salpicos deficiente e marcos naturais pouco claros. Além disso, se os marcos naturais do tecido não forem claros o suficiente, o co-registro da sobreposição de varredura da telha e as imagens da câmera de alta velocidade podem ser difíceis.

Figura 1: Gráfico de fluxo de trabalho do protocolo experimental apresentado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Seleção de telhas para imagem SHG a partir da varredura de telhas. (A) Amostra de teste fixada em silício. (B) Varredura em azulejo da amostra de ensaio obtida por microscopia de campo brilhante. Os blocos selecionados para a geração de imagens SHG são marcados por quadrados azuis. (C) Projeção de intensidade máxima do MPM com SHG. Barra de escala = 140 μm (C). Abreviaturas: SHG = segunda geração harmônica; MPM = microscopia multifóton. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Amostra de placa colocada sob a objetiva do microscópio multifóton. A localização da amostra da placa é assegurada por uma placa de Petri cheia de solução salina tamponada com fosfato. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Testador de tração uniaxial personalizado com seus diferentes componentes indicados . (A) Visão geral total do sistema. Observe que as inserções de lixa nas braçadeiras são visíveis, pois apenas as braçadeiras inferiores estão presas. (B) Imagem ampliada das braçadeiras do testador de tração com a amostra de ensaio pronta para o ensaio. Abreviaturas: PVC = cloreto de polivinilo; LED = diodo emissor de luz. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A coleta de tecidos e o preparo da amostra resultam de amostras representativas . (A) Amostra de placa fresca e intacta, recuperada de pacientes consentidos submetidos à cirurgia de endarterectomia carotídea. (B) Reconstrução 3D a partir de uma tomografia computadorizada μ. O tecido calcificado é mostrado em azul claro e não calcificado em vermelho. Uma amostra ideal sem tecido calcificado poderia ser obtida da área entre as linhas azuis. (C) Reconstrução 3D a partir da μTC mostrando uma placa subótima com excesso de tecido calcificado. Barra de escala = 3 mm. Abreviação: μCT = tomografia microcomputadorizada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: MPM-SHG resulta de uma amostra representativa. (A) Visão geral da varredura de blocos; os blocos selecionados para geração de imagens são mostrados em azul. (B) MIPs de vários azulejos. (C) Detecção de fibra pela ferramenta FOA a partir de uma telha selecionada (1º). (D) Histograma de orientação da fibra de um bloco selecionado. (E) Histograma de orientação da fibra + ajuste gaussiano, do qual os parâmetros estruturais do colágeno podem ser extraídos de uma telha selecionada. (F) Representação do μ p (linha preta de orientação) e σ_p (cor de fundo) em toda a amostra da placa. (G) Representação dos μ_p (linha preta de orientação) e P_ani (cor de fundo) em toda a amostra da placa. Barras de escala = 140 μm (B,C). Abreviaturas: MPM-SHG = microscopia multifóton-segunda geração harmônica; PImáx = projeções de intensidade máxima; FOA = análise de orientação da fibra; μ_p = ângulo predominante da fibra; P_ani = fração anisotrópica; σ_p = desvio padrão da distribuição do ângulo da fibra; P_iso = fração isotrópica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Início e propagação da ruptura em uma amostra de tecido em placa durante o procedimento de teste de tração.1) Estado pré-esticado, tecido intacto. 2) Início da ruptura - primeiro quadro em que a ruptura é observada. O local de início da ruptura é marcado com um quadrado vermelho. 3 ) e 4) Propagação da ruptura. 5) Ruptura completa da amostra da placa. Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Padrões de deformação Green-Lagrange de uma amostra representativa (ε_xx, ε_xy e ε_yy) no quadro antes da ruptura, obtidos com análise DIC. A média e o desvio padrão sobre toda a placa são dados, juntamente com a tensão no local da ruptura. Abreviaturas: DIC = correlação de imagem digital; ε_xx = deformação longitudinal; ε_xy = cisalhamento; ε_yy = tensão de tração. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Imagem de sobreposição do local de ruptura (quadrado vermelho) em imagens. (A) Imagem de câmera de alta velocidade, onde a ruptura é identificada (quadro de ruptura). (B) Imagem da câmera de alta velocidade, onde apenas o pré-alongamento é aplicado (quadro de referência). (C) A imagem de varredura de azulejos obtida por microscopia . (D) Um mapa codificado por cores mostrando parâmetros estruturais locais de colágeno em várias telhas. Os μ_p (linha preta de orientação) e P_ani (cor de fundo) em toda a amostra de placa são apresentados. Abreviaturas: μ_p = ângulo predominante da fibra; P_ani = fração anisotrópica. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O presente estudo concentrou-se no desenvolvimento de um pipeline de mecano-imagem para estudar a correlação entre a orientação e dispersão local do colágeno, propriedades mecânicas locais e comportamento de ruptura do tecido fibroso da placa aterosclerótica. O protocolo aqui descrito é inovador por várias razões. Primeiro, esta é a primeira vez que a correlação de imagem digital foi aplicada para medir a deformação local do tecido fibroso da placa sob carga mecânica. Em segundo lugar, este protocolo fornece as informações necessárias para analisar a associação entre o padrão de deformação local e a arquitetura local de colágeno do tecido fibroso da placa. A importância da avaliação local é enfatizada tanto pelos dados de deformação quanto pelos dados de colágeno apresentados na seção de resultados, que mostram a natureza heterogênea do tecido. Portanto, o uso de técnicas que possibilitem a avaliação local, como as utilizadas neste protocolo, é recomendado para futuros estudos das propriedades da placa fibrosa.

A preparação da amostra de teste está entre as etapas críticas deste protocolo. As placas carótidas são principalmente tecidos colagenosos; no entanto, podem conter calcificações que são consideradas como afetando o comportamento mecânico geral da placa^36,37. Como o estudo se concentra no componente tecidual fibroso da placa, calcificações são evitadas nas amostras de teste usando a imagem μCT³⁸. Se a μTC não estiver disponível, outras técnicas de imagem, como ressonância nuclear magnética (RNM) ou OCT³⁹, podem ser consideradas para detectar as regiões calcificadas na placa. Obter amostras de teste de tecido fibroso que estão livres de calcificações e são de um tamanho grande o suficiente que é viável para testes mecânicos pode ser uma tarefa desafiadora para placas que são fortemente calcificadas ou contêm calcificações dispersas. Outra tarefa desafiadora no protocolo é gerar um padrão de salpicos ideal para a correlação de imagens digitais. O DIC ideal requer uma relação preto/branco de 50:50²⁸ e salpica o tamanho de três a cinco pixels²⁹ para garantir a qualidade apropriada. O não cumprimento desses requisitos pode resultar em medições de deformação local imprecisas. Finalmente, mapear o local de ruptura para as imagens SHG pode ser um desafio se os marcos naturais de um tecido não estiverem claros. Para essas amostras, a aplicação de vários marcadores fiduciais ao tecido antes da imagem será útil.

A técnica MPM-SHG utilizada no protocolo atual é superior a muitas outras técnicas de imagem de colágeno, pois é uma técnica de alta resolução e não destrutiva com uma profundidade de penetração relativamente grande. No entanto, a profundidade de penetração (<400 μm) do MPM-SHG apresenta uma limitação, pois não permite a imagem de toda a espessura das amostras de teste, que variou entre 0,5 e 2 mm. Em um estudo recente com ressonância magnética de tensor de difusão (DT-MRI), demonstramos que a orientação predominante da fibra nas partes mais profundas do tecido da placa pode ser diferente da das partes luminais mais superficiais do tecido¹⁴. Portanto, mais estudos são necessários para investigar a arquitetura local do colágeno nas partes mais profundas de amostras de tecido de placa fibrosa espessa e sua relação com a mecânica tecidual local. Para este propósito, a imagem polarizada do domínio da frequência espacial (pSFDI) pode ser utilizada. Foi relatado que essa técnica de imagem óptica recentemente desenvolvida tem o potencial de medir a orientação da fibra até 0,8 mm em folhetos valvares mitrais¹². O pSFDI também oferece uma aquisição rápida, o que também poderia facilitar a visualização de toda a área da amostra, em vez de apenas uma seleção de telhas, como é o caso do protocolo atual. Outra limitação do protocolo atual é que apenas a deformação superficial pôde ser identificada. Em estudos futuros, a CID⁴⁰ de visão múltipla assistida por espelho ou a correlação digital de volume (DVC)⁴¹ podem ser incluídas neste protocolo para obter informações adicionais sobre as cepas volumétricas e subsuperficiais.

O protocolo experimental atual pode ser estendido ou modificado de várias maneiras para obter informações adicionais sobre a mecânica de ruptura da placa e sua relação com a microestrutura subjacente. Primeiro, o protocolo atual inclui testes de tração uniaxial na direção circunferencial. Este tipo de ensaio mecânico foi escolhido uma vez que a placa experimenta predominantemente alongamento de tração na direção circunferencial in vivo. Para uma caracterização mecânica mais abrangente, este protocolo pode ser estendido para incorporar testes de insuflação, testes biaxiais ou ensaios de tração uniaxiais na direção longitudinal. Em segundo lugar, o protocolo atual se concentra apenas na obtenção de cepas locais através da CIVD. No entanto, uma visão mais completa do comportamento mecânico da placa pode ser adquirida pela inclusão também da análise de tensão local no protocolo, mas isso requer caracterização da rigidez local. Embora atualmente desafiador, isso pode ser alcançado por técnicas computacionais como o método dos elementos finitos inversos ^42,43 e o método dos campos virtuais⁴⁴. Além da adaptação experimental, algumas etapas adicionais de pós-processamento também podem ser adicionadas ao protocolo atual. Primeiro, em vez de apenas identificar o local de ruptura, o caminho de propagação de rachaduras pode ser identificado através das imagens de câmera de alta velocidade obtidas. Esse caminho de propagação pode ser correlacionado a parâmetros estruturais e mecânicos locais. Em segundo lugar, o local de início da ruptura foi identificado visualmente no protocolo descrito. Estudo prévio sobre tecidos não biológicos utilizou descontinuidades em medidas de deformação da CIVD para detectar ruptura⁴⁵. A aplicação dessa detecção de ruptura automatizada nos tecidos da placa pode melhorar a precisão da detecção de ruptura. Finalmente, uma grande vantagem do MPM-SHG em comparação com outras técnicas de imagem de colágeno é que ele visualiza fibras de colágeno individuais. Portanto, os dados obtidos por meio desse protocolo também podem ser usados para investigar características adicionais do colágeno local, como o teor de colágeno.

Este protocolo pode ser utilizado para proporcionar uma melhor compreensão das características locais do tecido fibroso da placa, o componente que falha mecanicamente na ruptura da placa in vivo. Essas informações são necessárias para estabelecer novos marcadores de imagem estruturais e funcionais que prevejam a ruptura da placa em pacientes. Esses novos marcadores são necessários, uma vez que os biomarcadores de risco sugeridos anteriormente demonstraram ter valor preditivo subótimo para eventos clínicos futuros ^5,6. No futuro, OCT e ps-OCT podem possivelmente identificar e quantificar tecido fibroso no sistema arterial^46,47,48. Além disso, a cepa foi considerada um marcador substituto para a composição da placa local⁴⁹. Assim, medidas de deformação in vivo ⁴⁹ poderiam potencialmente auxiliar na identificação da estabilidade da placa em pacientes. No entanto, deve-se ter cuidado com a tradução direta dos resultados obtidos para a ruptura da placa in vivo. Primeiro, o tecido da placa fibrosa experimenta uma carga mais complexa in vivo do que a carga de tração unidirecional usada neste protocolo. Em segundo lugar, as placas ateroscleróticas são estruturas multicomponentes; as distribuições in vivo de estresse e deformação no tecido da placa fibrosa podem ser afetadas pela presença e localização dos demais componentes da placa, como calcificações³⁷.

Este pipeline de mecano-imagem também pode ser utilizado para estudar outros tecidos colágenos. Testes mecânicos globais e imagens estruturais de colágeno já são amplamente utilizados para tecidos biológicos. No entanto, a avaliação local das propriedades pré-falha e falha, bem como a arquitetura do colágeno, é fundamental para a caracterização mecânica precisa de tecidos fibrosos heterogêneos. Prevemos que a estrutura deste novo protocolo fornecerá mais informações sobre a interação entre a microestrutura e a mecânica de vários tecidos biológicos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mm extension ring	Thorlabs Inc.	CML10
15 mL tube	VWR	525-0150
20x APO water immersion objective	Leica	507701
3D Slicer software	N/A	Version 4.11
50 mL tubes	VWR	525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm	Conrad	4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating	Thorlabs
Black tissue dye	Polysciences inc	24113-2
Camera lens, focal length 50 mm	Thorlabs Inc.	MVL50M1
Camera stand	VWR	241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser	Coherent
Compressor + air hose	JUN-AIR, Conrad	B07GB9HC62, 4016138577198
Excel	Microsoft	Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm	Pattex
Heating bath	N/A		Custom made
High-speed camera + imaging software	Pixelink-Navitar Inc.	PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery)	N/A
Image J	National Institute of Health	N/A
LAS-AF	Leica	Version 2.3	Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II	Leica		Microscope used for SHG imaging
Lighting system	AMZ instruments	LED-60TB	Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB	MathWorks	Version R2021A
MATLAB-based FibLab software	Eindhoven University of Technology	N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool	Eindhoven University of Technology	N/A
MATLAB-based Ncorr software	Georgia Institute of Technology	Version 1.2
Needles	Emerald	BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter)	VWR	BRND452000
Parafilm	VWR	291-1214
Pasteur Pipettes	VWR	ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm	PerkinElmer	CLS149276
Ruler	Fine Science Tools	1800030
Sandpaper (P180)	Conrad	4.00932E+12
Side cutter	Conrad	4.25084E+12
Silicon elastomer base and curring agent (Sylgard 184)	VWR	634165S
Tensile tester + software + clamps	N/A		Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver	Garant, Hoffman group	659906