אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד מהירה וספציפית לגודל עבור בועיות חוץ-תאיות קטנות על ידי מיטוב גודל פיית ריסוס האוויר, לחץ נוזל הנדן, לחץ זרימת הדגימה, מתח, רווח ופרמטרי סף הפעלה.

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV) יכולות להשתחרר מכל סוגי התאים ולשאת חלבון, דנ"א ורנ"א. מולקולות איתות משמשות אינדיקטורים למצב הפיזיולוגי והפתולוגי של התא. עם זאת, אין שיטה סטנדרטית לבידוד sEV, המונעת זיהוי סמנים ביולוגיים במורד הזרם ומחקרי התערבות תרופתית. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיהור של 50-200 ננומטר sEV על ידי ממיין תאי זרימה. לשם כך, נבחרו זרבובית 50 מיקרומטר ולחץ נוזל נדן 80 psi כדי להשיג קצב מיון טוב וזרם צד יציב. מיקרוספרות פוליסטירן בגודל סטנדרטי שימשו לאיתור אוכלוסיות של חלקיקי 100, 200 ו-300 ננומטר. עם מיטוב נוסף של סף הפעלת המתח, הרווח והפיזור הקדמי (FSC), ניתן להפריד את אות ה- sEV מרעשי הרקע. אופטימיזציות אלה מספקות פאנל של הגדרות מיון קריטיות המאפשר לקבל אוכלוסייה מייצגת של sEV באמצעות FSC לעומת פיזור צד (SSC) בלבד. שיטת הבידוד מבוססת ציטומטריית זרימה לא רק מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה, אלא גם מאפשרת סיווג סינכרוני או ניתוח פרוטאום של sEV בהתבסס על ביטוי הסמן הביולוגי, ופותחת יישומי מחקר רבים במורד הזרם.

Introduction

תא משחרר שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) בגדלים שונים שגורמות למולקולות איתות ותכלילי ממברנה, החשובים לתקשורת בין-תאית¹. כלי רכב חשמליים בגדלים שונים ממלאים גם תפקידים ביולוגיים שונים, כאשר 50-200 ננומטר sEV מסוגלים להפיץ במדויק רנ"א, דנ"א וחלבונים למיקום החוץ תאי הנכון. ה- sEV מסייע גם לקבוע את מנגנוני ההפרשה שלהם, הכוללים לא רק את הרגולציה של תהליכים פיזיולוגיים נורמליים כגון מעקב חיסוני, תחזוקת תאי גזע, קרישת דם ותיקון רקמות, אלא גם את הפתולוגיה העומדת בבסיס מספר מחלות כגון התקדמות הגידול וגרורות ^2,3. בידוד וניתוח יעילים של sEV הם קריטיים לזיהוי סמנים ביולוגיים ולתכנון התערבויות עתידיות בתרופות.

עם מחקר מתמשך על היישום הקליני של sEV, שיטות הבידוד של sEV הציבו דרישות גבוהות יותר. בשל ההטרוגניות של sEV בגודל, במקור ובתוכן, כמו גם הדמיון שלהם עם כלי רכב חשמליים אחרים בתכונות פיסיקוכימיות וביוכימיות, אין שיטה סטנדרטית לבידוד sEV ^4,5. נכון לעכשיו, אולטרה-צנטריפוגה, כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC), משקעים פולימריים ולכידת זיקה חיסונית הן שיטות בידוד sEV הנפוצות ביותר⁶. אולטרה-צנטריפוגה היא עדיין תקן הזהב לבידוד sEV במחקר, למרות היותה גוזלת זמן, וכתוצאה מכך טוהר נמוך עם פיזור גודל רחב של 40-500 ננומטר ונזק מכני משמעותי לרכב החשמלי לאחר צנטריפוגה ארוכת טווח ^7,8,9. משקעים פולימריים, אשר בדרך כלל משתמש פוליאתילן גליקול (PEG), סובל טוהר בלתי מתקבל על הדעת עבור ניתוח פונקציונלי לאחר מכן עם משקעים במקביל של אגרגטים חלבונים תאיים וזיהום פולימר^10,11. שיטות מבוססות לכידת זיקה חיסונית דורשות נוגדנים בעלות גבוהה עם ספציפיות משתנה, כמו גם יש בעיות עם נפח עיבוד נמוך ותשואות^12,13,14. גודל החלקיקים הוא אחד המדדים העיקריים להערכת הטוהר של sEV מבודד. למרות שטוהר sEV נותר יעד בלתי ניתן להשגה, SEC מסיר כמות ניכרת של רכיבים בינוניים, וחלקיקי sEV המופקים בשיטת SEC הם בעיקר בטווח של 50-200 ננומטר¹⁵. לטכניקות הקיימות יש כמה חסרונות, כולל אך לא מוגבל להיותן גוזלות זמן, טוהר נמוך, תפוקה נמוכה, יכולת שחזור ירודה, תפוקה נמוכה של דגימות ונזק פוטנציאלי של sEV, מה שהופך אותן ללא תואמות לניצול קליני¹⁶. לפיכך, שיטת בידוד sEV מהירה, זולה ומוגדרת בגודל המתאים לנוזלים ביולוגיים מגוונים היא צורך חיוני במספר מצבים מחקריים וקליניים.

בציטומטריית זרימה, חלקיקים בודדים מנותחים באופן רב-פרמטרי בתפוקה גבוהה, ותת-קבוצות ממוינות¹⁷. בשל ההטרוגניות של כלי רכב חשמליים, מדידה ציטומטרית של זרימה של חלקיק יחיד תהיה אידיאלית, אשר שימשה לחקר כלי רכב חשמליים בעקבות הפרדיגמות של ניתוח תאים, עם תוויות פיזור אור ופלואורסצנטיות המשמשות לזיהוי תכונות הקשורות לפיזיולוגיה ורכיבי חלבון^18,19,20. עם זאת, ציטומטריית זרימה קונבנציונלית מאותגרת על ידי הגודל הקטן של sEV והשפע הנמוך של סמנים ביולוגיים על פני השטח. ניתן לשפר את הרגישות של ציטומטריית זרימה על ידי אופטימיזציה של פרמטרי זיהוי כדי להבחין בין רעשי רקע ו- sEV ללא קשר לשימוש בפיזור קדמי (FSC), פיזור צד (SSC) או פרמטר מפעיל סף פלואורסצנטי¹⁹.

עם הפרוטוקול הנוכחי, הגדרות מיון ציטומטריות זרימה ברזולוציה גבוהה עברו אופטימיזציה באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים כסטנדרט. על ידי בחירת גודל הזרבובית המתאים, לחץ נוזל הנדן, פרמטר הפעלת הסף והמתחים השולטים בעוצמות האור המפוזרות, הצלחנו לבודד תת-קבוצה ספציפית של sEV מתערובת מורכבת.

Protocol

1. תרבית תאים

1. הכינו מדיום תרבית של מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS). תרבית את תא סרטן הלבלב האנושי, PANC-1, בבקבוק תרבית^{בגודל 75} ס"מ 2 בצפיפות של 1 x 10⁶ תאים / מ"ל. לדגור על התרבית ב 37 ° C עם 5% CO₂.
2. תת-תרבית התאים כאשר צפיפות התאים מגיעה ל-75%-80% תחת תצפית מיקרוסקופית. הסר את המדיום ושטוף 2x עם 3-5 מ"ל של מלח חיץ פוספט (PBS; 0.01 M, pH 7.2-7.4).
3. השליכו את התמיסה, הוסיפו 1-2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA, ותנו לתאים להתנתק עד שהם מתעגלים ומרחפים בתווך מתחת למיקרוסקופ. מוסיפים מדיום טרי, שואפים ומפזרים^ל-75 ס"מ 2 צלוחיות תרבית עם מדיום תרבית 15 מ"ל. השתמשו ביחס תת-טיפוח של 1:2 עד 1:4 (מומלץ).
   הערה: כל הפעולות מבוצעות בארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום תאים.

2. אוסף מדיום תרבות

1. לדגור על התאים במשך 48 שעות ב 37 ° C עם 5% CO₂. לאסוף supernatant התא (90 מ"ל) בשני צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
2. העבר את הסופרנאטנט לצינורות סטריליים חדשים ולצנטריפוגות ברצף במהירות של 2,000 x גרם למשך 20 דקות, 10,000 x גרם למשך 30 דקות ו- 12,000 x גרם למשך 70 דקות ב- 4 ° C.
3. מוציאים את הסופרנאטנט ושוטפים את הגלולה עם 10 מ"ל PBS על ידי פיפטינג עדין. צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 70 דקות ב 4 ° C שוב להשהות את הגלולה ב 10 מ"ל של חיץ PBS כדי לקבל תערובת של EVs.
4. בצע ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) כדי לכמת ולשנות את גודל תערובת הרכב החשמלי. ביצוע ניתוח נת"ע בהתאם למדריך הייחוס להפעלת המכשיר והפניה²¹.

3. מיון תאים

1. בצע את הליך ההפעלה הסטנדרטי של סדרן תאי הזרימה. הפעל את ההתקן על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה . לחץ על לחצן הפעלת לייזר בלוח הבקרה של הלייזר. לחץ על הלחצן Change Tanks בתפריט המשנה של הדוגם החכם כדי להפעיל לחץ על הפלואידיקה.
   הערה: ודא שמיכל האשפה ריק ומיכל הנדן מלא לפני ההפעלה.
2. השתמש בפיית סילון באוויר בגודל 50 מיקרומטר שנוקה באולטרסאונד והתקן אותה על מכלול הזרבובית. התאם את הלחץ ל- 80 psi עבור נוזל נדן ו- 80.3 psi עבור זרימת הדגימה במסוף הלחץ.
3. לחץ על הלחצן Start Sheath Flow כדי להתחיל את זרימת הנדן. לחץ על לחצן הבועות בתפריט המשנה של הדוגם החכם כדי לבטל את הבועה באופן אוטומטי למשך 10 דקות ולאחר מכן כבה אותה.
   הערה: עבור מיון תאים, גדלים שונים של חרירי תרסיס אוויר דורשים לחצים שונים של נוזל מעטפת כדי לשמור על יציבות זרימת הנוזל. בשיטה זו נעשה שימוש בפייה של 50 מיקרומטר, ורק לחץ נוזל נדן גדול או שווה ל 80 psi יכול ליצור זרמי צד יציבים. הפרש הלחצים בין זרימת הדגימה לבין נוזל הנדן קובע את מהירות ההעמסה של המיון. בתנאי ההגדרה של השיטה (הפרש הלחצים בין זרימת הדגימה לנוזל הנדן הוא 0.3-0.6 psi), זרימת הנוזל הייתה יציבה יחסית, ומהירות ההעמסה אפשרה ליעילות המיון לעלות ל-80% מ-50% עבור הפרש לחצים קטן מ-0.3-0.6 psi.
4. יישר את הזרם וקבע את נקודת הלייזר. הפעל את אור תא התאורה כדי לראות את הזרם מעל חורי הסיכה. כוונן את המיקרומטרים למעלה ולמטה, משמאל ומימין ומלפנים ומאחור כדי למרכז את הזרם על חור הסיכה ולמקד את הזרם.
5. בחר בכרטיסיה לייזר ויירוט זרם . לחץ על לחצן החץ הירוק ברציפות כפי שתתבקש לעשות כדי להשלים את תהליך כיול יירוט הלייזר ויישור הזרבובית.
6. גש למסך יישור הלייזר העדין. בחר 640-722/44 (H) כפרמטר ציר X וערוץ 405-448/59 (H) כפרמטר ציר Y. לחץ על בורר פרמטרי ההדק ובחר בפרמטר SSC של הלייזר 488 ננומטר. פתחו את כל תריסי הלייזר.
   הערה: הפרמטרים ציר X וציר Y שנבחרו תלויים בתצורת הלייזר של המערכת. פרמטרים אחרים מותרים אם למערכת אין לייזר 640 ננומטר או 405 ננומטר. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, בחר לייזרים עם ההפרדה המרחבית הגדולה ביותר ברצועת חור הסיכה (לא כולל לייזר 355 ננומטר).
7. לדלל את חלקיקי הקשת הפלואורסצנטית על ידי הוספת טיפה אחת לתוך 1 מ"ל של מים מזוקקים כפול לריכוז סופי של 1 x 10⁶ חרוזים למ"ל. פתח את דלת תא הדגימה וטען צינור של חלקיקי הקשת הפלואורסצנטית המוכנים.
8. לחץ על הלחצן Start Sample . כוונן מיקרומטרים למעלה ולמטה כדי למטב את עוצמת הפלואורסצנטיות, ולהפוך כל אות לאינטנסיבי ככל האפשר. לחץ על לחצן התחל בקרת איכות (QC) בלוח הבקרה של מסך המגע כדי לבצע QC באופן אוטומטי.
9. בצע עיכוב נפילה. גש למסך הגדרת המיון ובחר בלחצן השהיית השחרור. לחץ על לחצן IntelliSort Initialization . המכשיר מתאים באופן אוטומטי את התדירות והמשרעת של תנודת הטיפות כדי להשיג את עיכוב הירידה של 25 ± 5 ולהיות מסוגל לדמיין את נקודת השבירה של הטיפה בבירור. לחץ על הלחצן Maintain (תחזוק ).
10. בחר צינור כסוג פלט המיון. הניחו מחזיק צינור בנפח 15 מ"ל בתא המיון. הפעל את מתח הצלחת והגדר את מתח הצלחת לכ- 4000 וולט.
11. הפעל את תבנית הבדיקה על-ידי בחירה בלחצן הגדרת זרם . התאימו את מחוון שלב הטעינה ואת מחוון הסטייה כדי לוודא שתמונת הזרם מסודרת עם צינור האיסוף. בחר בלחצן סמן ביקורת .
12. התחברו לתחנת העבודה Summit במחשב. צור פרוטוקול חדש מהתפריט הראשי קובץ. צור תרשים נקודות על-ידי בחירה בכרטיסייה היסטוגרמה בלוח הבקרה של תוכנת Summit.
13. לחץ לחיצה ימנית על הצירים של התוויית הנקודות החדשה בסביבת העבודה ובחר FSC כפרמטר ציר X ו - SSC כפרמטר ציר Y. הצג את FSC ו- SSC בצורה לוגריתמית.
14. בחר בכרטיסייה Acquisition ואתר את חלונית פרמטרי הרכישה. הפעל את כל האותות בתפריט המשנה של פרמטרים מפעילים. בחר FSC כפרמטר הגורם המפעיל והגדר את הסף של 0.01. התאם את המתח והרווח של FSC ו- SSC ב- 250 ו- 0.6 כדי להבטיח הפרדה בין אירועים בתרשים FSC לעומת SSC ואוכלוסיות.
    הערה: הגדרת סף שקולה להגדרת גודל החלקיק שניתן לזהות באמצעות ציטומטריית זרימה. ככל שהסף גדול יותר, כך החלקיקים שיתגלו יהיו גדולים יותר, והחלקיקים הקטנים ייחתכו על ידי הסף ולא ניתן יהיה לאתר אותם. בשיטה זו, הסף מוגדר ל -0.01, כך שניתן לזהות את כל החלקיקים הגדולים יותר מרעש אלקטרוני.

4. בידוד של sEV

1. דללו את מיקרוספרות הפוליסטירן הפלואורסצנטיות לתרחיפים של 100 ננומטר, 200 ננומטר ו-300 ננומטר. הוסף 1 μL של microspheres 1 מ"ל של מים מזוקקים כפול.
2. טען את מתלה המיקרספירה. בחר התחל בתפריט הרכישה של תוכנת Summit והקליט 20,000 אירועים.
   הערה: מספר האירועים הוא אופציונלי. לא פחות מ-5,000 אירועים מומלצים כדי לעמוד במובהקות סטטיסטית.
3. לחץ לחיצה ימנית על תרשים הנקודות FSC לעומת SSC כדי ליצור מלבנים וגרור כדי לשנות גודל ולמקם מחדש את אזורי הרעש האלקטרוני ואוכלוסיית המיקרספירה של 100 ננומטר. לחץ לחיצה ימנית על האזורים כדי לשנות את שמם ל- R7 ו- R4, בהתאמה. חזור על השלבים לעיל כדי למסגר את המיקרוספרות של 200 ננומטר ו- 300 ננומטר עם מלבנים ברצף ושנה את שמם ל- R5 ו- R6, בהתאמה.
4. לבסוף, קבע את אזור המיון של 50-200 ננומטר בהתבסס על הרעש האלקטרוני והמיקום של חלקיקי 200 ננומטר המוגדרים כ- R8.
   הערה: מגבלת הזיהוי התחתונה של 50 ננומטר ממוקמת בדיוק מעל הרעש האלקטרוני של ממיין תאי הזרימה. לפיכך, ניתן להגדיר את האזור שבין הרעש לבין אוכלוסיית המיקרספרת של 200 ננומטר כנע בין 50 ל-200 ננומטר.
5. ערוך החלטות מיון בחלונית 'לוגיקת מיון' ו'סטטיסטיקה'. לחץ פעמיים על השדה הריק של זרם אחד (L1) השמאלי. בחר את האזור בשם R8 כדי ליצור את לוגיקת המיון. בחר את מצב הטוהר בטל ובחר מעטפת טיפה של טיפה אחת עבור זרם L1.
6. טען דגימה של 500 μL של תערובת כלי רכב חשמליים משלב 2.3. לחץ על לחצן התחל תחת תפריט הרכישה ב- Summit כדי לקבל נתונים, ולאחר מכן לחץ על התחל בתפריט המיון כדי לאסוף sEV של 50-200 ננומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
   הערה: סביבה סטרילית נחוצה כדי למזער זיהום במהלך כל הליך.
7. שימו לב לנוכחות של sEV על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) וודאו את גודל החלקיקים של sEV באמצעות NTA. בצע ניתוח כתם מערבי (WB) כדי לאשר עוד יותר את הביטוי של סמני CD9, CD63 ו- CD81¹⁸.

תוצאות

דיאגרמת תרשים הזרימה של פרוטוקול הניסוי מוצגת באיור 1. בשיטה זו, מיקרוספרות פוליסטירן בגודל סטנדרטי שימשו כתקני ייחוס להתפלגות גודל חלקיקים. תחת תנאי הפרמטר האינסטרומנטלי הספציפי, ניתן היה להבחין בבירור בין אות החלקיקים לרעשי הרקע בתרשים FSC לעומת SSC באמצעות הצורה הלוגריתמ...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית לבידוד וטיהור sEV עם גודל החלקיקים שצוין של 50-200 ננומטר באמצעות ממיין תאי זרימה, שאומת על ידי נת"ע. השיטה פתרה את בעיית צוואר הבקבוק של קבלת sEV עם גודל חלקיקים אחיד וטוהר גבוה, תוך הימנעות מהפרעות של מולקולות ביולוגיות לא קשורות עטופות ברכבים חשמליים גדולים

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI