Cultura de Longa Duração e Monitoramento de Caenorhabditis elegans Isolados em Meio Sólido em Dispositivos Multipoços

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo otimizado para o cultivo de nematoides individuais isolados em meios sólidos em dispositivos microfabricados de múltiplos poços. Essa abordagem permite que animais individuais sejam monitorados ao longo de suas vidas para uma variedade de fenótipos relacionados ao envelhecimento e à saúde, incluindo atividade, tamanho e forma corporal, geometria do movimento e sobrevivência.

Resumo

O nematoide Caenorhabditis elegans está entre os sistemas modelo mais comuns usados na pesquisa do envelhecimento devido às suas técnicas de cultura simples e baratas, ciclo de reprodução rápido (~3 dias), curta vida útil (~3 semanas) e inúmeras ferramentas disponíveis para manipulação genética e análise molecular. A abordagem mais comum para a realização de estudos de envelhecimento em C. elegans, incluindo análise de sobrevivência, envolve o cultivo de populações de dezenas a centenas de animais em conjunto em meios de crescimento de nematoides sólidos (NGM) em placas de Petri. Embora essa abordagem reúna dados sobre uma população de animais, a maioria dos protocolos não rastreia animais individuais ao longo do tempo. Apresentamos aqui um protocolo otimizado para o cultivo a longo prazo de animais individuais em dispositivos microfabricados de polidimetilsiloxano (PDMS) chamados WorMotels. Cada dispositivo permite que até 240 animais sejam cultivados em pequenos poços contendo NGM, com cada poço isolado por um fosso contendo sulfato de cobre que impede a fuga dos animais. Com base na descrição original do WorMotel, este documento fornece um protocolo detalhado para moldar, preparar e preencher cada dispositivo, com descrições de complicações técnicas comuns e conselhos para solução de problemas. Dentro desse protocolo estão técnicas para o carregamento consistente de NGM de pequeno volume, a secagem consistente tanto da NGM quanto do alimento bacteriano, opções para a realização de intervenções farmacológicas, instruções e limitações práticas para a reutilização de dispositivos PDMS e dicas para minimizar a dessecação, mesmo em ambientes de baixa umidade. Essa técnica permite o monitoramento longitudinal de vários parâmetros fisiológicos, incluindo atividade estimulada, atividade não estimulada, tamanho corporal, geometria do movimento, tempo de saúde e sobrevivência, em um ambiente semelhante à técnica padrão para cultura de grupo em meios sólidos em placas de Petri. Este método é compatível com a coleta de dados de alto rendimento quando usado em conjunto com software de microscopia e análise automatizados. Finalmente, as limitações desta técnica são discutidas, bem como uma comparação desta abordagem com um método recentemente desenvolvido que utiliza microbandejas para cultura de nematoides isolados em meio sólido.

Introdução

Caenorhabditis elegans são comumente usados em estudos de envelhecimento devido ao seu curto tempo de geração (aproximadamente 3 dias), curta expectativa de vida (aproximadamente 3 semanas), facilidade de cultivo em laboratório, alto grau de conservação evolutiva de processos moleculares e vias com mamíferos, e ampla disponibilidade de técnicas de manipulação genética. No contexto dos estudos de envelhecimento, C. elegans permite a geração rápida de dados de longevidade e populações envelhecidas para a análise de fenótipos tardios em animais vivos. A abordagem típica para a realização de estudos de envelhecimento de vermes envolve a medição manual da....

Protocolo

1. Preparação de soluções e suportes de stock

NOTA: Antes de iniciar a preparação dos dispositivos multipoços, prepare as seguintes soluções de estoque e mídias.

1. Soluções estoque para meios de crescimento de nematoides (NGM) e NGM de baixa fusão (lmNGM):
   1. Prepare 1 M K 2 HPO₄: Adicione 174,18 g de K₂HPO4 aum frasco de 1 L e encha-o até 1 L com água deionizada estéril. Autoclave (121 °C, 15 psig) por 30 min, e armazenar em temperatura ambiente (TR).
   2. Prepare 1 M KP_i, pH 6,0: Adicione 136,09 g de KH₂HPO₄ a um frasco de 1 L e encha-o at....

Resultados

O sistema de cultura WorMotel pode ser usado para reunir uma variedade de dados, incluindo sobre tempo de vida, saúde e atividade. Estudos publicados têm utilizado dispositivos multipoços para estudar a expectativa de vida e a expectativa de vida^13,14, a quiescência e o sono 22,23,24 e o comportamento ²⁵. A vida útil pode ser pontuada manualm.......

Discussão

O sistema WorMotel é uma ferramenta poderosa para coletar dados individualizados para centenas de C. elegans isolados ao longo do tempo. Seguindo os estudos anteriores usando dispositivos multipoços para aplicações em quiescência de desenvolvimento, comportamento locomotor e envelhecimento, o objetivo deste trabalho foi otimizar a preparação de dispositivos multipoços para o monitoramento de longo prazo da atividade, saúde e vida útil de uma maneira de maior rendimento. Este trabalho fornece um protoco.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5 lb weight	CAP Barbell	RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)	Falken Design	ACRYLIC-CL-3-8/1224	Large sheet cut to smaller sizes
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Autoclavable squeeze bottle	Nalgene	2405-0500
Bacto agar	BD Difco	214030
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
Basin, 25 mL	VWR	89094-664	Disposable pipette basin
Cabinet style vacuum desiccator	SP Bel-Art	F42400-4001	Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.
CaCl2	Acros Organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	GoldBio	C-103-25
Centrifuge	Beckman	360902
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Compressed oxygen tank	Airgas	UN1072
CuSO4	Fisher Chemical	C493-500
Dry bead bath incubator	Fisher Scientific	11-718-2
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Floxuridine	Research Products International	F10705-1.0
Hybridization oven	Techne	731-0177	Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators	Shel Lab	2020	20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
KH2PO4	Fisher Chemical	P286-1
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Low melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
Microwave	Sharp	R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3	Rainin	17013800	The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl	Fisher Bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray	Thermo Scientific	264728	Clear polystyrene trays
Parafilm M	Fisher Scientific	13-374-10	Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM	VWR	25384-342
Petri plate, 60 mM	Fisher Scientific	FB0875713A
Plasma cleaner	Plasma Etch, Inc.	PE-50
PLATINUM vacuum pump	JB Industries	DV-142N
PolyJet 3D printer	Stratasys	Objet500 Connex3	PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator	Lab-Line	3526CC
smartSpatula	LevGo, Inc.	17211	Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)	M2 Polymer Technologies	Type S	Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base	The Dow Chemical Company	2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent	The Dow Chemical Company	2085925
Syringe filter (0.22 µm)	Nest Scientific USA Inc.	380111
Syringe, 10 mL	Fisher Scientific	14955453
TWEEN 20	Thermo Scientific	J20605-AP	Detergent
Vacuum pump oil	VWR	54996-082
VeroBlackPlus	Stratasys	RGD875	Rigid 3D printing filament
Weigh boat	Thermo Scientific	WB30304	Large enough for PDMS mixture volume