Optimisation des paramètres de tri cytométrique en flux pour l’isolation et la purification à haut débit de petites vésicules extracellulaires

Résumé

Ce protocole fournit une méthode d’isolation rapide et spécifique à la taille pour les petites vésicules extracellulaires en optimisant la taille de la buse de pulvérisation d’air, la pression du fluide de gaine, la pression d’écoulement de l’échantillon, la tension, le gain et les paramètres de seuil de déclenchement.

Résumé

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) peuvent être libérées de tous les types de cellules et transporter des protéines, de l’ADN et de l’ARN. Les molécules de signalisation servent d’indicateurs de l’état physiologique et pathologique d’une cellule. Cependant, il n’existe pas de méthode standard pour l’isolement des EV, ce qui empêche l’identification des biomarqueurs en aval et les études d’intervention médicamenteuse. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolation et la purification de 50-200 nm sEV par un trieur de cellules d’écoulement. Pour cela, une buse de 50 μm et une pression de fluide de gaine de 80 psi ont été sélectionnées pour obtenir un bon taux de tri et un flux latéral stable. Des microsphères de polystyrène de taille standard ont été utilisées pour localiser des populations de particules de 100, 200 et 300 nm. Avec une optimisation supplémentaire du seuil de déclenchement de la tension, du gain et de la diffusion directe (FSC), le signal sEV pourrait être séparé du bruit de fond. Ces optimisations fournissent un panel de paramètres de tri critiques qui permet d’obtenir une population représentative de sEV en utilisant uniquement FSC vs diffusion latérale (SSC). La méthode d’isolation basée sur la cytométrie en flux permet non seulement une analyse à haut débit, mais permet également une classification synchrone ou une analyse protéome de sEV basée sur l’expression du biomarqueur, ouvrant de nombreuses applications de recherche en aval.

Introduction

Une cellule libère des vésicules extracellulaires (VE) de différentes tailles qui entraînent des molécules de signalisation et des inclusions membranaires, ce qui est important pour la communication intercellulaire¹. Les VE de différentes tailles jouent également différents rôles biologiques, avec 50-200 nm sEV pouvant distribuer avec précision l’ARN, l’ADN et les protéines au bon emplacement extracellulaire. Le sEV aide également à déterminer leurs mécanismes de sécrétion, impliquant non seulement la régulation des processus physiologiques normaux tels que la surveillance immunitaire, le maintien des cellules souches, la coagulation sanguine et la réparation des tissus, mais aussi la pathologie sous-jacente à plusieurs maladies telles que la progression tumorale et les métastases ^2,3. L’isolement et l’analyse efficaces de la sEV sont essentiels pour identifier les biomarqueurs et concevoir de futures interventions médicamenteuses.

Avec la recherche continue sur l’application clinique de sEV, les méthodes d’isolement de sEV ont mis en avant des exigences plus élevées. En raison de l’hétérogénéité des EV en termes de taille, de source et de contenu, ainsi que de leur similitude avec d’autres EV dans les propriétés physico-chimiques et biochimiques, il n’existe pas de méthode standard pour l’isolement des EV ^4,5. Actuellement, l’ultracentrifugation, la chromatographie d’exclusion de taille (SEC), la précipitation par polymère et la capture d’immunoaffinité sont les méthodes d’isolation sEV les plus courantes⁶. L’ultracentrifugation est toujours l’étalon-or pour l’isolation des EV dans la recherche, bien qu’elle prenne beaucoup de temps, ce qui entraîne une faible pureté avec une large distribution de taille de 40 à 500 nm et des dommages mécaniques importants au sEV après une centrifugation à long terme ^7,8,9. La précipitation des polymères, qui utilise habituellement du polyéthylène glycol (PEG), souffre d’une pureté inacceptable pour l’analyse fonctionnelle ultérieure avec précipitation concomitante d’agrégats de protéines extracellulaires et contamination par les polymères^10,11. Les méthodes basées sur la capture d’immunoaffinité nécessitent des anticorps coûteux avec des spécificités variables, ainsi que des problèmes de faible volume de traitement et de rendements^12,13,14. La taille des particules est l’un des principaux indicateurs pour évaluer la pureté du sEV isolé. Bien que la pureté du sEV reste un objectif inaccessible, la SEC élimine une quantité considérable de composants du milieu, et les particules de sEV extraites par la méthode SEC sont principalement comprises entre 50 et 200 nm¹⁵. Les techniques existantes présentent quelques inconvénients, y compris, mais sans s’y limiter, le fait qu’elles prennent beaucoup de temps, qu’elles soient peu pures, à faible rendement, à faible reproductibilité, à faible débit d’échantillons et à des dommages potentiels de sEV, ce qui les rend incompatibles avec l’utilisation clinique¹⁶. Ainsi, une méthode d’isolation de la SVE rapide, peu coûteuse et de taille spécifiée applicable à divers biofluides est un besoin essentiel dans plusieurs situations cliniques et de recherche.

En cytométrie en flux, les particules uniques sont analysées de manière multiparamétrique à haut débit et les sous-ensembles sont triés¹⁷. En raison de l’hétérogénéité des VE, une mesure cytométrique en flux de particules uniques serait idéale, qui a été utilisée pour étudier les VE suivant les paradigmes de l’analyse cellulaire, avec des marqueurs de diffusion de la lumière et de fluorescence utilisés pour identifier les caractéristiques liées à la physiologie et les composants protéiques^18,19,20. Néanmoins, la cytométrie de flux conventionnelle est remise en question par la petite taille de sEV et la faible abondance de biomarqueurs de surface. La sensibilité de la cytométrie en flux pourrait être améliorée en optimisant les paramètres de détection pour distinguer le bruit de fond et le sEV, indépendamment de l’utilisation du paramètre de déclenchement de la diffusion directe (FSC), de la diffusion latérale (SSC) ou du seuil de fluorescence¹⁹.

Avec le protocole actuel, les paramètres de tri cytométrique en flux à haute résolution ont été optimisés en utilisant des billes fluorescentes en standard. En sélectionnant la taille de buse, la pression du fluide de gaine, le paramètre de déclenchement du seuil et les tensions contrôlant les intensités lumineuses diffusées, nous avons pu isoler un sous-ensemble spécifique de sEV d’un mélange complexe.

Protocole

1. Culture cellulaire

1. Préparer un milieu de culture de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS). Culture de la cellule cancéreuse du pancréas humain, PANC-1, dans une fiole de culture de 75 cm² à une densité de 1 x 10⁶ cellules/mL. Incuber la culture à 37 °C avec 5% de CO₂.
2. Sous-culture des cellules lorsque la densité cellulaire atteint 75%-80% sous observation microscopique. Retirer le milieu et rincer 2x avec 3-5 mL de solution saline tampon phosphate (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4).
3. Jeter la solution, ajouter 1-2 mL de solution trypsine-EDTA et laisser les cellules se détacher jusqu’à ce qu’elles deviennent arrondies et en suspension dans le milieu sous le microscope. Ajouter le milieu frais, aspirer et disperser dans^{75 cm 2} flacons de culture avec 15 ml de milieu de culture. Utilisez un rapport de sous-culture de 1:2 à 1:4 (recommandé).
   REMARQUE : Toutes les opérations sont effectuées dans une enceinte de biosécurité pour éviter la contamination des cellules.

2. Collection de milieux de culture

1. Incuber les cellules pendant 48 h à 37 °C avec 5% de CO₂. Recueillir le surnageant cellulaire (90 mL) dans deux tubes à centrifuger de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
2. Transvaser le surnageant dans de nouveaux tubes stériles et centrifuger successivement à 2 000 x g pendant 20 min, 10 000 x g pendant 30 min et 12 000 x g pendant 70 min à 4 °C.
3. Retirer le surnageant et rincer la pastille avec 10 ml de PBS en pipetant doucement. Centrifuger à 12 000 x g pendant 70 min à 4 °C et remettre la pastille en suspension dans 10 mL de tampon PBS pour obtenir un mélange de VE.
4. Effectuer une analyse de suivi des nanoparticules (NTA) pour quantifier et dimensionner le mélange EV. Effectuer l’analyse NTA conformément au manuel de référence de fonctionnement de l’instrument et à la référence²¹.

3. Tri cellulaire

1. Exécutez la procédure de démarrage standard du trieur de cellules de flux. Allumez l’appareil en appuyant sur le bouton Démarrage . Cliquez sur le bouton Laser Power (Alimentation laser ) sur le panneau de commande laser. Appuyez sur le bouton Change Tanks dans le sous-menu de l’échantillonneur intelligent pour pressuriser le fluidique.
   REMARQUE: Assurez-vous que le réservoir de déchets est vide et que le réservoir de gaine est plein avant de démarrer.
2. Utilisez une buse à jet d’air de 50 μm nettoyée par ultrasons et installez-la sur l’ensemble buse. Ajustez la pression à 80 psi pour le liquide de gaine et à 80,3 psi pour le débit de l’échantillon sur la console de pression.
3. Appuyez sur le bouton Start Sheath Flow (Démarrer le flux de gaine) pour démarrer le flux de gaine. Cliquez sur le bouton Bubble (Bouton Bulle ) dans le sous-menu de l’échantillonneur intelligent pour débuller automatiquement pendant 10 min, puis désactivez-le.
   REMARQUE: Pour le tri des cellules, différentes tailles de buses de pulvérisation d’air nécessitent différentes pressions de fluide de gaine pour maintenir la stabilité de l’écoulement du liquide. Dans cette méthode, une buse de 50 μm a été utilisée, et seule une pression de fluide de gaine supérieure ou égale à 80 psi pouvait générer des flux latéraux stables. La différence de pression entre le débit de l’échantillon et le fluide de la gaine détermine la vitesse de chargement du tri. Dans les conditions de réglage de la méthode (la différence de pression entre le débit de l’échantillon et le fluide de la gaine est de 0,3 à 0,6 psi), le débit de liquide était relativement stable et la vitesse de chargement a permis d’augmenter l’efficacité de tri de 50 % à 80 % pour une différence de pression inférieure à 0,3-0,6 psi.
4. Alignez le flux et déterminez le point laser. Allumez la lumière de la chambre d’éclairage pour voir le flux au-dessus des trous d’épingle. Ajustez les micromètres haut et bas, gauche et droite et avant et arrière pour centrer le flux sur le trou d’épingle et concentrer le flux.
5. Sélectionnez l’onglet Laser and Stream Intercept . Appuyez continuellement sur le bouton Green Arrow lorsque vous y êtes invité pour terminer le processus d’interception laser et d’alignement de la buse.
6. Accédez à l’écran d’alignement laser fin. Sélectionnez le canal 640-722/44 (H) comme paramètre de l’axe X et le canal 405-448/59 (H) comme paramètre de l’axe Y. Appuyez sur le sélecteur de paramètres de déclenchement et choisissez le paramètre SSC du laser 488 nm. Ouvrez tous les volets laser.
   REMARQUE: Les paramètres de l’axe X et de l’axe Y choisis dépendent de la configuration laser du système. D’autres paramètres sont autorisés si le système ne dispose pas d’un laser 640 nm ou 405 nm. Pour de meilleurs résultats, sélectionnez les lasers avec la plus grande séparation spatiale sur la bande de sténopé (sans compter le laser 355 nm).
7. Diluer les particules fluorescentes arc-en-ciel en ajoutant une goutte dans 1 mL d’eau bidistillée pour une concentration finale de 1 x 10⁶ billes par mL. Ouvrez la porte de la chambre d’échantillonnage et chargez un tube des particules fluorescentes arc-en-ciel préparées.
8. Appuyez sur le bouton Démarrer l’échantillon . Ajustez les micromètres haut et bas pour optimiser l’intensité de fluorescence, rendant chaque signal aussi intense que possible. Appuyez sur le bouton Start Quality Control (QC) (Start Quality Control ) (CQ) du panneau de commande de l’écran tactile pour effectuer automatiquement le contrôle qualité.
9. Effectuez un délai de dépôt. Accédez à l’écran de configuration du tri et sélectionnez le bouton de délai de dépôt. Appuyez sur le bouton IntelliSort Initialization . L’instrument ajuste automatiquement la fréquence et l’amplitude de l’oscillation des gouttelettes pour obtenir le délai de chute de 25 ± 5 et pouvoir visualiser clairement le point de rupture de la goutte. Appuyez sur le bouton Maintenir .
10. Sélectionnez tube comme type de sortie de tri. Placez un porte-tube de 15 ml dans la chambre de tri. Allumez la tension de la plaque et réglez la tension de la plaque sur environ 4000 V.
11. Activez le modèle de test en sélectionnant le bouton Configuration du flux . Ajustez le curseur de phase de charge et le curseur de déviation pour vous assurer que l’image du flux est alignée avec le tube de collecte. Sélectionnez le bouton Coche .
12. Connectez-vous au poste de travail Summit sur l’ordinateur. Créez un nouveau protocole à partir du menu principal Fichier. Créez un graphique à points en sélectionnant l’onglet Histogramme dans le panneau de configuration du logiciel Summit.
13. Cliquez avec le bouton droit sur les axes du nouveau diagramme à points dans l’espace de travail et choisissez FSC comme paramètre de l’axe X et SSC comme paramètre de l’axe Y. Présenter le FSC et le SSC sous forme logarithmique.
14. Sélectionnez l’onglet Acquisition et localisez le panneau Paramètres d’acquisition. Activez tous les signaux dans le sous-menu des paramètres d’activation. Choisissez FSC comme paramètre de déclenchement et définissez le seuil de 0,01. Ajustez la tension et le gain de FSC et de SSC à 250 et 0,6 pour s’assurer que les événements dans le graphique FSC par rapport à SSC et les populations sont séparés.
    REMARQUE: Le réglage du seuil équivaut à définir la taille des particules qui peut être détectée par cytométrie en flux. Plus le seuil est grand, plus les particules détectées seront grosses, et les petites particules seront coupées par le seuil et ne pourront pas être détectées. Dans cette méthode, le seuil est fixé à 0,01, de sorte que toutes les particules plus grandes que le bruit électronique peuvent être détectées.

4. Isolement de sEV

1. Diluer les microsphères de polystyrène fluorescent sur des suspensions de 100 nm, 200 nm et 300 nm. Ajouter 1 μL de microsphères à 1 mL d’eau distillée double.
2. Chargez la suspension de microsphère successivement. Sélectionnez Démarrer dans le menu d’acquisition du logiciel Summit et enregistrez 20 000 événements.
   Remarque : Le nombre d’événements est facultatif. Pas moins de 5 000 événements sont recommandés pour répondre à la signification statistique.
3. Faites un clic droit sur le diagramme à points FSC vs SSC pour créer des rectangles et faites glisser pour redimensionner et repositionner les régions de bruit électronique et la population de microsphères de 100 nm. Cliquez avec le bouton droit sur les régions pour les renommer R7 et R4, respectivement. Répétez les étapes ci-dessus pour encadrer successivement les microsphères de 200 nm et 300 nm avec des rectangles et renommez-les respectivement R5 et R6.
4. Enfin, déterminez la région de tri 50-200 nm en fonction du bruit électronique et de la position des particules de 200 nm définies comme R8.
   NOTA: La limite inférieure de détection de 50 nm est placée juste au-dessus du bruit électronique du trieur de cellules d’écoulement. La région entre le bruit et la population de microsphères de 200 nm peut donc être définie comme comprise entre 50 et 200 nm.
5. Modifiez les décisions de tri dans le panneau Logique de tri et statistiques. Double-cliquez sur le champ vide du flux de gauche (L1). Sélectionnez la région nommée R8 pour créer la logique de tri. Choisissez le mode de pureté Abandonner et sélectionnez une enveloppe de gouttelettes de 1 goutte pour le flux L1.
6. Charger 500 μL d’échantillon de mélange de VE de l’étape 2.3. Appuyez sur le bouton Démarrer sous le menu d’acquisition dans Summit pour acquérir des données , puis appuyez sur Démarrer dans le menu de tri pour collecter 50-200 nm sEV dans un tube à centrifuger de 15 mL.
   REMARQUE: Un environnement stérile est nécessaire pour minimiser la contamination pendant toute procédure.
7. Observer la présence de sEV par microscopie électronique à transmission (MET) et vérifier la taille des particules de sEV à l’aide de NTA. Effectuer une analyse par transfert Western (WB) pour confirmer davantage l’expression des marqueurs CD9, CD63 et CD81¹⁸.

Résultats

L’organigramme du protocole expérimental est illustré à la figure 1. Dans cette méthode, des microsphères de polystyrène de taille standard ont été utilisées comme étalons de référence pour la distribution granulométrique. Dans la condition spécifique du paramètre instrumental, le signal de particules a pu être clairement distingué du bruit de fond dans le diagramme FSC vs SSC en utilisant la forme logarithmique. Les stratégies d’établissement de points de contrôle so...

Discussion

Ce protocole décrit une méthode optimisée pour isoler et purifier le sEV avec la taille de particules spécifiée de 50 à 200 nm à l’aide d’un trieur de cellules d’écoulement, qui a été validé par NTA. La méthode a résolu le problème du goulot d’étranglement consistant à obtenir du sEV avec une taille de particules uniforme et une grande pureté, évitant ainsi les interférences de molécules biologiques non apparentées enveloppées dans des VE de grande taille²². Des analy...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI