JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании представлен ряд методов подготовки образцов DESI-MSI с заводов, а также подробно описана процедура установки сборки DESI, сбора и обработки данных MSI. Этот протокол может быть применен в нескольких условиях для получения пространственной метаболомной информации в растениях.

Аннотация

Лекарственное применение традиционной китайской медицины в основном связано с ее вторичными метаболитами. Визуализация распределения этих метаболитов стала важной темой в науке о растениях. Масс-спектрометрия может извлекать огромные объемы данных и предоставлять информацию о пространственном распределении о них, анализируя срезы тканей. Обладая преимуществом высокой пропускной способности и более высокой точности, десорбционная ионизационная масс-спектрометрия электрораспылением (DESI-MSI) часто используется в биологических исследованиях и в изучении традиционной китайской медицины. Однако процедуры, используемые в этом исследовании, сложны и недоступны. В этом исследовании мы оптимизировали процедуры секционирования и визуализации DESI и разработали более экономичный метод определения распределения метаболитов и классификации этих соединений в тканях растений, уделяя особое внимание традиционной китайской медицине. Исследование будет способствовать использованию DESI в анализе метаболитов и стандартизации традиционной китайской медицины / этнической медицины для технологий, связанных с исследованиями.

Введение

Визуализация распределения метаболитов стала важной темой в науке о растениях, особенно в традиционной китайской медицине, поскольку она раскрывает процесс образования специфических метаболитов в растении. Что касается традиционной китайской медицины (ТКМ), он предоставляет информацию об активных компонентах и направляет применение частей растений в фармацевтических целях. Обычно визуализация метаболитов достигается гибридизацией in situ, флуоресцентной микроскопией или иммуногистохимией, однако количество соединений, обнаруженных в этих экспериментах, передает ограниченную химическую информацию. В сочетании с окрашиванием тканей масс-спектрометрическая визуализация (MSI) может предоставить большой объем данных и предоставить информацию о пространственном распределении соединений путем сканирования и анализа срезов тканей на микронном уровне1. MSI использует аналиты для десорбции и ионизации с поверхности образца с последующим массовым анализом полученных ионов в паровой фазе и применением программного обеспечения для визуализации для интеграции информации и построения двумерного изображения, записывающего конкретное содержание ионов. Эта технология может определять как экзогенные, так и эндогенные молекулы, обнаруживая характерное распределение лекарств и их индуцированных метаболитов в тканях и органах-мишенях 2,3,4,5.

За последние десятилетия были разработаны различные методы визуализации рассеянного склероза; наиболее заметными среди них являются MSI на основе десорбционного электрораспыления (DESI-MSI), матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI) и масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS)6. DESI-MSI часто используется в биологических исследованиях из-за его работы в атмосфере, высокой пропускной способности и более высокой точности7. MALDI был применен для идентификации фрагмента транстиретина в качестве потенциального нефротоксического биомаркера гентамицина и для анализа распределения нейротоксического метаболита 1-метил-4-фенилпиридиния после лечения 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина в мозге мышей 8,9. MALDI и DESI были использованы для определения состава лекарственно-индуцированных кристаллоподобных структур в почках дозированных кроликов; Эти структуры в основном состоят из метаболитов, образующихся в результате деметилирования и/или окисления лекарственного средства10. Кроме того, MSI был применен для локализации метаболического распределения токсичности лекарств в органах-мишенях. Однако клетки в растительной ткани различаются и отличаются от животных и требуют специальных процедур секции.

На растениях с помощью визуализации MALDI до сих пор анализировалось распределение различных соединений в стебле пшеницы (Triticum aestivum), соевых бобах (Glycine max), семенах риса (Oryza sativa), цветках и корнях Arabidopsis thaliana и семенах ячменя (Hordeum vulgare) 11,12,13,14,15,16,17,18 . Недавние исследования показали, что DESI-MSI появляется при анализе метаболитов природных лекарств и продуктов, особенно в таких ТКМ, как гинкго билоба, фузи и Artemisia annua L 19,20,21. В этих исследованиях протоколы подготовки образцов растительного материала различаются, и некоторые требуют более сложного оборудования, такого как замораживающий микротом. DESI-MSI предъявляет строгие требования к плоскостности поверхности обнаруженного образца. При анализе органа или ткани животного образец обычно делают методомкриосекции22. Однако процедура криоссекционирования сложна и более дорога, а широко используемый метод оптимальной температуры резки клея (OCT) имеет сильный сигнал при визуализации. Кроме того, лекарственные ткани ТКМ различаются; например, корень Salvia miltiorrhiza, известный как Danshen на китайском языке, используется в медицине, в то время как в Zisu (Perilla frutescens) используется лист23,24. Следовательно, необходимо улучшить процедуры пробоподготовки, чтобы способствовать использованию DESI в анализе метаболитов для ТКМ.

Как многолетнее травянистое растение и широко используемая ТКМ, S. miltiorrhiza была первоначально записана в старейшей монографии по медицине «Классика материи медики» Шэньнуна (известная как «Шэньнун Бэньцао Цзин» на китайском языке). В этом исследовании мы оптимизировали процедуры секционирования и визуализации DESI и разработали более экономичный метод определения распределения и классификации соединений в тканях S. miltiorrhiza. Этот метод также может преодолеть недостатки, связанные с сухими тканями - то, что они обычно легко ломаются под ударом азота - и способствовать развитию ТКМ. Исследование будет способствовать стандартизации ТКМ/этнической медицины для технологий, связанных с исследованиями.

протокол

1. Пробоподготовка

  1. Соберите очищенные корни и листья 2-летнего растения Salvia miltiorrhiza (рис. 1A) и нарежьте вручную на толщину поперечного сечения примерно 3-5 мм. Затем наклейте образец на предметное стекло адгезионного микроскопа с помощью двустороннего скотча (рис. 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что размер двустороннего скотча больше, чем образец. Если салфетки высушены, замочите их в воде или 4% параформальдегиде на ночь перед нарезкой.
  2. Поместите еще одно предметное стекло микроскопа над образцом и оберните два предметных стекла герметизирующей пленкой, как бутерброд (рис. 1C). Заморозьте образец сэндвича при -80 °C в течение не менее 4 часов, затем подвергните его воздействию воздушного вакуума в течение 2 часов (рис. 1D) со следующими параметрами: температура ловушки при температуре от -75 до -82 °C и вакуумметр при температуре от 2,5 до 3,7 Па.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что два предметных стекла параллельны при обертывании герметизирующей пленки, чтобы сохранить поверхность образца неповрежденной. Если ткани растения имеют высокое содержание влаги, увеличьте время воздушно-вакуумного до 3 часов. Не превышайте 5 ч, иначе ткани легко сломаются.
  3. Храните образцы сэндвичей при температуре -80 °C до анализа. Доведите образцы до комнатной температуры в эксикаторе, чтобы избежать конденсации на поверхности образца. Затем подвергните образец матричному применению.

2. Установка установки десорбционной электрораспыления ионизации (DESI)

  1. Осуществлять настройку детектора и калибровку массы прибора в режиме ESI; выполнить настройку детектора с использованием лейцина энкефалина (LE) в водно-ацетонитриловом растворе (1:1 об./об.) и выполнить массовую калибровку формиатом натрия (NaFA) в водно-изопропаноловом растворе (1:1 об./об.).
  2. Выньте источник ESI и установите блок DESI на масс-спектрометр. Подключите подачу газа N2 к блоку DESI и отрегулируйте давление газа примерно до 0,5 МПа (рис. 2A). Нет необходимости вентилировать прибор при обмене источниками.
  3. Наполните шприц объемом 5 мл LE и муравьиной кислотой в водно-метанольном растворе (1: 9 об. / об.) и присоедините шприц к высокопроизводительному шприцевому насосу, чтобы обеспечить растворитель для ионизации химических веществ в образце (рис. 2B).
  4. Присоедините растворитель, обеспечивающий капилляр, к шприцу и распылителю DESI (рис. 2C). Капилляр, обеспечивающий растворитель, представляет собой стандартный капилляр с внутренним диаметром 75 мкм и внешним диаметром 375 мкм; он довольно узкий и легко засоряется примесями, поэтому растворители, используемые в процессах сканирования, должны быть класса MS и фильтрованы перед использованием, чтобы снизить риск засорения.
  5. Запустите шприцевой насос и установите скорость инфузии на уровне 2 мкл / мин, чтобы получить постоянный поток и распыление растворителя (рис. 2B). Перекройте газовый вентиль N2 , затем примерно через 15 с включите его; Небольшая капля растворителя будет выдуваться на сцену, и брызги можно увидеть, если поток растворителя находится в постоянном состоянии.
  6. Отрегулируйте положение опрыскивателя с точки зрения угла распыления, оси XYZ, выступа и высоты (рис. 2D). Используйте красные и черные маркеры в качестве эталонов для оптимизации сигнала масс-спектрометрии, чтобы получить интенсивность сигнала выше 1 x 105 в режиме чувствительности (рис. 2E).
    1. Выступ распылителя является наиболее значимым фактором, влияющим на интенсивность сигнала; отрегулируйте выступ, заменив газовый щиток N2 гаечным ключом диаметром 5 мм. Направление распыления влияет на качество массового изображения; Вращайте опрыскиватель до тех пор, пока распылитель не станет прямым. После того, как выступ настроен на наилучшее положение интенсивности сигнала, старайтесь не менять его при обмене источниками.
  7. После всех описанных выше шагов установка готова к экспериментам, и установка обычно стабильна в течение >3 недель удобства использования, наблюдаемого после первоначальной настройки.

3. Получение изображений DESI-MS

  1. Для DESI-MSI не выполняйте предварительную обработку образца. Для образцов, которые уже прошли предварительную обработку, сведите к минимуму этапы предварительной обработки, насколько это возможно. Например, некоторые образцы могут быть изготовлены только с помощью монтажных носителей, поэтому, если это возможно, удалите лишний носитель с направляющих.
  2. Сфотографируйте образец на слайде (рис. 3А). Не прикасайтесь к поверхности образца, чтобы избежать попадания примесей.
  3. Поместите слайд в положение пластины на ступени DESI. Сцена имеет два положения пластины, A и B; Важно помнить о правильном положении. Используйте стандартные направляющие (75 мм х 25 мм) или полноценную направляющую, иначе затвор не поместится в положение и не сможет устойчиво удерживаться. Полный слайд (120 мм x 80 мм) может вместить до четырех слайдов и, таким образом, имеет гораздо большую площадь для экспериментов.
  4. Откройте программное обеспечение для массовой обработки изображений высокой четкости, установите новую пластину на вкладке «Захват» и выберите правильное положение пластины (A или B) и тип пластины. На странице выбора изображения выберите четыре угла слайда, после чего изображение автоматически подстроится под правильную ориентацию (рис. 3A).
  5. Установите параметры MS; обычно используемым типом эксперимента является режим DESI-MS, в котором будет обнаружен только родительский ион. Прибор может использовать только одну полярность в одном эксперименте; Поэтому выберите полярность как положительную или отрицательную. Чтобы получить больше информации о химических веществах в небольших количествах, примените режим чувствительности (рис. 3B).
  6. Нарисуйте прямоугольник, чтобы определить область сканирования на вкладке «Узор» и установить размер в пикселях. Как правило, для режима DESI-MS сохраняйте размеры пикселей по осям X и Y равными. Установите скорость сканирования не более чем в 5 раз больше размера пикселя (рис. 3C).
  7. Сохраните проект и экспортируйте рабочий лист для программного обеспечения для сбора данных масс-спектрометрии.
  8. Откройте программное обеспечение для сбора данных масс-спектрометрии, импортируйте рабочий лист и сохраните его как новый список образцов. Нажмите Start Run (Начать выполнение ), чтобы начать сканирование MSI. Несколько изображений можно добавить в очередь эксперимента, импортировав дополнительные листы.

4. Обработка данных DESI-MSI и визуализация

  1. Загрузите файл данных образца в программное обеспечение для массовой обработки изображений и установите параметры для обработки изображений DESI (рис. 3D). Поскольку лейцин энкефалин использовался для массы внутреннего замка, а масса замка является единственной точкой для определения полярности эксперимента, очень важно установить правильную массу замка. Установите следующие значения: для положительного режима: 556.2772; для отрицательного режима: 554.2620.
  2. Можно составить список целевых химических веществ, и в этом случае результат обработки будет сосредоточен на химических веществах в целевом списке. Загрузите обработанный файл данных, чтобы визуализировать DESI-образ образца. Нажмите кнопку «Нормализация», чтобы нормализовать данные с помощью тотальной ионной хроматографии (TIC), чтобы получить относительную интенсивность конкретного химического вещества к эталону, после чего можно сравнить разные образцы друг с другом (рис. 3E).
  3. Нарисуйте область интереса (ROI) и скопируйте несколько копий на образец изображения; ROI может быть сделан для разных изображений. Выберите все ROI и экспортируйте многомерный анализ (MVA), чтобы извлечь информацию MS из всех ROI для MVA (рис. 3F).

Результаты

Этот протокол может привести к идентификации и распределению соединений в образцах растений. В MS-изображении конкретного m/z цвет каждого отдельного пикселя представляет относительную интенсивность m/z, поэтому может быть связан с естественным распределением и обилием метаболит-иона п...

Обсуждение

Появление технологии рассеянного склероза открыло новый взгляд на исследования натуральных продуктов на молекулярном уровне в течение последних24 лет. Прибор MS с его высокой чувствительностью и высокой пропускной способностью позволяет проводить целенаправленный и нец?...

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом естественных наук провинции Сычуань (No 2022NSFSC0171) и Программой талантов Синлинь Университета ТКМ Чэнду (No 030058042).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-PropanolFisherCAS:67-63-0HPLC grade
AcetonitrileSigma-aldrichNumber-75-05-8LC-MS grade
Adhesion Microscope slidesCitotest scientific80312-3161Microscope glass slides  can adhere to  the sample 
Air cooled dry vacuum pumpEYELAFDU-2110Air-vaccum equipment at -80°C
Formic AcidACSF1089 | 64-18-6LC-MS grade
LE (Leucine Enkephalin)Waters186006013-1LC-MS grade
MethanolSigma-aldrichNumber-67-56-1LC-MS grade
Parafilm Bemis Companysc-200288Laboratory Sealing Film
ParaformaldehydeSigma-aldrichV900894Reagent grade
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI sourceWatersSynapt XS

Ссылки

  1. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  2. Karlsson, O., Hanrieder, J. Imaging mass spectrometry in drug development and toxicology. Archives of Toxicology. 91 (6), 2283-2294 (2016).
  3. Qiu, Z. -. D., et al. Real-time toxicity prediction of Aconitum stewing system using extractive electrospray ionization mass spectrometry. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (5), 903-912 (2020).
  4. Wang, Z., et al. In situ metabolomics in nephrotoxicity of aristolochic acids based on air flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10 (6), 1083-1093 (2020).
  5. Jiang, H., Gao, S., Hu, G., He, J., Jin, H. Innovation in drug toxicology: Application of mass spectrometry imaging technology. Toxicology. 464, 153000 (2021).
  6. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, J. Quantitative mass spectrometry imaging of biological systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).
  7. Parrot, D., Papazian, S., Foil, D., Tasdemir, D. Imaging the unimaginable: desorption electrospray ionization-imaging mass spectrometry (DESI-IMS) in natural product research. Planta Medica. 84 (9-10), 584-593 (2018).
  8. Meistermann, H., et al. Biomarker discovery by imaging mass spectrometry: transthyretin is a biomarker for gentamicin-induced nephrotoxicity in rat. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1876-1886 (2006).
  9. Kadar, H., et al. MALDI mass spectrometry imaging of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) in mouse brain. Neurotoxicity Research. 25 (1), 135-145 (2014).
  10. Bruinen, A. L., et al. Mass spectrometry imaging of drug related crystal-like structures in formalin-fixed frozen and paraffin-embedded rabbit kidney tissue sections. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 117-123 (2016).
  11. Mullen, A. K., Clench, M. R., Crosland, S., Sharples, K. R. Determination of agrochemical compounds in soya plants by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 19 (18), 2507-2516 (2005).
  12. Robinson, S., Warburton, K., Seymour, M., Clench, M., Thomas-Oates, J. Localization of water-soluble carbohydrates in wheat stems using imaging matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. New Phytologist. 173 (2), 438-444 (2007).
  13. Yoshimura, Y., Zaima, N., Moriyama, T., Kawamura, Y. Different localization patterns of anthocyanin species in the pericarp of black rice revealed by imaging mass spectrometry. PLoS One. 7 (2), 31285 (2012).
  14. Jun, J. H., et al. High-spatial and high-mass resolution imaging of surface metabolites of Arabidopsis thaliana by laser desorption-ionization mass spectrometry using colloidal silver. Analytical Chemistry. 82 (8), 3255-3265 (2010).
  15. Shroff, R., Vergara, F., Muck, A., Svatos, A., Gershenzon, J. Nonuniform distribution of glucosinolates in Arabidopsis thaliana leaves has important consequences for plant defense. Proceeding of the National Academy of Sciences. 105 (16), 6196-6201 (2008).
  16. Vrkoslav, V., Muck, A., Cvacka, J., Svatos, A. MALDI imaging of neutral cuticular lipids in insects and plants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (2), 220-231 (2010).
  17. Sarsby, J., Towers, M. W., Stain, C., Cramer, R., Koroleva, O. A. Mass spectrometry imaging of glucosinolates in Arabidopsis flowers and siliques. Phytochemistry. 77, 110-118 (2012).
  18. Peukert, M., et al. Spatially resolved analysis of small molecules by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI-MSI). New Phytologist. 193 (3), 806-815 (2012).
  19. Li, B., et al. Interrogation of spatial metabolome of Ginkgo biloba with high-resolution matrix-assisted laser desorption/ionization and laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Plant, Cell & Environment. 41 (11), 2693-2703 (2018).
  20. Liu, Y., et al. Unveiling dynamic changes of chemical constituents in raw and processed Fuzi with different steaming time points using desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging combined with metabolomics. Frontiers in Pharmacology. 13, 842890 (2022).
  21. Liao, B., et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly of Artemisia annua reveals the correlation between ADS expansion and artemisinin yield. Molecular Plant. 15 (8), 1310-1328 (2022).
  22. Jones, E. E., Gao, P., Smith, C. D., Norris, J. S., Drake, R. R. Tissue biomarkers of drug efficacy: case studies using a MALDI-MSI workflow. Bioanalysis. 7 (20), 2611-2619 (2015).
  23. Jia, Q., et al. Salvia miltiorrhiza in diabetes: A review of its pharmacology, phytochemistry, and safety. Phytomedicine. 58, 152871 (2019).
  24. Zhang, Y., et al. Incipient diploidization of the medicinal plant Perilla within 10,000 years. Nature Communication. 12 (1), 5508 (2021).
  25. Tong, Q., et al. Biosynthesis-based spatial metabolome of Salvia miltiorrhiza Bunge by combining metabolomics approaches with mass spectrometry-imaging. Talanta. 238 (2), 123045 (2022).
  26. Jarmusch, A. K., Cooks, R. G. Emerging capabilities of mass spectrometry for natural products. Natural Product Reports. 31 (6), 730-738 (2014).
  27. Aksenov, A. A., da Silva, R., Knight, R., Lopes, N. P., Dorrestein, P. C. Global chemical analysis of biology by mass spectrometry. Nature Reviews Chemistry. 1 (7), 1-20 (2017).
  28. Feng, H., Pan, G. X. Application of High Resolution Mass Spectrum in the analysis of the chemical constituents in traditional Chinese drug. Journal of Liaoning University of TCM. 14 (8), 40-42 (2012).
  29. Ho, Y. N., Shu, L. J., Yang, Y. L. Imaging mass spectrometry for metabolites: technical progress, multimodal imaging, and biological interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews-Systems Biology and Medicine. 9 (5), (2017).
  30. Hemalatha, R. G., Pradeep, T. Understanding the molecular signatures in leaves and flowers by desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) imaging. Journal of Agricultural and Food chemistry. 61 (31), 7477-7487 (2013).
  31. Petras, D., Jarmusch, A. K., Dorrestein, P. C. From single cells to our planet-recent advances in using mass spectrometry for spatially resolved metabolomics. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 24-31 (2017).
  32. Takats, Z. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  33. Castaing, R., Slodzian, G. Microanalyse par émission secondaire. Journal of Microscopy. 1, 395-410 (1962).
  34. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Analytical Chemistry. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  35. Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 79 (21), 8098-8106 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены