Visualización de metabolitos identificados en el metaboloma espacial de la medicina tradicional china utilizando DESI-MSI

Resumen

En este estudio, se presentan una serie de métodos para preparar muestras DESI-MSI de plantas, y se describe en detalle un procedimiento de instalación de ensamblaje DESI, adquisición de datos MSI y procesamiento. Este protocolo se puede aplicar en varias condiciones para adquirir información de metaboloma espacial en plantas.

Resumen

El uso medicinal de la medicina tradicional china se debe principalmente a sus metabolitos secundarios. La visualización de la distribución de estos metabolitos se ha convertido en un tema crucial en la ciencia de las plantas. Las imágenes de espectrometría de masas pueden extraer grandes volúmenes de datos y proporcionar información de distribución espacial sobre estos mediante el análisis de cortes de tejido. Con la ventaja de un alto rendimiento y una mayor precisión, las imágenes de espectrometría de masas de ionización por electrospray de desorción (DESI-MSI) se utilizan a menudo en la investigación biológica y en el estudio de la medicina tradicional china. Sin embargo, los procedimientos utilizados en esta investigación son complicados y no asequibles. En este estudio, optimizamos los procedimientos de seccionamiento e imágenes DESI y desarrollamos un método más rentable para identificar la distribución de metabolitos y categorizar estos compuestos en tejidos vegetales, con un enfoque especial en las medicinas tradicionales chinas. El estudio promoverá la utilización de DESI en el análisis de metabolitos y la estandarización de la medicina tradicional china / medicina étnica para tecnologías relacionadas con la investigación.

Introducción

La visualización de la distribución de metabolitos se ha convertido en un tema crucial en la ciencia de las plantas, especialmente en la medicina tradicional china, ya que revela el proceso de formación de metabolitos específicos dentro de la planta. Con referencia a la medicina tradicional china (MTC), proporciona información sobre los componentes activos y guía la aplicación de partes de plantas en aplicaciones farmacéuticas. Normalmente, la visualización de metabolitos se logra mediante hibridación in situ, microscopía de fluorescencia o inmunohistoquímica, sin embargo, el número de compuestos detectados por estos experimentos transmite información química limitada. Combinadas con la tinción tisular, las imágenes por espectrometría de masas (MSI) pueden proporcionar una gran cantidad de datos y proporcionar información de distribución espacial de compuestos mediante el escaneo y análisis de cortes de tejido a nivel de micras¹. MSI utiliza analitos para la desorción e ionización de la superficie de la muestra, seguido de un análisis de masa de los iones de fase de vapor resultantes y la aplicación de software de imágenes para integrar la información y trazar una imagen bidimensional que registra una abundancia de iones específica. Esta tecnología puede determinar moléculas exógenas y endógenas mediante la detección de la distribución característica de los fármacos y sus metabolitos inducidos en los tejidos y órganos diana 2,3,4,5.

En las últimas décadas se han desarrollado varias modalidades de imágenes de EM; los más destacados entre ellos son el MSI basado en ionización por electrospray de desorción (desi-MSI), la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) y la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS)⁶. DESI-MSI se utiliza a menudo en la investigación biológica debido a su funcionamiento atmosférico, alto rendimiento y mayor precisión⁷. MALDI se ha aplicado para identificar un fragmento de transtiretina como un potencial biomarcador nefrotóxico para gentamicina y para analizar la distribución del metabolito neurotóxico 1-metil-4-fenilpiridinio después del manejo de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina en cerebros de ratones ^8,9. MALDI y DESI se han utilizado para determinar la composición de estructuras cristalinas inducidas por fármacos en el riñón de conejos dosificados; Estas estructuras están compuestas principalmente por metabolitos formados debido a la desmetilación y/u oxidación del fármaco¹⁰. Además, MSI se ha aplicado en la localización de la distribución metabólica de la toxicidad del fármaco en órganos diana. Sin embargo, las células en el tejido vegetal varían y son diferentes de los animales y requieren procedimientos especiales de seccionamiento.

En plantas, mediante el uso de imágenes MALDI, hasta el momento, se ha analizado la distribución de diferentes compuestos en el tallo del trigo (Triticum aestivum), las semillas de soja (Glycine max), arroz (Oryza sativa), las flores y raíces de Arabidopsis thaliana y las semillas de cebada (Hordeum vulgare) 11,12,13,14,15,16,17,18 . Estudios recientes han informado que DESI-MSI está emergiendo en el análisis de metabolitos de medicamentos y productos naturales, especialmente en MTC como Ginkgo biloba, Fuzi y Artemisia annua L 19,20,21. En estos estudios, los protocolos para la preparación de muestras de material vegetal difieren, y algunos requieren equipos más complejos, como un micrótomo de congelación. DESI-MSI tiene requisitos estrictos para la planitud superficial de la muestra detectada. Cuando se analiza el órgano o tejido de un animal, la muestra generalmente se realiza mediante criosección²². Sin embargo, el procedimiento para la criosección es complicado y más costoso, y el método de temperatura óptima de corte (OCT) del adhesivo comúnmente utilizado tiene una señal fuerte cuando se toman imágenes. Además, los tejidos medicinales de la MTC varían; por ejemplo, la raíz de Salvia miltiorrhiza, conocida como Danshen en chino, se usa medicinalmente, mientras que en Zisu (Perilla frutescens), la hoja se usa^23,24. Por lo tanto, es necesario mejorar los procedimientos de preparación de muestras para promover la utilización de DESI en el análisis de metabolitos para la MTC.

Como hierba perenne y una MTC de uso común, S. miltiorrhiza se registró inicialmente en la monografía de medicina más antigua, Shennong's Classic of Materia Medica (conocida como Shennong Bencao Jing en chino). En este estudio, optimizamos los procedimientos de seccionamiento e imagen DESI y desarrollamos un método más rentable para identificar la distribución y categorizar los compuestos en tejidos de S. miltiorrhiza. Este método también puede superar las desventajas asociadas con los tejidos secos, que generalmente se fracturan fácilmente bajo el golpe de nitrógeno, y promover el desarrollo de la MTC. El estudio promoverá la estandarización de la medicina tradicional china y étnica para las tecnologías relacionadas con la investigación.

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Recoja las raíces y hojas limpias de una planta de Salvia miltiorrhiza de 2 años (Figura 1A) y corte directamente a mano a un espesor de sección transversal de aproximadamente 3-5 mm. Luego, pegue la muestra en un portaobjetos de vidrio de microscopio de adhesión con cinta adhesiva de doble cara (Figura 1B).
   NOTA: Asegúrese de que el tamaño de la cinta de doble cara sea mayor que el de la muestra. Si los tejidos están secos, sumérjalos en agua o paraformaldehído al 4% durante la noche antes de cortarlos.
2. Coloque otro portaobjetos de vidrio de microscopio sobre la muestra y envuelva los dos portaobjetos de vidrio con una película de sellado como un sándwich (Figura 1C). Congelar la muestra sándwich a -80 °C durante al menos 4 h, luego someterla a un vacío de aire durante 2 h (Figura 1D) con los siguientes parámetros de ajuste: temperatura de la trampa a -75 a -82 °C y manómetro de vacío a 2,5 a 3,7 Pa.
   NOTA: Asegúrese de que los dos portaobjetos de vidrio estén paralelos al envolver la película de sellado para mantener intacta la superficie de la muestra. Si los tejidos vegetales tienen un alto contenido de humedad, extienda el tiempo de vacío de aire a 3 h. No exceda las 5 h, de lo contrario los tejidos se fracturarán fácilmente.
3. Conservar las muestras sándwich a -80 °C hasta su análisis. Lleve las muestras a temperatura ambiente en un desecador para evitar la condensación en la superficie de la muestra. A continuación, someta la muestra a la aplicación matricial.

2. Instalación de la unidad de ionización por electrospray de desorción (DESI)

1. Implementar la configuración del detector y la calibración de masa del instrumento en modo ESI; llevar a cabo la configuración del detector utilizando leucina encefalina (LE) en solución de agua-acetonitrilo (1:1 v/v) y realizar calibración de masa con formiato de sodio (NaFA) en solución de isopropanol en agua (1:1 v/v).
2. Saque la fuente ESI y monte la unidad DESI en el espectrómetro de masas. Conecte el suministro de gas N₂ a la unidad DESI y ajuste la presión del gas a alrededor de 0,5 MPa (Figura 2A). No hay necesidad de ventilar el instrumento al intercambiar fuentes.
3. Llene la jeringa de 5 ml con LE y ácido fórmico en solución de agua-metanol (1:9 v/v) y conecte la jeringa a la bomba de jeringa de alto rendimiento para proporcionar disolvente para la ionización de los productos químicos en la muestra (Figura 2B).
4. Conecte un disolvente que proporcione capilar a la jeringa y al pulverizador DESI (Figura 2C). El disolvente que proporciona capilar es un capilar interno estándar de 75 μm de diámetro interno y 375 μm de diámetro exterior; es bastante estrecho y se bloquea fácilmente por impurezas, por lo tanto, los disolventes utilizados en los procesos de escaneo deben ser de grado MS y filtrados antes de su uso para reducir el riesgo de bloqueo.
5. Arranque la bomba de la jeringa y ajuste la velocidad de infusión a 2 μL/min para obtener un flujo constante y la pulverización del disolvente (Figura 2B). Cierre la válvula de gas N₂ , luego de aproximadamente 15 s enciéndala; Se expulsará una pequeña gota de disolvente sobre el escenario, y se puede ver el rocío si el flujo de disolvente está en un estado constante.
6. Ajuste la posición del pulverizador en términos del ángulo de pulverización, el eje XYZ, la protuberancia y la altura (Figura 2D). Utilice marcadores rojos y negros como referencias para optimizar la señal de espectrometría de masas, para obtener una intensidad de señal superior a 1 x 10⁵ en modo de sensibilidad (Figura 2E).
   1. La protrusión del pulverizador es el factor más importante que afecta la intensidad de la señal; ajuste la protuberancia cambiando el protector de gas N₂ con una llave de 5 mm. La dirección de pulverización influye en la calidad de la imagen de masa; Gire el pulverizador hasta que el aerosol esté recto. Una vez que la protuberancia se ajusta a la mejor posición de intensidad de señal, trate de no cambiarla al intercambiar fuentes.
7. Después de todos los pasos anteriores, la configuración está lista para experimentos, y la configuración es normalmente estable durante >3 semanas de usabilidad, observada después de la configuración inicial.

3. Adquisición de imágenes DESI-MS

1. Para DESI-MSI, no realizar ningún pretratamiento de la muestra. Para las muestras que ya tienen pretratamiento, minimice los pasos de pretratamiento tanto como sea posible. Por ejemplo, algunas muestras solo se pueden hacer con medios de montaje, así que elimine el exceso de medios en las diapositivas si es posible.
2. Tome una imagen de la muestra en la diapositiva (Figura 3A). No toque la superficie de la muestra para evitar la absorción de impurezas.
3. Coloque la corredera en la posición de la placa en la plataforma DSI. El escenario tiene dos posiciones de placa, A y B; Es importante recordar la posición correcta. Utilice guías estándar (75 mm x 25 mm) o una corredera completa, de lo contrario la corredera no encajará en la posición y no se podrá sujetar de forma estable. Una diapositiva completa (120 mm x 80 mm) puede acomodar hasta cuatro diapositivas, y por lo tanto tiene un área mucho más grande para experimentos.
4. Abra el software de procesamiento masivo de imágenes de alta definición, establezca una nueva placa en la pestaña Adquirir y seleccione la posición correcta de la placa (A o B) y el tipo de placa. En la página de selección de imagen, seleccione las cuatro esquinas de la diapositiva y, a continuación, la imagen se ajusta automáticamente a la orientación correcta (Figura 3A).
5. Establecer los parámetros de MS; el tipo de experimento comúnmente utilizado es el modo DESI-MS, en el que solo se detectará el ion padre. El instrumento puede usar solo una polaridad en un experimento; Por lo tanto, seleccione la polaridad como positiva o negativa. Para obtener más información sobre los productos químicos en pequeñas cantidades, aplique el modo de sensibilidad (Figura 3B).
6. Dibuje un rectángulo para definir el área de escaneo en la ficha Patrón y defina el tamaño del píxel. Generalmente, para el modo DESI-MS, mantenga iguales los tamaños X e Y del píxel. Establezca la velocidad de escaneo en no más de 5 veces el tamaño del píxel (Figura 3C).
7. Guarde el proyecto y exporte una hoja de trabajo para el software de adquisición de espectrometría de masas.
8. Abra el software de adquisición de espectrometría de masas, importe la hoja de cálculo y guárdela como una nueva lista de muestra. Presione Iniciar ejecución para comenzar el escaneo MSI. Se pueden agregar varias imágenes a la cola de experimentos importando más hojas de cálculo.

4. Procesamiento de datos y visualización DESI-MSI

1. Cargue el archivo de datos de la muestra en el software de procesamiento masivo de imágenes y establezca los parámetros para el procesamiento de imágenes DESI (Figura 3D). Como la encefalina leucina se utilizó para la masa de bloqueo interna, y la masa de bloqueo es el único punto para identificar la polaridad del experimento, es de gran importancia establecer la masa de bloqueo correcta. Establezca los siguientes valores: para el modo positivo: 556.2772; Para el modo negativo: 554.2620.
2. Es posible crear una lista de productos químicos objetivo, en cuyo caso el resultado del procesamiento se centrará en los productos químicos de la lista objetivo. Cargue el archivo de datos procesados para visualizar la imagen DESI de la muestra. Haga clic en el botón "Normalización" para normalizar los datos por cromatografía iónica total (TIC) para obtener la intensidad relativa de un producto químico específico a la referencia, luego se pueden comparar diferentes muestras entre sí (Figura 3E).
3. Dibuje una región de interés (ROI) y copie varias copias en la imagen de muestra; Los ROI se pueden hacer a través de diferentes imágenes. Seleccione todos los ROI y exporte el análisis multivariante (MVA) para extraer información de MS de todos los ROI para MVA (Figura 3F).

Resultados

Este protocolo puede conducir a la identificación y distribución de compuestos en muestras de plantas. En la imagen MS de un m/z específico, el color de cada píxel representa la intensidad relativa del m/z, por lo que puede asociarse con la distribución natural y la abundancia del ion metabolito en toda la muestra. Cuanto mayor sea la abundancia del producto químico en la posición de recolección, más brillante será el color. La barra de la imagen (Figura 4A-D

Discusión

La aparición de la tecnología MS ha abierto una nueva visión en la investigación de productos naturales a nivel molecular durante los últimos años²⁴. El instrumento MS, con su alta sensibilidad y alto rendimiento, permite el análisis dirigido y no dirigido de metabolitos en productos naturales, incluso con concentración de trazas²⁵. Por lo tanto, la EM es actualmente ampliamente utilizada en el campo de la química de la medicina tradicional china (MTC). La investig...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Fisher	CAS:67-63-0	HPLC grade
Acetonitrile	Sigma-aldrich	Number-75-05-8	LC-MS grade
Adhesion Microscope slides	Citotest scientific	80312-3161	Microscope glass slides  can adhere to  the sample
Air cooled dry vacuum pump	EYELA	FDU-2110	Air-vaccum equipment at -80°C
Formic Acid	ACS	F1089 | 64-18-6	LC-MS grade
LE (Leucine Enkephalin)	Waters	186006013-1	LC-MS grade
Methanol	Sigma-aldrich	Number-67-56-1	LC-MS grade
Parafilm	Bemis Company	sc-200288	Laboratory Sealing Film
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	V900894	Reagent grade
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source	Waters	Synapt XS