Cultivo a largo plazo y monitorización de Caenorhabditis elegans aislada en medios sólidos en dispositivos multipocillos

Resumen

Aquí se presenta un protocolo optimizado para cultivar nematodos individuales aislados en medios sólidos en dispositivos microfabricados de múltiples pocillos. Este enfoque permite que los animales individuales sean monitoreados a lo largo de sus vidas para una variedad de fenotipos relacionados con el envejecimiento y la salud, incluida la actividad, el tamaño y la forma del cuerpo, la geometría del movimiento y la supervivencia.

Resumen

El nematodo Caenorhabditis elegans se encuentra entre los sistemas modelo más comunes utilizados en la investigación del envejecimiento debido a sus técnicas de cultivo simples y económicas, ciclo de reproducción rápido (~ 3 días), vida útil corta (~ 3 semanas) y numerosas herramientas disponibles para la manipulación genética y el análisis molecular. El enfoque más común para realizar estudios de envejecimiento en C. elegans, incluido el análisis de supervivencia, implica cultivar poblaciones de decenas a cientos de animales juntos en medios sólidos de crecimiento de nematodos (NGM) en placas de Petri. Si bien este enfoque recopila datos sobre una población de animales, la mayoría de los protocolos no rastrean animales individuales a lo largo del tiempo. Aquí se presenta un protocolo optimizado para el cultivo a largo plazo de animales individuales en dispositivos microfabricados de polidimetilsiloxano (PDMS) llamados WorMotels. Cada dispositivo permite cultivar hasta 240 animales en pequeños pozos que contienen NGM, con cada pozo aislado por un foso que contiene sulfato de cobre que evita que los animales huyan. Sobre la base de la descripción original de WorMotel, este documento proporciona un protocolo detallado para moldear, preparar y rellenar cada dispositivo, con descripciones de complicaciones técnicas comunes y consejos para la resolución de problemas. Dentro de este protocolo se encuentran técnicas para la carga consistente de NGM de pequeño volumen, el secado consistente tanto del NGM como de los alimentos bacterianos, opciones para administrar intervenciones farmacológicas, instrucciones y limitaciones prácticas para reutilizar dispositivos PDMS y consejos para minimizar la desecación, incluso en ambientes de baja humedad. Esta técnica permite el monitoreo longitudinal de varios parámetros fisiológicos, incluida la actividad estimulada, la actividad no estimulada, el tamaño corporal, la geometría del movimiento, la duración de la salud y la supervivencia, en un entorno similar a la técnica estándar para el cultivo grupal en medios sólidos en placas de Petri. Este método es compatible con la recopilación de datos de alto rendimiento cuando se utiliza junto con software automatizado de microscopía y análisis. Finalmente, se discuten las limitaciones de esta técnica, así como una comparación de este enfoque con un método recientemente desarrollado que utiliza microbandejas para cultivar nematodos aislados en medios sólidos.

Introducción

Caenorhabditis elegans se usa comúnmente en estudios de envejecimiento debido a su corto tiempo de generación (aproximadamente 3 días), corta vida útil (aproximadamente 3 semanas), facilidad de cultivo en el laboratorio, alto grado de conservación evolutiva de procesos moleculares y vías con mamíferos y amplia disponibilidad de técnicas de manipulación genética. En el contexto de los estudios de envejecimiento, C. elegans permite la rápida generación de datos de longevidad y poblaciones envejecidas para el análisis de fenotipos tardíos en animales vivos. El enfoque típico para realizar estudios de envejecimiento de gusanos consiste en medir manualmen....

Protocolo

1. Preparación de soluciones madre y medios

NOTA: Antes de comenzar la preparación de los dispositivos multipocillos, prepare las siguientes soluciones y medios de stock.

1. Soluciones madre para medios de crecimiento de nematodos (NGM) y NGM de bajo punto de fusión (lmNGM):
   1. Prepare 1 M K 2 HPO₄: Agregue 174.18 g de K₂HPO4 auna botella de 1 L y llénela hasta 1 L con agua desionizada estéril. Conservar en autoclave (121 °C, 15 psig) durante 30 min y conservar a temperatura ambiente (RT).
   2. Preparar 1 M KP_i, pH 6.0: Añadir 136,09 g de KH₂HPO_{4 <....}

Resultados

El sistema de cultivo WorMotel se puede utilizar para recopilar una variedad de datos, incluso sobre la vida útil, la duración de la salud y la actividad. Los estudios publicados han utilizado dispositivos de múltiples pocillos para estudiar la esperanza de vida y la duración de la salud 13,14, la quietud y el sueño 22,23,24^, y el comportamiento ²⁵.

Discusión

El sistema WorMotel es una poderosa herramienta para recopilar datos individualizados para cientos de C. elegans aislados a lo largo del tiempo. Después de los estudios anteriores que utilizaron dispositivos de múltiples pocillos para aplicaciones en la inactividad del desarrollo, el comportamiento locomotor y el envejecimiento, el objetivo de este trabajo fue optimizar la preparación de dispositivos de pocillos múltiples para el monitoreo a largo plazo de la actividad, la salud y la vida útil de una manera.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5 lb weight	CAP Barbell	RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)	Falken Design	ACRYLIC-CL-3-8/1224	Large sheet cut to smaller sizes
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Autoclavable squeeze bottle	Nalgene	2405-0500
Bacto agar	BD Difco	214030
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
Basin, 25 mL	VWR	89094-664	Disposable pipette basin
Cabinet style vacuum desiccator	SP Bel-Art	F42400-4001	Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.
CaCl2	Acros Organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	GoldBio	C-103-25
Centrifuge	Beckman	360902
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Compressed oxygen tank	Airgas	UN1072
CuSO4	Fisher Chemical	C493-500
Dry bead bath incubator	Fisher Scientific	11-718-2
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Floxuridine	Research Products International	F10705-1.0
Hybridization oven	Techne	731-0177	Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators	Shel Lab	2020	20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
KH2PO4	Fisher Chemical	P286-1
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Low melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
Microwave	Sharp	R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3	Rainin	17013800	The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl	Fisher Bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray	Thermo Scientific	264728	Clear polystyrene trays
Parafilm M	Fisher Scientific	13-374-10	Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM	VWR	25384-342
Petri plate, 60 mM	Fisher Scientific	FB0875713A
Plasma cleaner	Plasma Etch, Inc.	PE-50
PLATINUM vacuum pump	JB Industries	DV-142N
PolyJet 3D printer	Stratasys	Objet500 Connex3	PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator	Lab-Line	3526CC
smartSpatula	LevGo, Inc.	17211	Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)	M2 Polymer Technologies	Type S	Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base	The Dow Chemical Company	2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent	The Dow Chemical Company	2085925
Syringe filter (0.22 µm)	Nest Scientific USA Inc.	380111
Syringe, 10 mL	Fisher Scientific	14955453
TWEEN 20	Thermo Scientific	J20605-AP	Detergent
Vacuum pump oil	VWR	54996-082
VeroBlackPlus	Stratasys	RGD875	Rigid 3D printing filament
Weigh boat	Thermo Scientific	WB30304	Large enough for PDMS mixture volume