Optimización de los parámetros de clasificación por citometría de flujo para el aislamiento y purificación de alto rendimiento de pequeñas vesículas extracelulares

Resumen

Este protocolo proporciona un método de aislamiento rápido y específico del tamaño para pequeñas vesículas extracelulares al optimizar el tamaño de la boquilla de pulverización de aire, la presión del fluido de la vaina, la presión del flujo de muestra, el voltaje, la ganancia y los parámetros del umbral de activación.

Resumen

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) pueden liberarse de todos los tipos de células y transportar proteínas, ADN y ARN. Las moléculas de señalización sirven como indicadores del estado fisiológico y patológico de una célula. Sin embargo, no existe un método estándar para el aislamiento de sEV, que impide la identificación de biomarcadores posteriores y los estudios de intervención farmacológica. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento y purificación de 50-200 nm sEV mediante un clasificador de células de flujo. Para esto, se seleccionó una boquilla de 50 μm y una presión de fluido de vaina de 80 psi para obtener una buena velocidad de clasificación y una corriente lateral estable. Se utilizaron microesferas de poliestireno de tamaño estándar para localizar poblaciones de partículas de 100, 200 y 300 nm. Con una optimización adicional del umbral de activación de voltaje, ganancia y dispersión directa (FSC), la señal sEV podría separarse del ruido de fondo. Estas optimizaciones proporcionan un panel de configuraciones de ordenación críticas que permite obtener una población representativa de sEV utilizando FSC frente a dispersión lateral (SSC) solamente. El método de aislamiento basado en citometría de flujo no solo permite el análisis de alto rendimiento, sino que también permite la clasificación sincrónica o el análisis del proteoma de sEV basado en la expresión del biomarcador, abriendo numerosas aplicaciones de investigación posteriores.

Introducción

Una célula libera vesículas extracelulares (EV) de diferentes tamaños que resultan en moléculas de señalización e inclusiones de membrana, que son importantes para la comunicación intercelular¹. Los EV de diferentes tamaños también desempeñan diferentes funciones biológicas, con 50-200 nm sEV que pueden distribuir con precisión ARN, ADN y proteínas a la ubicación extracelular correcta. El sEV también ayuda a determinar sus mecanismos de secreción, involucrando no sólo la regulación de los procesos fisiológicos normales, como la vigilancia inmune, el mantenimiento de células madre, la coagulación sanguínea y la reparación de tejidos, sino tambié....

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Prepare un medio de cultivo del Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS). Cultivar la célula de cáncer de páncreas humano, PANC-1, en un matraz de cultivo de 75^cm2 a una densidad de 1 x 10⁶ células/ml. Incubar el cultivo a 37 °C con un 5% de_CO2.
2. Subcultivo de las células cuando la densidad celular alcanza el 75%-80% bajo observación microscópica. Retire el medio y enjuague 2x con 3-5 ml de solución salina tampón fosfato (PBS; 0.01 M, pH 7.2-7.4).
3. Deseche la solución, agregue 1-2 ml de solución de tripsina-EDTA y deje que....

Resultados

El diagrama de flujo para el protocolo experimental se muestra en la Figura 1. En este método, se utilizaron microesferas de poliestireno de tamaño estándar como estándares de referencia para la distribución del tamaño de partícula. Bajo la condición específica del parámetro instrumental, la señal de partícula podría distinguirse claramente del ruido de fondo en la gráfica FSC vs. SSC utilizando la forma logarítmica. Las estrategias de acceso se muestran en

Discusión

Este protocolo describe un método optimizado para aislar y purificar sEV con el tamaño de partícula especificado de 50-200 nm utilizando un clasificador de células de flujo, que fue validado por NTA. El método resolvió el problema del cuello de botella de obtener sEV con tamaño de partícula uniforme y alta pureza, evitando la interferencia de moléculas biológicas no relacionadas envueltas en EV de gran tamaño²². Los análisis rápidos y de alto rendimiento son posibles con la citometrí.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI