Optimización de los parámetros de clasificación por citometría de flujo para el aislamiento y purificación de alto rendimiento de pequeñas vesículas extracelulares

Resumen

Este protocolo proporciona un método de aislamiento rápido y específico del tamaño para pequeñas vesículas extracelulares al optimizar el tamaño de la boquilla de pulverización de aire, la presión del fluido de la vaina, la presión del flujo de muestra, el voltaje, la ganancia y los parámetros del umbral de activación.

Resumen

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) pueden liberarse de todos los tipos de células y transportar proteínas, ADN y ARN. Las moléculas de señalización sirven como indicadores del estado fisiológico y patológico de una célula. Sin embargo, no existe un método estándar para el aislamiento de sEV, que impide la identificación de biomarcadores posteriores y los estudios de intervención farmacológica. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento y purificación de 50-200 nm sEV mediante un clasificador de células de flujo. Para esto, se seleccionó una boquilla de 50 μm y una presión de fluido de vaina de 80 psi para obtener una buena velocidad de clasificación y una corriente lateral estable. Se utilizaron microesferas de poliestireno de tamaño estándar para localizar poblaciones de partículas de 100, 200 y 300 nm. Con una optimización adicional del umbral de activación de voltaje, ganancia y dispersión directa (FSC), la señal sEV podría separarse del ruido de fondo. Estas optimizaciones proporcionan un panel de configuraciones de ordenación críticas que permite obtener una población representativa de sEV utilizando FSC frente a dispersión lateral (SSC) solamente. El método de aislamiento basado en citometría de flujo no solo permite el análisis de alto rendimiento, sino que también permite la clasificación sincrónica o el análisis del proteoma de sEV basado en la expresión del biomarcador, abriendo numerosas aplicaciones de investigación posteriores.

Introducción

Una célula libera vesículas extracelulares (EV) de diferentes tamaños que resultan en moléculas de señalización e inclusiones de membrana, que son importantes para la comunicación intercelular¹. Los EV de diferentes tamaños también desempeñan diferentes funciones biológicas, con 50-200 nm sEV que pueden distribuir con precisión ARN, ADN y proteínas a la ubicación extracelular correcta. El sEV también ayuda a determinar sus mecanismos de secreción, involucrando no sólo la regulación de los procesos fisiológicos normales, como la vigilancia inmune, el mantenimiento de células madre, la coagulación sanguínea y la reparación de tejidos, sino también la patología subyacente a varias enfermedades, como la progresión tumoral y la metástasis ^2,3. El aislamiento y el análisis efectivos de sEV son críticos para identificar biomarcadores y diseñar futuras intervenciones farmacológicas.

Con la investigación continua sobre la aplicación clínica de sEV, los métodos de aislamiento de sEV han presentado requisitos más altos. Debido a la heterogeneidad del sEV en tamaño, fuente y contenido, así como a su similitud con otros EV en propiedades fisicoquímicas y bioquímicas, no existe un método estándar para el aislamiento de sEV ^4,5. Actualmente, la ultracentrifugación, la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), la precipitación de polímeros y la captura de inmunoafinidad son los métodos de aislamiento de sEV más comunes⁶. La ultracentrifugación sigue siendo el estándar de oro para el aislamiento de sEV en la investigación, a pesar de llevar mucho tiempo, lo que resulta en una baja pureza con una amplia distribución de tamaño de 40-500 nm y daños mecánicos significativos en el sEV después de la centrifugación a largo plazo ^7,8,9. La precipitación polimérica, que generalmente utiliza polietilenglicol (PEG), adolece de una pureza inaceptable para el análisis funcional posterior con precipitación concomitante de agregados proteicos extracelulares y contaminación polimérica^10,11. Los métodos basados en la captura de inmunoafinidad requieren anticuerpos de alto costo con especificidad variable, así como problemas con el bajo volumen de procesamiento y rendimientos 12,13,14. El tamaño de partícula es uno de los principales indicadores para evaluar la pureza del sEV aislado. Aunque la pureza de sEV sigue siendo un objetivo inalcanzable, SEC elimina una cantidad considerable de componentes medios, y las partículas de sEV extraídas por el método SEC están principalmente en el rango de 50-200 nm¹⁵. Las técnicas existentes tienen algunas desventajas, incluyendo pero no limitado a ser lentas, baja pureza, bajo rendimiento, poca reproducibilidad, bajo rendimiento de las muestras, y daño potencial de sEV, lo que lo hace incompatible con la utilización clínica¹⁶. Por lo tanto, un método de aislamiento de sEV rápido, económico y de tamaño especificado aplicable a diversos biofluidos es una necesidad esencial en varias situaciones clínicas y de investigación.

En la citometría de flujo, las partículas individuales se analizan de manera multiparamétrica de alto rendimiento y los subconjuntos se clasifican¹⁷. Debido a la heterogeneidad de las EV, sería ideal una medición citométrica de flujo de una sola partícula, que se ha utilizado para investigar las EV siguiendo los paradigmas del análisis celular, con etiquetas de dispersión de luz y fluorescencia utilizadas para identificar características relacionadas con la fisiología y componentes proteicos^18,19,20. Sin embargo, la citometría de flujo convencional se ve desafiada por el pequeño tamaño de sEV y la baja abundancia de biomarcadores de superficie. La sensibilidad de la citometría de flujo podría mejorarse optimizando los parámetros de detección para distinguir el ruido de fondo y el sEV, independientemente del uso del parámetro¹⁹ de dispersión directa (FSC), dispersión lateral (SSC) o umbral de fluorescencia.

Con el protocolo actual, los ajustes de clasificación por citometría de flujo de alta resolución se optimizaron utilizando perlas fluorescentes como estándar. Al seleccionar el tamaño adecuado de la boquilla, la presión del fluido de la vaina, el parámetro de activación del umbral y los voltajes que controlan las intensidades de luz dispersa, pudimos aislar un subconjunto específico de sEV de una mezcla compleja.

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Prepare un medio de cultivo del Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS). Cultivar la célula de cáncer de páncreas humano, PANC-1, en un matraz de cultivo de 75^cm2 a una densidad de 1 x 10⁶ células/ml. Incubar el cultivo a 37 °C con un 5% de_CO2.
2. Subcultivo de las células cuando la densidad celular alcanza el 75%-80% bajo observación microscópica. Retire el medio y enjuague 2x con 3-5 ml de solución salina tampón fosfato (PBS; 0.01 M, pH 7.2-7.4).
3. Deseche la solución, agregue 1-2 ml de solución de tripsina-EDTA y deje que las células se desprendan hasta que se redondeen y suspendan en el medio bajo el microscopio. Añadir el medio fresco, aspirar y dispersar en matraces de cultivo de 75^cm2 con 15 ml de medio de cultivo. Use una proporción de subcultivo de 1: 2 a 1: 4 (recomendado).
   NOTA: Todas las operaciones se realizan en un gabinete de bioseguridad para evitar la contaminación celular.

2. Colección de medios de cultivo

1. Incubar las células durante 48 h a 37 °C con 5% de_CO2. Recoger sobrenadante celular (90 ml) en dos tubos centrífugos de 50 ml y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
2. Transfiera el sobrenadante a nuevos tubos estériles y centrifugar sucesivamente a 2.000 x g durante 20 min, 10 000 x g durante 30 min y 12.000 x g durante 70 min a 4 °C.
3. Retire el sobrenadante y enjuague el pellet con 10 ml de PBS pipeteando suavemente. Centrifugar a 12.000 x g durante 70 min a 4 °C de nuevo y resuspender el pellet en 10 mL de tampón PBS para obtener una mezcla de EVs.
4. Realizar análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para cuantificar y dimensionar la mezcla de EV. Realice el análisis NTA de acuerdo con el manual de referencia de operación del instrumento y la referencia²¹.

3. Clasificación celular

1. Realice el procedimiento de inicio estándar del clasificador de celdas de flujo. Encienda la máquina pulsando el botón Inicio . Haga clic en el botón Laser Power (Encendido láser ) en el panel de control láser. Pulse el botón Change Tanks (Cambiar tanques ) en el submenú del muestreador inteligente para presurizar la fluidos.
   NOTA: Asegúrese de que el tanque de residuos esté vacío y que el tanque de la vaina esté lleno antes de arrancar.
2. Utilice una boquilla de chorro de aire de 50 μm limpiada por ultrasonidos e instálela en el conjunto de la boquilla. Ajuste la presión a 80 psi para el fluido de la vaina y 80.3 psi para el flujo de muestra en la consola de presión.
3. Pulse el botón Start Sheath Flow (Iniciar flujo de vaina) para iniciar el flujo de flujo de la vaina. Haga clic en el botón Burbuja en el submenú del muestreador inteligente para desburbujear automáticamente durante 10 minutos y, a continuación, apáguelo.
   NOTA: Para la clasificación de celdas, diferentes tamaños de boquillas de pulverización de aire requieren diferentes presiones de fluido de vaina para mantener la estabilidad del flujo de líquido. En este método, se utilizó una boquilla de 50 μm, y solo una presión de fluido de vaina mayor o igual a 80 psi podría generar corrientes laterales estables. La diferencia de presión entre el flujo de muestra y el fluido de la vaina determina la velocidad de carga de clasificación. Bajo la condición de ajuste del método (la diferencia de presión entre el flujo de muestra y el fluido de la vaina es de 0.3-0.6 psi), el flujo de líquido fue relativamente estable y la velocidad de carga permitió que la eficiencia de clasificación aumentara a 80% desde 50% para una diferencia de presión inferior a 0.3-0.6 psi.
4. Alinee la corriente y determine el punto láser. Encienda la luz de la cámara de iluminación para ver la corriente sobre los orificios. Ajuste los micrómetros arriba y abajo, izquierda y derecha y adelante y atrás para centrar la corriente en el agujero de alfiler y enfocar la corriente.
5. Seleccione la pestaña Laser and Stream Intercept (Intercepción láser y de flujo ). Presione el botón de flecha verde continuamente según se le solicite para completar el proceso de calibración de intercepción láser y alineación de boquillas.
6. Acceda a la pantalla de alineación láser fina. Seleccione el canal 640-722/44 (H) como parámetro del eje X y el canal 405-448/59 (H) como parámetro del eje Y. Pulse el selector de parámetros de disparo y elija el parámetro SSC del láser de 488 nm. Abra todas las persianas láser.
   NOTA: Los parámetros de los ejes X e Y elegidos dependen de la configuración láser del sistema. Se permiten otros parámetros si el sistema no tiene un láser de 640 nm o 405 nm. Para obtener los mejores resultados, seleccione los láseres con la mayor separación espacial en la tira estenopeica (sin incluir el láser de 355 nm).
7. Diluir las partículas fluorescentes del arco iris añadiendo una gota en 1 ml de agua destilada doble para una concentración final de 1 x 10⁶ perlas por ml. Abra la puerta de la cámara de muestras y cargue un tubo de las partículas fluorescentes arco iris preparadas.
8. Presione el botón Iniciar muestra . Ajuste los micrómetros hacia arriba y hacia abajo para optimizar la intensidad de la fluorescencia, haciendo que cada señal sea lo más intensa posible. Pulse el botón Iniciar control de calidad (QC) en el panel de control de la pantalla táctil para realizar el control de calidad automáticamente.
9. Realizar retardo de caída. Acceda a la pantalla de configuración de ordenación y seleccione el botón de retardo de caída. Presione el botón Inicialización de IntelliSort . El instrumento ajusta automáticamente la frecuencia y amplitud de la oscilación de gotas para obtener el retardo de caída de 25 ± 5 y poder visualizar claramente el punto de ruptura de la gota. Pulse el botón Mantener .
10. Seleccione tubo como tipo de salida de ordenación. Coloque un portatubos de 15 ml en la cámara de clasificación. Encienda el voltaje de la placa y ajuste el voltaje de la placa a aproximadamente 4000 V.
11. Active el patrón de prueba seleccionando el botón Configuración de transmisión . Ajuste el control deslizante de fase de carga y el control deslizante de deflexión para asegurarse de que la imagen de la transmisión esté alineada con el tubo de recolección. Seleccione el botón Marca de verificación .
12. Inicie sesión en la estación de trabajo Summit en el equipo. Cree un nuevo protocolo desde el menú principal Archivo. Cree un diagrama de puntos seleccionando la pestaña Histograma en el panel de control del software Summit.
13. Haga clic con el botón derecho en los ejes del nuevo diagrama de puntos en el espacio de trabajo y elija FSC como parámetro del eje X y SSC como parámetro del eje Y. Presentar el FSC y el SSC en forma logarítmica.
14. Seleccione la ficha Adquisición y localice el panel de parámetros de adquisición. Habilite todas las señales en el submenú de habilitación de parámetros. Elija FSC como parámetro de activación y establezca el umbral de 0,01. Ajuste el voltaje y la ganancia de FSC y SSC a 250 y 0.6 para garantizar que los eventos dentro de la gráfica FSC vs. SSC y las poblaciones estén separados.
    NOTA: El ajuste del umbral es equivalente al ajuste del tamaño de partícula que se puede detectar mediante citometría de flujo. Cuanto mayor sea el umbral, más grandes serán las partículas detectadas, y las partículas pequeñas serán cortadas por el umbral y no podrán ser detectadas. En este método, el umbral se establece en 0.01, por lo que se pueden detectar todas las partículas más grandes que el ruido electrónico.

4. Aislamiento de sEV

1. Diluir las microesferas de poliestireno fluorescente en suspensiones de 100 nm, 200 nm y 300 nm. Añadir 1 μL de microesferas a 1 ml de agua destilada doble.
2. Cargue la suspensión de microesferas sucesivamente. Seleccione Inicio en el menú de adquisición del software de la cumbre y registre 20,000 eventos.
   NOTA: El número de eventos es opcional. Se recomiendan no menos de 5.000 eventos para cumplir con la significación estadística.
3. Haga clic con el botón derecho en el diagrama de puntos FSC vs. SSC para crear rectángulos y arrastre para cambiar el tamaño y la reposición de las regiones de ruido electrónico y la población de microesferas de 100 nm. Haga clic con el botón derecho en las regiones para cambiarles el nombre como R7 y R4, respectivamente. Repita los pasos anteriores para enmarcar las microesferas de 200 nm y 300 nm con rectángulos sucesivamente y cámbieles el nombre como R5 y R6, respectivamente.
4. Finalmente, determine la región de clasificación de 50-200 nm basada en el ruido electrónico y la posición de las partículas de 200 nm definidas como R8.
   NOTA: El límite inferior de detección de 50 nm se coloca justo por encima del ruido electrónico del clasificador de celdas de flujo. Por lo tanto, la región entre el ruido y la población de microesferas de 200 nm se puede definir entre 50-200 nm.
5. Edite las decisiones de ordenación en el panel Lógica de ordenación y estadísticas. Haga doble clic en el campo en blanco de la secuencia izquierda (L1). Seleccione la región denominada R8 para crear la lógica de ordenación. Elija el modo Abortar de pureza y seleccione un sobre de gotas de 1 gota para la secuencia L1.
6. Cargue una muestra de 500 μL de mezcla de EVs del paso 2.3. Pulse el botón Inicio situado en el menú de adquisición de Summit para adquirir datos y, a continuación, pulse Inicio en el menú de ordenación para recoger 50-200 nm sEV en un tubo de centrífuga de 15 ml.
   NOTA: Un ambiente estéril es necesario para minimizar la contaminación durante cualquier procedimiento.
7. Observe la presencia de sEV mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y verifique el tamaño de partícula de sEV utilizando NTA. Realizar análisis de Western blot (WB) para confirmar aún más la expresión de los marcadores CD9, CD63 y CD81¹⁸.

Resultados

El diagrama de flujo para el protocolo experimental se muestra en la Figura 1. En este método, se utilizaron microesferas de poliestireno de tamaño estándar como estándares de referencia para la distribución del tamaño de partícula. Bajo la condición específica del parámetro instrumental, la señal de partícula podría distinguirse claramente del ruido de fondo en la gráfica FSC vs. SSC utilizando la forma logarítmica. Las estrategias de acceso se muestran en

Discusión

Este protocolo describe un método optimizado para aislar y purificar sEV con el tamaño de partícula especificado de 50-200 nm utilizando un clasificador de células de flujo, que fue validado por NTA. El método resolvió el problema del cuello de botella de obtener sEV con tamaño de partícula uniforme y alta pureza, evitando la interferencia de moléculas biológicas no relacionadas envueltas en EV de gran tamaño²². Los análisis rápidos y de alto rendimiento son posibles con la citometrí...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI