Оптимизация параметров проточной цитометрической сортировки для высокопроизводительной изоляции и очистки малых внеклеточных везикул

Резюме

Этот протокол обеспечивает быстрый и специфический по размеру метод выделения небольших внеклеточных везикул за счет оптимизации размера сопла для распыления воздуха, давления жидкости в оболочке, давления потока образца, напряжения, усиления и пороговых параметров запуска.

Аннотация

Малые внеклеточные везикулы (sEV) могут высвобождаться из всех типов клеток и переносить белок, ДНК и РНК. Сигнальные молекулы служат индикаторами физиологического и патологического состояния клетки. Тем не менее, не существует стандартного метода выделения sEV, который препятствует последующей идентификации биомаркеров и исследованиям лекарственного вмешательства. В этой статье мы приводим подробный протокол выделения и очистки 50-200 нм sEV с помощью сортировщика проточных ячеек. Для этого было выбрано сопло 50 мкм и давление жидкости в оболочке 80 фунтов на квадратный дюйм для получения хорошей скорости сортировки и стабильного бокового потока. Микросферы полистирола стандартного размера использовались для обнаружения популяций частиц размером 100, 200 и 300 нм. С дополнительной оптимизацией порога срабатывания напряжения, усиления и прямого рассеяния (FSC) сигнал sEV может быть отделен от фонового шума. Эти оптимизации предоставляют панель критических настроек сортировки, которая позволяет получить репрезентативную популяцию sEV, используя только FSC по сравнению с боковым рассеянием (SSC). Метод выделения на основе проточной цитометрии не только обеспечивает высокопроизводительный анализ, но также позволяет проводить синхронную классификацию или протеомный анализ sEV на основе экспрессии биомаркеров, открывая множество последующих исследовательских приложений.

Введение

Клетка высвобождает внеклеточные везикулы (ВВ) различных размеров, что приводит к появлению сигнальных молекул и мембранных включений, которые важны для межклеточной коммуникации¹. EV разных размеров также играют разные биологические роли: 50-200 нм sEV способны точно распределять РНК, ДНК и белки в правильном внеклеточном месте. sEV также помогает определить механизмы секреции, включающие не только регуляцию нормальных физиологических процессов, таких как иммунный надзор, поддержание стволовых клеток, свертывание крови и восстановление тканей, но и патологию, лежащую в основе нескольких заболеваний, таких как прогрессирование опухоли и метастазирование ^2,3. Эффективная изоляция и анализ sEV имеют решающее значение для выявления биомаркеров и разработки будущих лекарственных вмешательств.

Благодаря непрерывным исследованиям клинического применения sEV методы выделения sEV выдвинули более высокие требования. Из-за неоднородности sEV по размеру, источнику и содержанию, а также их сходства с другими EV по физико-химическим и биохимическим свойствам не существует стандартного метода выделения sEV ^4,5. В настоящее время ультрацентрифугирование, эксклюзионная хроматография (SEC), осаждение полимеров и иммуноаффинный захват являются наиболее распространенными методами выделения sEV⁶. Ультрацентрифугирование по-прежнему является золотым стандартом выделения sEV в исследованиях, несмотря на то, что оно отнимает много времени, что приводит к низкой чистоте с широким распределением по размерам 40-500 нм и значительным механическим повреждениям sEV после длительного центрифугирования ^7,8,9. Осаждение полимеров, в котором обычно используется полиэтиленгликоль (ПЭГ), страдает от неприемлемой чистоты для последующего функционального анализа с сопутствующим осаждением внеклеточных белковых агрегатов и полимерной контаминацией^10,11. Методы, основанные на иммуноаффинном захвате, требуют дорогостоящих антител с различной специфичностью, а также имеют проблемы с низким объемом обработки и выходами^12,13,14. Размер частиц является одним из основных показателей для оценки чистоты изолированного sEV. Хотя чистота sEV остается недостижимой целью, SEC удаляет большое количество компонентов среды, а частицы sEV, извлеченные методом SEC, в основном находятся в диапазоне 50-200 нм¹⁵. Существующие методы имеют несколько недостатков, включая, помимо прочего, трудоемкость, низкую чистоту, низкий выход продукции, плохую воспроизводимость, низкую пропускную способность образцов и потенциальное повреждение sEV, что делает его несовместимым с клиническим использованием¹⁶. Таким образом, быстрый, недорогой и специфический по размеру метод выделения sEV, применимый к различным биожидкостям, является насущной необходимостью в нескольких исследовательских и клинических ситуациях.

При проточной цитометрии отдельные частицы анализируются высокопроизводительным, многопараметрическим способом, а подмножества сортируются¹⁷. Из-за гетерогенности ЭВ идеальным было бы цитометрическое измерение потока одной частицы, которое использовалось для исследования ВВ в соответствии с парадигмами клеточного анализа, при этом светорассеяние и флуоресцентные метки использовались для идентификации связанных с физиологией особенностей и белковых компонентов^18,19,20. Тем не менее, традиционная проточная цитометрия сталкивается с трудностями из-за небольшого размера sEV и низкого содержания поверхностных биомаркеров. Чувствительность проточной цитометрии может быть улучшена за счет оптимизации параметров детектирования для различения фонового шума и sEV независимо от использования прямого рассеяния (FSC), бокового рассеяния (SSC) или порога срабатывания порога флуоресценции¹⁹.

В соответствии с настоящим протоколом настройки проточной цитометрической сортировки с высоким разрешением были оптимизированы с использованием флуоресцентных шариков в стандартной комплектации. Выбрав правильный размер сопла, давление жидкости в оболочке, пороговый параметр срабатывания и напряжения, контролирующие интенсивность рассеянного света, мы смогли выделить определенное подмножество sEV из сложной смеси.

протокол

1. Клеточная культура

1. Приготовьте питательную среду модифицированной орлиной среды (DMEM) Дульбекко с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Культивируйте раковую клетку поджелудочной железы человека, PANC-1, в колбе для культуры размером 75^см2 с плотностью 1 x 10⁶ клеток/мл. Инкубируют культуру при 37 °C с 5%_CO2.
2. Субкультурируйте клетки, когда плотность клеток достигает 75% -80% при микроскопическом наблюдении. Удалите среду и промойте 2 раза 3-5 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
3. Откажитесь от раствора, добавьте 1-2 мл раствора трипсина-ЭДТА и дайте клеткам отделиться, пока они не станут круглыми и не будут суспендированы в среде под микроскопом. Добавьте свежую среду, аспирируйте и диспергируйте в^{75 см 2} колбы с культуральной средой объемом 15 мл. Используйте соотношение субкультивации от 1:2 до 1:4 (рекомендуется).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции выполняются в шкафу биобезопасности, чтобы избежать загрязнения клеток.

2. Коллекция питательных сред

1. Инкубировать клетки в течение 48 ч при 37 °C с 5%_CO2. Соберите надосадочную жидкость (90 мл) в две центрифужные пробирки по 50 мл и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C.
2. Надосадочную жидкость переносят в новые стерильные пробирки и центрифугу последовательно при 2000 x g в течение 20 мин, 10 000 x g в течение 30 мин и 12 000 x g в течение 70 мин при 4 °C.
3. Удалите надосадочную жидкость и промойте гранулу 10 мл PBS путем аккуратной пипетки. Снова центрифугу при 12 000 x g в течение 70 мин при 4 ° C и ресуспендирование гранулы в 10 мл буфера PBS для получения смеси EV.
4. Выполните анализ отслеживания наночастиц (NTA) для количественной оценки и определения размера смеси электромобилей. Выполните анализ NTA в соответствии со справочной инструкцией по эксплуатации прибора и ссылкой²¹.

3. Сортировка ячеек

1. Выполните стандартную процедуру запуска сортировщика проточных ячеек. Включите машину, нажав кнопку запуска . Нажмите кнопку «Питание лазера» на панели управления лазером. Нажмите кнопку «Заменить резервуары » в подменю интеллектуального пробоотборника, чтобы создать давление в жидкости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед запуском убедитесь, что резервуар для отходов пуст, а бак оболочки заполнен.
2. Используйте ультразвуковое очищенное сопло 50 мкм для струи воздуха и установите его на узел сопла. Отрегулируйте давление до 80 фунтов на квадратный дюйм для жидкости в оболочке и 80.3 фунта на квадратный дюйм для потока образца на прижимной консоли.
3. Нажмите кнопку Start Burath Flow , чтобы запустить поток оболочки. Нажмите кнопку Bubble в подменю интеллектуального пробоотборника, чтобы автоматически удалить пузырь в течение 10 минут, а затем выключите его.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для сортировки ячеек для разных размеров форсунок для распыления воздуха требуется разное давление жидкости в оболочке для поддержания стабильности потока жидкости. В этом методе использовалось сопло размером 50 мкм, и только давление жидкости в оболочке, превышающее или равное 80 фунтам на квадратный дюйм, могло генерировать стабильные боковые потоки. Разность давлений между потоком образца и жидкостью оболочки определяет скорость загрузки сортировки. При условиях настройки метода (разность давлений между потоком образца и жидкостью оболочки составляет 0,3-0,6 фунта на квадратный дюйм) поток жидкости был относительно стабильным, а скорость загрузки позволила повысить эффективность сортировки до 80% с 50% при разнице давлений менее 0,3-0,6 фунтов на квадратный дюйм.
4. Выровняйте поток и определите лазерное пятно. Включите свет осветительной камеры, чтобы просмотреть поток через точечные отверстия. Отрегулируйте микрометры вверх-вниз, влево и вправо, а также спереди и сзади, чтобы центрировать поток на точечном отверстии и сфокусировать поток.
5. Выберите вкладку «Лазер и перехват потока ». Непрерывно нажимайте кнопку «Зеленая стрелка » в соответствии с запросом, чтобы завершить процесс лазерного перехвата и калибровки выравнивания сопла.
6. Доступ к экрану точной лазерной юстировки. Выберите канал 640–722/44 (H) в качестве параметра оси X и канал 405–448/59 (H) в качестве параметра оси Y. Нажмите селектор параметров триггера и выберите параметр SSC лазера с длиной волны 488 нм. Откройте все лазерные затворы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранные параметры по осям X и Y зависят от конфигурации лазера системы. Другие параметры допускаются, если в системе нет лазера с длиной волны 640 нм или 405 нм. Для достижения наилучших результатов выбирайте лазеры с наибольшим пространственным разделением на полосе точечных отверстий (не включая лазер с длиной волны 355 нм).
7. Разбавьте радужные флуоресцентные частицы, добавив одну каплю в 1 мл двойной дистиллированной воды для получения конечной концентрации 1 x 10⁶ шариков на мл. Откройте дверцу камеры для отбора проб и загрузите в нее пробирку с подготовленными радужными флуоресцентными частицами.
8. Нажмите кнопку «Запустить образец ». Регулируйте микрометры вверх и вниз, чтобы оптимизировать интенсивность флуоресценции, делая каждый сигнал максимально интенсивным. Нажмите кнопку Start Quality Control (QC) на панели управления с сенсорным экраном, чтобы выполнить контроль качества автоматически.
9. Выполните задержку сброса. Получите доступ к экрану настройки сортировки и нажмите кнопку задержки удаления. Нажмите кнопку Инициализация IntelliSort . Прибор автоматически регулирует частоту и амплитуду колебаний капель, чтобы получить задержку падения 25 ± 5 и иметь возможность четко визуализировать точку отрыва капли. Нажмите кнопку «Поддерживать ».
10. Выберите трубку в качестве типа вывода сортировки. Поместите держатель пробирки объемом 15 мл в камеру сортировки. Включите напряжение пластины и установите напряжение пластины примерно на 4000 В.
11. Включите тестовый шаблон, нажав кнопку Настройка потока . Отрегулируйте ползунок фазы заряда и ползунок отклонения, чтобы убедиться, что изображение потока совпадает со сборной трубкой. Нажмите кнопку «Галочка ».
12. Войдите в рабочую станцию Summit на компьютере. Создайте новый протокол в главном меню Файл. Создайте точечную диаграмму, выбрав вкладку «Гистограмма » на панели управления программным обеспечением Summit.
13. Щелкните правой кнопкой мыши оси нового точечного графика в рабочей области и выберите FSC в качестве параметра оси X и SSC в качестве параметра оси Y. Представьте FSC и SSC в логарифмической форме.
14. Перейдите на вкладку «Приобретение » и найдите панель параметров сбора. Включите все сигналы в подменю включения параметров. Выберите FSC в качестве параметра триггера и установите пороговое значение 0,01. Отрегулируйте напряжение и коэффициент усиления FSC и SSC на 250 и 0,6, чтобы обеспечить разделение событий на графике FSC и SSC и популяциях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка порога эквивалентна установке размера частиц, которые могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии. Чем больше порог, тем крупнее будут обнаруженные частицы, а мелкие частицы будут отсечены порогом и не могут быть обнаружены. В этом методе порог установлен равным 0,01, поэтому все частицы, превышающие электронный шум, могут быть обнаружены.

4. Изоляция sEV

1. Разбавляют флуоресцентные полистирольные микросферы до суспензий 100 нм, 200 нм и 300 нм. Добавьте 1 мкл микросфер в 1 мл двойной дистиллированной воды.
2. Последовательно загружайте суспензию микросферы. Выберите «Пуск » в меню приобретения программного обеспечения для саммитов и запишите 20 000 событий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество событий не является обязательным. Для достижения статистической значимости рекомендуется не менее 5 000 событий.
3. Щелкните правой кнопкой мыши точечный график FSC и SSC, чтобы создать прямоугольники, и перетащите их, чтобы изменить размер и положение областей электронного шума и популяции микросферы 100 нм. Щелкните правой кнопкой мыши регионы, чтобы переименовать их в R7 и R4 соответственно. Повторите описанные выше шаги, чтобы последовательно обрамить микросферы 200 нм и 300 нм прямоугольниками и переименовать их в R5 и R6 соответственно.
4. Наконец, определите область сортировки 50-200 нм на основе электронного шума и положения частиц 200 нм, определяемого как R8.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нижний предел обнаружения 50 нм расположен чуть выше электронного шума сортировщика проточных ячеек. Таким образом, область между шумом и популяцией микросфер с длиной волны 200 нм может быть определена как находящаяся в диапазоне от 50 до 200 нм.
5. Редактируйте решения о сортировке на панели логики сортировки и статистики. Дважды щелкните по пустому полю левого (L1) потока. Выберите область с именем R8 , чтобы создать логику сортировки. Выберите режим чистоты «Прервать » и выберите оболочкой капель 1 капля для потока L1.
6. Загрузите 500 мкл образца смеси электромобилей из шага 2.3. Нажмите кнопку « Пуск» в меню сбора данных в Summit, чтобы получить данные, а затем нажмите « Пуск » в меню сортировки, чтобы собрать 50–200 нм sEV в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная среда необходима для минимизации загрязнения во время любой процедуры.
7. Наблюдайте присутствие sEV с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM) и проверяйте размер частиц sEV с помощью NTA. Проведите анализ вестерн-блоттинга (WB) для дальнейшего подтверждения экспрессии маркеров CD9, CD63 и CD81¹⁸.

Результаты

Блок-схема экспериментального протокола показана на рисунке 1. В этом методе в качестве эталонов для распределения частиц по размерам использовались полистирольные микросферы стандартного размера. При определенных инструментальных параметрах сигнал частицы можно бы...

Обсуждение

В этом протоколе описывается оптимизированный метод выделения и очистки sEV с заданным размером частиц 50-200 нм с использованием сортировщика проточных ячеек, который был проверен NTA. Метод решил проблему узкого места получения sEV с однородным размером частиц и высокой чистотой, избегая и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI