Visualisation des métabolites identifiés dans le métabolome spatial de la médecine traditionnelle chinoise à l’aide de DESI-MSI

Résumé

Dans cette étude, une série de méthodes sont présentées pour préparer des échantillons DESI-MSI provenant d’usines, et une procédure d’installation d’assemblage DESI, d’acquisition de données MSI et de traitement est décrite en détail. Ce protocole peut être appliqué dans plusieurs conditions d’acquisition d’informations de métabolome spatial chez les plantes.

Résumé

L’utilisation médicinale de la médecine traditionnelle chinoise est principalement due à ses métabolites secondaires. La visualisation de la distribution de ces métabolites est devenue un sujet crucial en science végétale. L’imagerie par spectrométrie de masse peut extraire d’énormes volumes de données et fournir des informations de distribution spatiale à leur sujet en analysant des tranches de tissu. Avec l’avantage d’un débit élevé et d’une plus grande précision, l’imagerie par spectrométrie de masse par électronébulisation par désorption (DESI-MSI) est souvent utilisée dans la recherche biologique et dans l’étude de la médecine traditionnelle chinoise. Cependant, les procédures utilisées dans cette recherche sont compliquées et inabordables. Dans cette étude, nous avons optimisé les procédures de sectionnement et d’imagerie DESI et développé une méthode plus rentable pour identifier la distribution des métabolites et catégoriser ces composés dans les tissus végétaux, en mettant l’accent sur les médecines traditionnelles chinoises. L’étude encouragera l’utilisation du DESI dans l’analyse des métabolites et la normalisation de la médecine traditionnelle chinoise et de la médecine ethnique pour les technologies liées à la recherche.

Introduction

La visualisation de la distribution des métabolites est devenue un sujet crucial dans la science des plantes, en particulier dans la médecine traditionnelle chinoise, car elle dévoile le processus de formation de métabolites spécifiques dans la plante. En ce qui concerne la médecine traditionnelle chinoise (MTC), il fournit des informations sur les composants actifs et guide l’application des parties de plantes dans les applications pharmaceutiques. Normalement, la visualisation des métabolites est réalisée par hybridation in situ, microscopie à fluorescence ou immunohistochimie, mais le nombre de composés détectés par ces expériences transmet des informations chimiques limitées. Combinée à la coloration tissulaire, l’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) peut fournir une grande quantité de données et fournir des informations sur la distribution spatiale des composés en scannant et en analysant des coupes de tissu au niveau^{micronique 1}. MSI utilise des analytes pour la désorption et l’ionisation de la surface de l’échantillon, suivie d’une analyse de masse des ions en phase vapeur résultants et de l’application d’un logiciel d’imagerie pour intégrer les informations et tracer une image bidimensionnelle enregistrant une abondance d’ions spécifique. Cette technologie permet de déterminer à la fois des molécules exogènes et endogènes en détectant la distribution caractéristique des médicaments et de leurs métabolites induits dans les tissus et organes cibles 2,3,4,5.

Diverses modalités d’imagerie de la SEP ont été développées au cours des dernières décennies; les plus importants d’entre eux sont le MSI basé sur l’ionisation par électropulvérisation de désorption (DESI-MSI), la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) et la spectrométrie de masse à ions secondaires (SIMS)⁶. DESI-MSI est souvent utilisé dans la recherche biologique en raison de son fonctionnement atmosphérique, de son débit élevé et de sa plus grande précision⁷. MALDI a été appliqué pour identifier un fragment de transthyrétine comme biomarqueur néphrotique potentiel de la gentamicine et pour analyser la distribution du métabolite neurotoxique 1-méthyl-4-phénylpyridinium après la prise en charge de la 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine dans le cerveau de souris ^8,9. MALDI et DESI ont été utilisés pour déterminer la composition de structures cristallines induites par des médicaments dans le rein de lapins traités; Ces structures sont principalement composées de métabolites formés par la déméthylation et/ou l’oxydation du médicament¹⁰. De plus, le MSI a été appliqué à la localisation de la distribution métabolique de la toxicité des médicaments dans les organes cibles. Cependant, les cellules dans les tissus végétaux varient et sont différentes des animaux et nécessitent des procédures de sectionnement spéciales.

Chez les plantes, en utilisant l’imagerie MALDI, jusqu’à présent, la distribution de différents composés dans la tige de blé (Triticum aestivum), le soja (Glycine max), les graines de riz (Oryza sativa), les fleurs et racines d’Arabidopsis thaliana et les graines d’orge (Hordeum vulgare) a été analysée 11,12,13,14,15,16,17,18 . Des études récentes ont rapporté que DESI-MSI émerge dans l’analyse des métabolites des médicaments et produits naturels, en particulier dans les MTC telles que Ginkgo biloba, Fuzi et Artemisia annua L 19,20,21. Dans ces études, les protocoles de préparation des échantillons de matériel végétal diffèrent, et certains nécessitent un équipement plus complexe, comme un microtome de congélation. DESI-MSI a des exigences strictes pour la planéité de surface de l’échantillon détecté. Lors de l’analyse de l’organe ou du tissu d’un animal, l’échantillon est généralement fabriqué par cryo-sectionnement²². Cependant, la procédure de cryosection est compliquée et plus coûteuse, et la méthode de température de coupe optimale (OCT) adhésive couramment utilisée a un signal fort lors de l’imagerie. En outre, les tissus médicinaux de la MTC varient; par exemple, la racine de Salvia miltiorrhiza, connue sous le nom de Danshen en chinois, est utilisée en médecine, tandis que dans Zisu (Perilla frutescens), la feuille est utilisée^23,24. Par conséquent, il est nécessaire d’améliorer les procédures de préparation des échantillons afin de promouvoir l’utilisation du DESI dans l’analyse des métabolites pour la MTC.

En tant qu’herbe vivace et MTC couramment utilisée, S. miltiorrhiza a été initialement enregistrée dans la plus ancienne monographie de médecine, Shennong’s Classic of Materia Medica (connu sous le nom de Shennong Bencao Jing en chinois). Dans cette étude, nous avons optimisé les procédures de sectionnement et d’imagerie DESI et développé une méthode plus rentable pour identifier la distribution et catégoriser les composés dans les tissus de S. miltiorrhiza. Cette méthode peut également pallier les inconvénients liés aux tissus secs - qu’ils se fracturent généralement facilement sous le souffle d’azote - et favoriser le développement de la MTC. L’étude favorisera la normalisation de la MTC/médecine ethnique pour les technologies liées à la recherche.

Protocole

1. Préparation de l’échantillon

1. Ramassez les racines et les feuilles nettoyées d’une plante de Salvia miltiorrhiza âgée de 2 ans (figure 1A) et tranchez directement à la main une épaisseur transversale d’environ 3 à 5 mm. Ensuite, collez l’échantillon sur une lame de verre de microscope à adhérence à l’aide d’un ruban adhésif double face (Figure 1B).
   REMARQUE : Assurez-vous que la taille de la bande recto-verso est supérieure à celle de l’échantillon. Si les tissus sont séchés, faites-les tremper dans de l’eau ou 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit avant de les trancher.
2. Placez une autre lame de verre de microscope au-dessus de l’échantillon et enveloppez les deux lames de verre avec un film d’étanchéité comme un sandwich (Figure 1C). Congeler l’échantillon sandwich à -80 °C pendant au moins 4 h, puis le soumettre à un vide à air pendant 2 h (figure 1D) avec les paramètres de réglage suivants : température du piège à -75-82 °C et jauge à vide à 2,5 à 3,7 Pa.
   REMARQUE: Assurez-vous que les deux lames de verre sont parallèles lors de l’emballage du film d’étanchéité pour garder la surface de l’échantillon intacte. Si les tissus végétaux ont une teneur élevée en humidité, prolongez le temps de vide à 3 h. Ne pas dépasser 5 h, sinon les tissus se fractureront facilement.
3. Conserver les échantillons sandwich à -80 °C jusqu’à l’analyse. Amener les échantillons à température ambiante dans un dessiccateur pour éviter la condensation sur la surface de l’échantillon. Ensuite, soumettez l’exemple à une application matricielle.

2. Installation de l’unité d’ionisation par électropulvérisation de désorption (DESI)

1. Mettre en œuvre la configuration du détecteur et l’étalonnage de masse de l’instrument en mode ESI; effectuer la configuration du détecteur à l’aide de leucine enképhaline (LE) dans une solution eau-acétonitrile (1:1 v/v) et effectuer l’étalonnage de masse avec le formate de sodium (NaFA) dans une solution eau-isopropanol (1:1 v/v).
2. Retirez la source ESI et montez l’unité DESI sur le spectromètre de masse. Connectez l’alimentation en gaz N₂ à l’unité DESI et réglez la pression du gaz à environ 0,5 MPa (Figure 2A). Il n’est pas nécessaire de ventiler l’instrument lors de l’échange de sources.
3. Remplir la seringue de 5 mL avec du LE et de l’acide formique dans une solution eau-méthanol (1:9 v/v) et fixer la seringue à la pompe à seringue haute performance pour fournir un solvant pour l’ionisation des produits chimiques dans l’échantillon (Figure 2B).
4. Fixez un solvant capillaire à la seringue et au pulvérisateur DESI (figure 2C). Le solvant fournissant le capillaire est un capillaire standard de 75 μm de diamètre intérieur et de 375 μm de diamètre extérieur; il est plutôt étroit et se bloque facilement par les impuretés, donc les solvants utilisés dans les processus de numérisation doivent être de qualité MS et filtrés avant utilisation pour réduire le risque de blocage.
5. Démarrez la pompe à seringue et réglez la vitesse de perfusion à 2 μL/min pour obtenir un débit et une pulvérisation constants du solvant (Figure 2B). Éteignez la vanne de gaz N₂ , puis après environ 15 s allumez-la; Une petite goutte de solvant sera soufflée sur la scène et la pulvérisation peut être vue si le flux de solvant est dans un état constant.
6. Ajustez la position du pulvérisateur en fonction de l’angle de pulvérisation, de l’axe XYZ, de la saillie et de la hauteur (Figure 2D). Utilisez des marqueurs rouges et noirs comme références pour optimiser le signal de spectrométrie de masse, afin d’obtenir une intensité de signal supérieure à 1 x 10⁵ en mode sensibilité (Figure 2E).
   1. La saillie du pulvérisateur est le facteur le plus important qui affecte l’intensité du signal; régler la saillie en changeant le protecteur de gaz N₂ avec une clé de 5 mm. La direction de pulvérisation influence la qualité de l’image de masse; Faites pivoter le pulvérisateur jusqu’à ce que le jet soit droit. Une fois que la saillie est ajustée à la meilleure position d’intensité du signal, essayez de ne pas la modifier lors de l’échange de sources.
7. Après toutes les étapes ci-dessus, la configuration est prête pour les expériences, et la configuration est normalement stable pendant >3 semaines d’utilisabilité, observée après la configuration initiale.

3. Acquisition d’images DESI-MS

1. Pour DESI-MSI, n’effectuer aucun prétraitement de l’échantillon. Pour les échantillons qui ont déjà un prétraitement, minimisez les étapes de prétraitement autant que possible. Par exemple, certains échantillons ne peuvent être réalisés qu’avec un support de montage, alors retirez l’excès de média sur les lames si possible.
2. Prenez une image de l’échantillon sur la diapositive (Figure 3A). Ne touchez pas la surface de l’échantillon pour éviter toute prise d’impureté.
3. Placez la glissière sur la position de la plaque sur la scène DESI. La scène a deux positions de plaque, A et B; Il est important de se rappeler la bonne position. Utilisez des glissières standard (75 mm x 25 mm) ou une glissière complète, sinon la glissière ne rentrera pas dans la position et ne pourra pas être maintenue de manière stable. Une diapositive complète (120 mm x 80 mm) peut accueillir jusqu’à quatre diapositives et dispose donc d’une zone beaucoup plus grande pour les expériences.
4. Ouvrez le logiciel de traitement d’image de masse haute définition, définissez une nouvelle plaque dans l’onglet Acquérir et sélectionnez la bonne position de plaque (A ou B) et le type de plaque. Sur la page de sélection d’image, sélectionnez les quatre coins de la diapositive, puis l’image est ajustée automatiquement à l’orientation correcte (Figure 3A).
5. Définir les paramètres MS; le type d’expérience couramment utilisé est le mode DESI-MS, dans lequel seul l’ion parent sera détecté. L’instrument ne peut utiliser qu’une seule polarité dans une expérience; Par conséquent, sélectionnez la polarité comme positive ou négative. Pour obtenir plus d’informations sur les produits chimiques en petites quantités, appliquez le mode sensibilité (Figure 3B).
6. Dessinez un rectangle pour définir la zone de numérisation dans l’onglet Modèle et définissez la taille en pixels. En règle générale, pour le mode DESI-MS, gardez les tailles X et Y du pixel égales. Définissez la fréquence de numérisation sur 5 fois la taille en pixels (Figure 3C).
7. Enregistrez le projet et exportez une feuille de calcul pour le logiciel d’acquisition de spectrométrie de masse.
8. Ouvrez le logiciel d’acquisition de spectrométrie de masse, importez la feuille de calcul et enregistrez-la en tant que nouvelle liste d’échantillons. Appuyez sur Démarrer l’exécution pour lancer l’analyse MSI. Plusieurs images peuvent être ajoutées à la file d’attente des expériences en important davantage de feuilles de calcul.

4. Traitement des données DESI-MSI et visualisation

1. Chargez le fichier de données de l’échantillon dans le logiciel de traitement d’image de masse et définissez les paramètres pour le traitement d’image DESI (Figure 3D). Comme la leucine enképhaline a été utilisée pour la masse de verrouillage interne, et que la masse de verrouillage est le seul point pour identifier la polarité de l’expérience, il est d’une grande importance de définir la masse de verrouillage correcte. Définissez les valeurs suivantes : pour le mode positif : 556.2772 ; Pour le mode négatif : 554.2620.
2. Il est possible de construire une liste de produits chimiques cibles, auquel cas le résultat du traitement se concentrera sur les produits chimiques de la liste cible. Chargez le fichier de données traitées pour visualiser l’image DESI de l’échantillon. Cliquez sur le bouton « Normalisation » pour normaliser les données par chromatographie ionique totale (TIC) afin d’obtenir l’intensité relative d’un produit chimique spécifique à la référence, puis différents échantillons peuvent être comparés les uns aux autres (Figure 3E).
3. Dessiner une région d’intérêt (ROI) et copier plusieurs copies sur l’exemple d’image; Les retours sur investissement peuvent être réalisés sur différentes images. Sélectionnez tous les ROI et exportez l’analyse multivariée (MVA) pour extraire les informations MS de tous les ROI pour MVA (Figure 3F).

Résultats

Ce protocole peut conduire à l’identification et à la distribution de composés dans des échantillons de plantes. Dans l’image MS d’un m / z spécifique, la couleur de chaque pixel représente l’intensité relative du m / z, peut donc être associée à la distribution naturelle et à l’abondance de l’ion métabolite dans l’échantillon. Plus l’abondance du produit chimique à la position de collecte est élevée, plus la couleur est brillante. La barre de l’image (Figure 4A-D

Discussion

L’émergence de la technologie MS a ouvert une nouvelle perspective dans la recherche sur les produits naturels au niveau moléculaire au cours des dernières années²⁴. L’instrument MS, avec sa sensibilité élevée et son débit élevé, permet une analyse ciblée et non ciblée des métabolites dans les produits naturels, même avec une concentration à l’état de traces²⁵. Par conséquent, la SEP est actuellement largement utilisée dans le domaine de la chimie de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Fisher	CAS:67-63-0	HPLC grade
Acetonitrile	Sigma-aldrich	Number-75-05-8	LC-MS grade
Adhesion Microscope slides	Citotest scientific	80312-3161	Microscope glass slides  can adhere to  the sample
Air cooled dry vacuum pump	EYELA	FDU-2110	Air-vaccum equipment at -80°C
Formic Acid	ACS	F1089 | 64-18-6	LC-MS grade
LE (Leucine Enkephalin)	Waters	186006013-1	LC-MS grade
Methanol	Sigma-aldrich	Number-67-56-1	LC-MS grade
Parafilm	Bemis Company	sc-200288	Laboratory Sealing Film
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	V900894	Reagent grade
Q-Tof Mass Spectrometer with DESI source	Waters	Synapt XS