Visualisierung von Metaboliten, die im räumlichen Metabolom der Traditionellen Chinesischen Medizin mit DESI-MSI identifiziert wurden

Zusammenfassung

In dieser Studie wird eine Reihe von Methoden zur Aufbereitung von DESI-MSI-Proben aus Pflanzen vorgestellt und ein Verfahren der DESI-Montageinstallation, MSI-Datenerfassung und -verarbeitung detailliert beschrieben. Dieses Protokoll kann unter verschiedenen Bedingungen angewendet werden, um räumliche Metabolominformationen in Pflanzen zu erhalten.

Zusammenfassung

Die medizinische Verwendung der Traditionellen Chinesischen Medizin ist vor allem auf ihre Sekundärmetaboliten zurückzuführen. Die Visualisierung der Verteilung dieser Metaboliten ist zu einem entscheidenden Thema in der Pflanzenwissenschaft geworden. Die massenspektrometrische Bildgebung kann riesige Datenmengen extrahieren und durch die Analyse von Gewebeschnitten Informationen über die räumliche Verteilung liefern. Mit dem Vorteil eines hohen Durchsatzes und einer höheren Genauigkeit wird die Desorptions-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung (DESI-MSI) häufig in der biologischen Forschung und im Studium der traditionellen chinesischen Medizin eingesetzt. Die Verfahren, die in dieser Forschung verwendet werden, sind jedoch kompliziert und nicht erschwinglich. In dieser Studie haben wir Schnitt- und DESI-Bildgebungsverfahren optimiert und eine kostengünstigere Methode entwickelt, um die Verteilung von Metaboliten zu identifizieren und diese Verbindungen in Pflanzengeweben zu kategorisieren, mit besonderem Fokus auf die traditionelle chinesische Medizin. Die Studie wird den Einsatz von DESI in der Metabolitenanalyse und die Standardisierung der Traditionellen Chinesischen Medizin/Ethnischen Medizin für forschungsnahe Technologien fördern.

Einleitung

Die Visualisierung der Metabolitenverteilung ist zu einem entscheidenden Thema in der Pflanzenwissenschaft geworden, insbesondere in der traditionellen chinesischen Medizin, da sie den Bildungsprozess spezifischer Metaboliten innerhalb der Pflanze aufdeckt. In Anlehnung an die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) gibt sie Auskunft über die Wirkstoffe und leitet die Anwendung von Pflanzenteilen in pharmazeutischen Anwendungen an. Normalerweise wird die Visualisierung von Metaboliten durch In-situ-Hybridisierung, Fluoreszenzmikroskopie oder Immunhistochemie erreicht, jedoch vermittelt die Anzahl der in diesen Experimenten nachgewiesenen Verbindungen nur begrenzte chemische Informationen. In Kombination mit der Gewebefärbung kann die massenspektrometrische Bildgebung (MSI) große Datenmengen liefern und räumliche Verteilungsinformationen von Verbindungen liefern, indem Gewebeschnitte auf Mikrometerebene gescannt und analysiert^{werden 1}. MSI verwendet Analyten für die Desorption und Ionisation von der Probenoberfläche, gefolgt von einer Massenanalyse der resultierenden Dampfphasenionen und der Anwendung von Bildgebungssoftware, um die Informationen zu integrieren und ein zweidimensionales Bild zu zeichnen, das eine bestimmte Ionenhäufigkeit aufzeichnet. Diese Technologie kann sowohl exogene als auch endogene Moleküle bestimmen, indem sie die charakteristische Verteilung von Wirkstoffen und ihren induzierten Metaboliten in Zielgeweben und -organen detektiert 2,3,4,5.

In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene bildgebende MS-Modalitäten entwickelt. Die bekanntesten unter ihnen sind die Desorptions-Elektrospray-Ionisations-basierte MSI (DESI-MSI), die matrixgestützte Laserdesorption/-ionisation (MALDI) und die Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS)⁶. DESI-MSI wird aufgrund seines atmosphärischen Betriebs, seines hohen Durchsatzes und seiner höheren Genauigkeit häufig in der biologischen Forschung eingesetzt⁷. MALDI wurde eingesetzt, um ein Transthyretinfragment als potentiellen nephrotoxischen Biomarker für Gentamicin zu identifizieren und die Verteilung des neurotoxischen Metaboliten 1-Methyl-4-phenylpyridinium nach der Behandlung von 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin im Mäusegehirn zu analysieren ^8,9. MALDI und DESI wurden verwendet, um die Zusammensetzung von medikamenteninduzierten kristallartigen Strukturen in der Niere von dosierten Kaninchen zu bestimmen. Diese Strukturen bestehen hauptsächlich aus Metaboliten, die durch die Demethylierung und/oder Oxidation des Wirkstoffs¹⁰ gebildet werden. Darüber hinaus wurde MSI zur Lokalisierung der metabolischen Verteilung von Arzneimitteltoxizität in Zielorganen eingesetzt. Die Zellen im Pflanzengewebe variieren jedoch und unterscheiden sich von Tieren und erfordern spezielle Schnittverfahren.

In Pflanzen wurde bisher mit Hilfe der MALDI-Bildgebung die Verteilung verschiedener Verbindungen in Weizensamen (Triticum aestivum), Sojabohnen (Glycine max), Reissamen (Oryza sativa), Arabidopsis thaliana-Blüten und -Wurzeln sowie Gerstensamen (Hordeum vulgare) analysiert 11,12,13,14,15,16,17,18 . Jüngste Studien haben gezeigt, dass DESI-MSI in der Metabolitenanalyse von natürlichen Arzneimitteln und Produkten auftaucht, insbesondere in TCMs wie Ginkgo biloba, Fuzi und Artemisia annua L 19,20,21. In diesen Studien unterscheiden sich die Protokolle für die Aufbereitung von Pflanzenmaterialproben, und einige erfordern komplexere Geräte, wie z. B. ein Mikrotom zum Einfrieren. DESI-MSI stellt strenge Anforderungen an die Oberflächenebenheit der detektierten Probe. Bei der Analyse des Organs oder Gewebes eines Tieres wird die Probe in der Regel durch Kryoschnitt²² hergestellt. Das Verfahren für die Kryoschnitte ist jedoch kompliziert und teurer, und die häufig verwendete Methode der optimalen Schneidtemperatur (OCT) des Klebstoffs hat ein starkes Signal bei der Bildgebung. Darüber hinaus variieren die medizinischen Gewebe der TCM; Zum Beispiel wird die Wurzel von Salvia miltiorrhiza, die auf Chinesisch als Danshen bekannt ist, medizinisch verwendet, während bei Zisu (Perilla frutescens) das Blatt verwendet wird^23,24. Daher ist es notwendig, die Probenvorbereitungsverfahren zu verbessern, um den Einsatz von DESI in der Metabolitenanalytik für die TCM zu fördern.

Als mehrjähriges Kraut und häufig verwendetes TCM wurde S. miltiorrhiza ursprünglich in der ältesten medizinischen Monographie, Shennong's Classic of Materia Medica (auf Chinesisch als Shennong Bencao Jing bekannt), aufgezeichnet. In dieser Studie haben wir Schnitt- und DESI-Bildgebungsverfahren optimiert und eine kostengünstigere Methode entwickelt, um die Verteilung und Kategorisierung der Verbindungen in Geweben von S. miltiorrhiza zu identifizieren. Diese Methode kann auch die Nachteile von trockenem Gewebe überwinden - dass es unter dem Stickstoffschlag normalerweise leicht bricht - und die Entwicklung der TCM fördern. Die Studie wird die Standardisierung der TCM/ethnischen Medizin für forschungsnahe Technologien vorantreiben.

Protokoll

1. Probenvorbereitung

1. Sammeln Sie gereinigte Wurzeln und Blätter einer 2 Jahre alten Salvia miltiorrhiza-Pflanze (Abbildung 1A) und schneiden Sie sie direkt von Hand in einer Querschnittsdicke von ca. 3-5 mm. Kleben Sie die Probe dann mit doppelseitigem Klebeband auf einen Objektträger des Adhäsionsmikroskops (Abbildung 1B).
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Größe des doppelseitigen Klebebandes größer als die Probe ist. Wenn die Taschentücher getrocknet sind, weichen Sie sie vor dem Schneiden über Nacht in Wasser oder 4% Paraformaldehyd ein.
2. Legen Sie einen weiteren Objektträger über die Probe und wickeln Sie die beiden Objektträger wie ein Sandwich mit einer Siegelfolie ein (Abbildung 1C). Die Sandwich-Probe wird mindestens 4 h bei -80 °C eingefroren und dann 2 h lang einem Luftvakuum ausgesetzt (Abbildung 1D) mit folgenden Einstellparametern: Fallentemperatur bei -75 bis -82 °C und Vakuummeter bei 2,5 bis 3,7 Pa.
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die beiden Objektträger parallel sind, wenn Sie die Versiegelungsfolie einwickeln, um die Oberfläche der Probe intakt zu halten. Wenn das Pflanzengewebe einen hohen Feuchtigkeitsgehalt hat, verlängern Sie die Zeit des Luftvakuums auf 3 h. Überschreiten Sie nicht 5 Stunden, da sonst das Gewebe leicht bricht.
3. Lagern Sie die Sandwich-Proben bis zur Analyse bei -80 °C. Bringen Sie die Proben in einem Exsikkator auf Raumtemperatur, um Kondensation auf der Probenoberfläche zu vermeiden. Anschließend wird die Probe einer Matrixanwendung unterzogen.

2. Installation einer Desorptions-Elektrospray-Ionisationsanlage (DESI)

1. Implementieren Sie die Einrichtung des Detektors und die Massenkalibrierung des Geräts im ESI-Modus. Detektoraufbau mit Leucin-Enkephalin (LE) in Wasser-Acetonitril-Lösung (1:1 v/v) und Massenkalibrierung mit Natriumformiat (NaFA) in Wasser-Isopropanol-Lösung (1:1 v/v) durchführen.
2. Nehmen Sie die ESI-Quelle heraus und montieren Sie die DESI-Einheit auf dem Massenspektrometer. Schließen Sie die N_{2-Gasversorgung} an die DESI-Einheit an und stellen Sie den Gasdruck auf etwa 0,5 MPa ein (Abbildung 2A). Es ist nicht erforderlich, das Gerät beim Austausch von Quellen zu entlüften.
3. Füllen Sie die 5-ml-Spritze mit LE und Ameisensäure in Wasser-Methanol-Lösung (1:9 v/v) und befestigen Sie die Spritze an der Hochleistungsspritzenpumpe, um Lösungsmittel für die Ionisierung der Chemikalien in der Probe bereitzustellen (Abbildung 2B).
4. Befestigen Sie ein Lösungsmittel mit Kapillare an der Spritze und dem DESI-Sprühgerät (Abbildung 2C). Die lösungsmittelliefernde Kapillare ist eine Standardkapillare mit einem Innendurchmesser von 75 μm und einer Kapillare mit einem Außendurchmesser von 375 μm. Es ist ziemlich schmal und wird leicht durch Verunreinigungen verstopft, daher sollten Lösungsmittel, die bei den Scanprozessen verwendet werden, MS-Qualität haben und vor der Verwendung gefiltert werden, um das Risiko einer Verstopfung zu verringern.
5. Starten Sie die Spritzenpumpe und stellen Sie die Infusionsrate auf 2 μl/min ein, um einen konstanten Durchfluss und Sprühnebel des Lösungsmittels zu erzielen (Abbildung 2B). Schalten Sie das Gasventil N₂ aus und schalten Sie es nach ca. 15 s ein. Ein kleiner Tropfen Lösungsmittel wird auf die Bühne geblasen, und der Sprühnebel ist zu sehen, wenn sich der Lösungsmittelfluss in einem konstanten Zustand befindet.
6. Passen Sie die Position des Sprühgeräts in Bezug auf den Sprühwinkel, die XYZ-Achse, den Vorsprung und die Höhe an (Abbildung 2D). Verwenden Sie rote und schwarze Marker als Referenzen, um das Massenspektrometriesignal zu optimieren, um eine Signalintensität von über 1 x 10⁵ im Empfindlichkeitsmodus zu erhalten (Abbildung 2E).
   1. Der Vorsprung des Sprühgeräts ist der wichtigste Faktor, der die Signalintensität beeinflusst. Stellen Sie den Vorsprung ein, indem Sie den Gasschutz N₂ mit einem 5-mm-Schlüssel austauschen. Die Sprührichtung beeinflusst die Qualität des Massenbildes. Drehen Sie das Sprühgerät, bis der Sprühstrahl gerade ist. Sobald der Vorsprung auf die beste Position der Signalintensität eingestellt ist, versuchen Sie, ihn beim Austausch von Quellen nicht zu ändern.
7. Nach allen oben genannten Schritten ist das Setup bereit für Experimente, und das Setup ist normalerweise für >3 Wochen der Benutzerfreundlichkeit stabil, die nach der Ersteinrichtung beobachtet wird.

3. DESI-MS-Bildaufnahme

1. Führen Sie für DESI-MSI keine Probenvorbehandlung durch. Bei Proben, die bereits vorbehandelt wurden, sollten die Vorbehandlungsschritte so weit wie möglich minimiert werden. Zum Beispiel können einige Proben nur mit Eindeckmedien hergestellt werden, entfernen Sie also nach Möglichkeit die überschüssigen Medien auf den Objektträgern.
2. Nehmen Sie ein Bild der Probe auf dem Objektträger auf (Abbildung 3A). Berühren Sie nicht die Oberfläche der Probe, um die Aufnahme von Verunreinigungen zu vermeiden.
3. Platzieren Sie den Objektträger auf der Plattenposition auf dem DESI-Tisch. Der Tisch hat zwei Plattenpositionen, A und B; Es ist wichtig, sich an die richtige Position zu erinnern. Verwenden Sie Standardschienen (75 mm x 25 mm) oder eine Vollschiene, da die Schiene sonst nicht in die Position passt und nicht stabil gehalten werden kann. Ein Vollobjektträger (120 mm x 80 mm) bietet Platz für bis zu vier Objektträger und hat somit eine viel größere Fläche für Experimente.
4. Öffnen Sie die High-Definition-Massenbildverarbeitungssoftware, legen Sie auf der Registerkarte Erfassen eine neue Platte fest und wählen Sie die richtige Plattenposition (A oder B) und den Plattentyp aus. Wählen Sie auf der Bildauswahlseite die vier Ecken der Folie aus, und das Bild wird dann automatisch an die richtige Ausrichtung angepasst (Abbildung 3A).
5. Legen Sie die MS-Parameter fest. Der am häufigsten verwendete Experimenttyp ist der DESI-MS-Modus, bei dem nur das Mutterion detektiert wird. Das Instrument kann nur eine Polarität in einem Experiment verwenden; Wählen Sie daher die Polarität als positiv oder negativ aus. Um mehr Informationen über Chemikalien in kleinen Mengen zu erhalten, wenden Sie den Empfindlichkeitsmodus an (Abbildung 3B).
6. Zeichnen Sie ein Rechteck, um den Scanbereich auf der Registerkarte Muster zu definieren, und legen Sie die Pixelgröße fest. Im Allgemeinen sollten Sie für den DESI-MS-Modus die X- und Y-Größen des Pixels gleich halten. Stellen Sie die Abtastrate auf nicht mehr als das 5-fache der Pixelgröße ein (Abbildung 3C).
7. Speichern Sie das Projekt, und exportieren Sie ein Arbeitsblatt für die Massenspektrometrie-Erfassungssoftware.
8. Öffnen Sie die Massenspektrometrie-Erfassungssoftware, importieren Sie das Arbeitsblatt, und speichern Sie es als neue Probenliste. Drücken Sie Start Run , um den MSI-Scan zu starten. Mehrere Bilder können der Experimentwarteschlange hinzugefügt werden, indem weitere Arbeitsblätter importiert werden.

4. Verarbeitung von DESI-MSI-Daten und Visualisierung

1. Laden Sie die Datendatei der Probe in die Massenbildverarbeitungssoftware und stellen Sie die Parameter für die DESI-Bildverarbeitung ein (Abbildung 3D). Da Leucin Enkephalin für die innere Schleusenmasse verwendet wurde und die Schleusenmasse der einzige Punkt ist, um die Polarität des Experiments zu bestimmen, ist es von großer Bedeutung, die richtige Schleusenmasse einzustellen. Legen Sie die folgenden Werte fest: für den positiven Modus: 556,2772; für den negativen Modus: 554.2620.
2. Es ist möglich, eine Liste von Zielchemikalien zu erstellen, in diesem Fall konzentriert sich das Verarbeitungsergebnis auf die Chemikalien in der Zielliste. Laden Sie die verarbeitete Datendatei, um das DESI-Bild der Probe zu visualisieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Normalisierung", um die Daten durch Totalionenchromatographie (TIC) zu normalisieren, um die relative Intensität einer bestimmten Chemikalie zur Referenz zu erhalten, dann können verschiedene Proben miteinander verglichen werden (Abbildung 3E).
3. Zeichnen Sie einen Bereich of Interest (ROI) und kopieren Sie mehrere Kopien auf das Beispielbild. ROIs können über verschiedene Bilder hinweg erzielt werden. Wählen Sie alle ROIs aus und exportieren Sie die multivariate Analyse (MVA), um MS-Informationen aus allen ROIs für MVA zu extrahieren (Abbildung 3F).

Ergebnisse

Dieses Protokoll kann zur Identifizierung und Verteilung von Verbindungen in Pflanzenproben führen. Im MS-Bild eines bestimmten m/z repräsentiert die Farbe jedes einzelnen Pixels die relative Intensität des m/z und kann somit mit der natürlichen Verteilung und der Häufigkeit des Metabolitenions in der gesamten Probe in Verbindung gebracht werden. Je höher die Häufigkeit der Chemikalie an der Sammelposition ist, desto heller ist die Farbe. Der Balken im Bild (Abbildung 4A-D

Diskussion

Das Aufkommen der MS-Technologie hat in den letzten Jahren neue Erkenntnisse in der Naturstoffforschung auf molekularer Ebene eröffnet²⁴. Das MS-Gerät ermöglicht mit seiner hohen Empfindlichkeit und seinem hohen Durchsatz die gezielte und ungezielte Analyse von Metaboliten in Naturstoffen, auch bei Spurenkonzentrationen²⁵. Daher ist MS derzeit im Bereich der Chemie der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) weit verbreitet. Die qualitative und quantitative Forschung z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Fisher	CAS:67-63-0	HPLC grade
Acetonitrile	Sigma-aldrich	Number-75-05-8	LC-MS grade
Adhesion Microscope slides	Citotest scientific	80312-3161	Microscope glass slides  can adhere to  the sample
Air cooled dry vacuum pump	EYELA	FDU-2110	Air-vaccum equipment at -80°C
Formic Acid	ACS	F1089 | 64-18-6	LC-MS grade
LE (Leucine Enkephalin)	Waters	186006013-1	LC-MS grade
Methanol	Sigma-aldrich	Number-67-56-1	LC-MS grade
Parafilm	Bemis Company	sc-200288	Laboratory Sealing Film
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	V900894	Reagent grade
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source	Waters	Synapt XS