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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo introduce el mapeo óptico de doble colorante de corazones de ratón obtenidos de animales de tipo salvaje y knock-in afectados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluyendo mediciones electrofisiológicas de voltaje transmembrana y transitorios intracelulares de Ca2+ con alta resolución temporal y espacial.

Resumen

El trastorno cardíaco proarrítmico taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT) se manifiesta como episodios de taquicardia ventricular polimórfica después de la actividad física, el estrés o la provocación con catecolaminas, que pueden deteriorarse hasta convertirse en una fibrilación ventricular potencialmente mortal. El corazón de ratón es una especie muy extendida para modelar enfermedades arrítmicas cardíacas hereditarias, incluida la CPVT. El mapeo óptico simultáneo del potencial transmembrana (Vm) y los transitorios de calcio (CaT) de corazones de ratón perfundidos por Langendorff tiene el potencial de dilucidar los mecanismos subyacentes a la arritmogénesis. En comparación con la investigación a nivel celular, la técnica de mapeo óptico puede probar algunos parámetros electrofisiológicos, como la determinación de la activación, la velocidad de conducción, la duración del potencial de acción y la duración de CaT. En este artículo se presenta la configuración de la instrumentación y el procedimiento experimental para el mapeo óptico de alto rendimiento de CaT y Vm en corazones murinos de tipo salvaje y heterocigotos RyR2-R2474S/+, combinados con estimulación eléctrica programada antes y durante el desafío con isoproterenol. Este enfoque ha demostrado ser un método factible y fiable para el estudio mecánico de la enfermedad por TVPC en una preparación cardíaca de ratón ex vivo.

Introducción

La taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVPC) se manifiesta como episodios de taquicardia ventricular polimórfica (TVP) después de la actividad física, el estrés o la provocación con catecolaminas, que pueden deteriorarse hasta convertirse en una fibrilación ventricular potencialmente mortal 1,2,3,4 . La evidencia reciente después de su primer informe como un síndrome clínico en 1995 implicó mutaciones en siete genes, todos involucrados en la liberación de Ca2+ del almacén reticular sarcoplásmico (SR) en esta condición: el receptor de rianodina 2 (RyR2) que codifica el receptor de rianodina 2 (RyR2) de los canales de liberación de Ca2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2 que codifica la calsequestinacardíaca 8, TRDN codificando la proteína SR de unión triadina 9, y CALM1 9, CALM2 10 y CALM3 codificando de manera idéntica la calmodulina11,12. Estos patrones genotípicos atribuyen los eventos arrítmicos a la liberación patológica no regulada del almacén de SR Ca2+12.

La liberación espontánea de Ca 2+ de SR se puede detectar como chispas de Ca 2+ u ondas de Ca 2+, lo que activa el intercambiador de Na+/Ca 2+ (NCX). El intercambiador de un Ca2+ por tres Na+ genera una corriente hacia adentro, que acelera la despolarización diastólica y conduce el voltaje de la membrana al umbral del potencial de acción (AP). En ratones knock-in de RyR2, el aumento de la actividad de RyR2R4496C en el nódulo sinoauricular (SAN) conduce a una disminución imprevista de la automaticidad de la SAN por la disminución dependiente de Ca 2+ de la depleción de ICa,L y SR Ca2+ durante la diástole, identificando alteraciones fisiopatológicas subcelulares que contribuyen a la disfunción de la SAN en pacientes con CPVT13,14. La aparición de las ondas Ca 2+ citosólicas cardiomiocíticas relacionadas es más probable después de los aumentos en el citosólico de fondo [Ca2+] después de la sensibilización a RyR por catecolamina, incluido el isoproterenol (ISO).

Quedan por determinar los cambios cinéticos detallados en la señalización de Ca 2+ después de la liberación de Ca2+ mediada por RyR2 en respuesta a la activación del potencial de acción (PA) que puede ser la causa de las arritmias ventriculares observadas en modelos de CPVT cardíaca intacta para toda la gama de genotipos de RyR2 notificados12. Este artículo presenta la configuración de la instrumentación y el procedimiento experimental para el mapeo de alto rendimiento de las señales de Ca2+ y los potenciales transmembrana (Vm) en corazones murinos de tipo salvaje (WT) y heterocigotos RyR2-R2474S/+, combinados con estimulación eléctrica programada antes y después del desafío con isoproterenol. Este protocolo proporciona un método para el estudio mecanicista de la enfermedad CPVT en corazones aislados de ratón.

Protocolo

Para los experimentos se utilizaron ratones machos de tipo salvaje de 10 a 14 semanas de edad o ratones RyR2-R2474S/+ (fondo C57BL/6) con un peso de 20-25 g. Todos los procedimientos han sido aprobados por el comité de cuidado y uso de animales de la Universidad Médica del Sudoeste, Sichuan, China (aprobación NO:20160930) de conformidad con las directrices nacionales bajo las que opera la institución.

1. Preparación

  1. Soluciones de stock
    1. Solución madre de blebistatina: Añadir 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) al 100% en el matraz original que contiene 2,924 mg de (-) blebbistatina en polvo hasta alcanzar una concentración de 10 mM.
    2. Indicador de voltaje RH237 solución madre: Añadir 1 mL de DMSO al 100% en el matraz original con 1 mg de polvo RH237 para lograr una concentración de 2,01 mM.
    3. Solución madre indicadora de calcio Rhod-2 AM: Agregue 1 mL de DMSO al 100% en 1 mg de polvo Rhod-2 AM para alcanzar una concentración de 0.89 mM.
    4. Solución madre de Pluronic F127: Añadir 1 ml de DMSO al 100 % en 200 mg de Pluronic F127 para alcanzar una concentración del 20 % p/v (0,66 mM).
    5. Aliquotar las soluciones madre en tubos de PCR de 200 μL en 21-51 μL (21 μL de RH237, 31 μL de Rhod-2 AM y 51 μL de blebbistatina) para uso único o doble para evitar la congelación y descongelación repetidas. A continuación, envuelva las soluciones con papel de aluminio y guárdelas a -20 °C, excepto la solución madre Pluronic F127 colocada en una habitación oscura a temperatura ambiente.
  2. Solución de perfusión
    1. Solución de Krebs (en mM): Prepare 1 L de solución de Krebs (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 y glucosa 10).
    2. Filtrar la solución con un filtro de aguja aséptico de 0,22 μm y oxigenar con 95% Ø 2/5% CO2.
    3. Tome 40 ml de solución de Krebs en un tubo centrífugo de 50 ml y guárdelo a 4 °C para el aislamiento cardíaco de seguimiento.
  3. El sistema de perfusión y el dispositivo de mapeo óptico de Langendorff
    1. Configure el sistema de perfusión de Langendorff.
      1. Abra el baño de agua y ajuste la temperatura a 37 °C.
      2. Lavar el sistema de perfusión Langendorff con 1 L de agua desionizada.
      3. Perfundir la solución del tracto de admisión y ajustar la velocidad de salida a 3,5-4 ml/min. A continuación, oxigenar la perfusión con gas O 2/CO2 (95%/5%) a 37 °C.
        NOTA: Nunca se permite una burbuja en el sistema de perfusión.
    2. Prepare el sistema de mapeo óptico.
      1. Instale la cámara del dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones (EMCCD), la cámara (512 × 512 píxeles), la lente (aumento de 40x), los diodos emisores de luz (LED) divisores de longitud de onda, el monitor de electrocardiograma (ECG) y el electrodo de estimulación (Figura 1).
      2. Ajuste la distancia de trabajo adecuada desde la lente hasta la posición del corazón.
      3. Coloque dos LED en la posición diagonal del baño termostático para una iluminación uniforme, proporcionando una longitud de onda de 530 nm para generar luz de excitación. Utilice un filtro con recubrimiento catódico ET525/50 para eliminar cualquier luz fuera de banda de los LED.
      4. Ajuste el interruptor de la manija para lograr un cuadrado igual de la superficie objetivo, haciendo que las imágenes de voltaje y calcio aparezcan adecuadamente en la interfaz de adquisición.
      5. Gire la apertura de la lente al diámetro máximo para evitar cualquier fuga de señales de voltaje o calcio.
      6. Ajuste la lente de la cámara a una altura adecuada, ya que sirve una distancia de trabajo fina al baño termostático, se usa principalmente 10 cm.
      7. Encienda la cámara para obtener una temperatura de muestreo estable a -50 °C.

2. Procedimientos

  1. Extracción de corazón de ratón, canulación y perfusión
    1. Inyectar intraperitonealmente a los animales con solución de avertina (1,2%, 0,5-0,8 mL) y heparina (200 unidades) para minimizar el sufrimiento y el reflejo del dolor y prevenir la formación de coágulos sanguíneos. Después de 15 minutos, sacrifique a los animales por luxación cervical.
    2. Abra el cofre con unas tijeras, extraiga el corazón con cuidado y colóquelo en la solución fría de Krebs (4 °C, 95%Ø2, 5% CO2) para ralentizar el metabolismo y proteger el corazón.
    3. Extraer el tejido circundante de la aorta, canular la aorta con una aguja de canulación hecha a medida (diámetro exterior: 0,8 mm, diámetro interior: 0,6 mm, longitud: 27 mm) y fijarla con una sutura de seda 4-0.
    4. Perfundir el corazón con el sistema Langendorff a una velocidad constante de 3,5-4,0 mL/min y mantener la temperatura a 37 ± 1 °C.
      NOTA: Todos los procedimientos posteriores se realizan en esta condición.
    5. Inserte un pequeño tubo de plástico (0,7 mm de diámetro, 20 mm de longitud) en el ventrículo izquierdo para liberar la congestión de la solución en la cámara y evitar la sobrecarga.
  2. Desacoplador de excitación-contracción y carga de doble colorante
    1. Coloque dos cables en la perfusión en el baño, encienda las potencias de la caja del amplificador de ECG y el controlador de estimulación eléctrica, y luego inicie el software de ECG de referencia y monitoree el ECG continuamente.
    2. Realice los pasos siguientes en la oscuridad cuando el corazón alcance una condición de estado estable (el corazón late rítmicamente a ~ 400 lpm).
    3. Mezcle 50 μL de solución madre de blebbistatina de 10 mM con 50 mL de solución de Krebs para alcanzar una concentración de 10 μM. Perfunda constantemente la mezcla de solución de blebbistatina-Krebs en el corazón durante 10 minutos para desacoplar la contracción de la excitación y evitar artefactos de contracción durante la filmación.
    4. Use una linterna roja para verificar si la contracción del corazón se detiene por completo, ya que la contracción influirá en la calidad de la carga de tinte.
    5. Después de desacoplar la excitación-contracción, mezcle 15 μL de solución madre Rhod-2 AM con 15 μL de solución madre Pluronic F127 en 50 ml de solución Krebs para lograr las concentraciones finales de 0,267 μM Rhod-2 AM y 0,198 μM Pluronic F127. A continuación, perfundir el corazón de forma continua con la solución de trabajo Rhod-2 AM durante 15 minutos en el sistema de perfusión de Langendorff.
    6. Mantenga el suministro de oxígeno durante la carga del colorante de calcio intracelular. Dado que las burbujas se forman fácilmente en Pluronic F127, inserte una trampa de burbujas en el sistema de perfusión para evitar la embolización gaseosa de las coronarias.
    7. Diluir 10 μL de solución madre RH237 en 50 mL de perfusión para alcanzar la concentración final a 0,402 μM y realizar la carga durante 10 minutos.
    8. Al final de la carga de doble colorante, tome una secuencia de fotos para asegurarse de que tanto las señales de voltaje como las de calcio sean adecuadas para el análisis (sin interacción entre dos señales).
  3. Mapeo óptico e inducción de arritmias
    NOTA: El mapeo óptico comienza después del cese de la contracción y una carga de tinte adecuada, y el corazón se perfunde consecutivamente como en los pasos descritos anteriormente en 2.1 (4).
    1. Encienda los dos LED para las luces de excitación y ajuste su intensidad en un rango adecuado (lo suficientemente fuerte para la iluminación y una filmación relativamente sencilla, pero no demasiado robusto para la sobreexposición).
    2. Coloque el corazón debajo del dispositivo de detección, asegúrese de que esté bajo la iluminación adecuada de dos LED y ajuste el diámetro del punto de luz a 2 cm.
    3. Ajuste la distancia de trabajo desde la lente hasta el corazón en 10 cm, lo que proporciona una frecuencia de muestreo de casi 500 Hz y una resolución espacial de 120 x 120 μm por píxel.
    4. Abra el software de muestreo de señal para controlar la cámara digitalmente y capturar señales de voltaje y calcio simultáneamente.
    5. Inicie el estimulador de campo miopacer y establezca el patrón de estimulación en Lógica de transistor de transistores (TTL), 2 ms de duración de estimulación para cada pulso y 0,3 V como intensidad inicial.
    6. Utilice 30 estímulos consecutivos de 10 Hz S1 para probar el umbral de tensión diastólica del corazón impulsado por el software de registro de ECG. Aumente gradualmente la amplitud del voltaje hasta que se realice la captura 1:1 (verifique la onda QRS del monitor de ECG, el potencial de acción (AP) y las señales transitorias de calcio (CaT).
    7. Después de determinar el umbral de voltaje, marque el ritmo del corazón a una intensidad de 2 veces el umbral de voltaje diastólico con un par de electrodos de platino conectados al epicardio del ápice del ventrículo izquierdo (VI).
    8. Implementar el protocolo S1S1 para medir el calcio o el potencial de acción de las alternativas y las propiedades de restitución. Mantenga el ritmo del corazón consecutivamente a una duración de ciclo básico de 100 ms, disminuyendo 10 ms de la duración del ciclo cada secuencia siguiente hasta alcanzar los 50 ms. Cada episodio incluye 30 estímulos consecutivos con un ancho de pulso de 2 ms. Al mismo tiempo, inicie el mapeo óptico antes de la estimulación (el tiempo de muestreo incluye ~ 10 ritmos sinusales y la duración de la estimulación).
    9. Para medir el período refractario efectivo (ERP) ventricular mediante el protocolo de estímulo S1S2, comience con una duración del ciclo de estimulación S1S1 de 100 ms con un S2 acoplado a 60 ms con una disminución de paso de 2 ms hasta que S2 no pueda capturar el complejo QRS ectópico.
    10. Para la inducción de arritmias, realice estimulación continua perpetua de 50 Hz (50 estimulaciones eléctricas continuas con un ancho de pulso de 2 ms) y realice el mismo episodio de estimulación después de un intervalo de reposo de 2 s.
    11. Observe cuidadosamente los registros de ECG durante el período continuo de estimulación de alta frecuencia para que los registros de mapeo óptico simultáneos puedan comenzar rápidamente cuando se genere una onda de ECG arrítmica interesante (dado que la mayoría de las arritmias cardíacas son inducidas por estimulación eléctrica, las señales ópticas se muestrean 2-3 s antes de la estimulación de ráfaga en caso de pérdida de eventos cardíacos importantes).
    12. Imagen con cámara EMCCD (frecuencia de muestreo: 500 Hz, tamaño de píxel: 64 x 64).
  4. Análisis de datos
    1. Carga de imágenes y procesamiento de señales
      1. Presione Seleccionar carpeta y cargar imágenes para cargar las imágenes en el software de adquisición de imágenes para el análisis de datos de video masivo semiautomático de acuerdo con la configuración y el protocolo descritos anteriormente15,16.
      2. Introduzca los parámetros de muestreo correctos (como el tamaño de píxel y la velocidad de fotogramas).
      3. Establezca el umbral de la imagen mediante la entrada manual y seleccione la región de interés (ROI).
      4. Implemente un filtro espacial gaussiano de 3 x 3 píxeles, un filtro Savitzky-Goaly y una corrección de línea de base de sombrero de copa.
      5. Pulse Imágenes de proceso para eliminar la línea de base y calcular los parámetros electrofisiológicos, como APD80 y CaTD50.
    2. Análisis de parámetros electrofisiológicos
      1. Establezca el tiempo de inicio de APD en el pico y el punto terminal en 80% de repolarización (APD80) para el cálculo de APD80. Del mismo modo, la hora de inicio de CaTD se define como el pico, y el punto terminal se define como la relajación del 80%.
      2. La medición de la velocidad de conducción (CV) depende del tamaño del píxel y del tiempo de conducción del potencial de acción entre dos píxeles o más. Calcule la velocidad promedio de todos los píxeles elegidos: esta es la velocidad media de conducción de la región seleccionada. Genere simultáneamente los mapas isócronos correspondientes para obtener una visión clara de la dirección de conducción.
        NOTA: O'Shea et al.15 reportaron la medición CV en detalle.
      3. Para el análisis de alternancias y arritmias, las alternancias de calcio se definen como una amplitud de pico grande y pequeña continua que aparece alternativamente. Utilice la relación de amplitud de pico para evaluar la gravedad de las alternancias dependientes de la frecuencia (1-A2/A1). Aplicar mapas de fase para analizar arritmias complejas como la taquicardia ventricular (TV). Busque los rotores que aparecen claramente en una región específica a medida que los rotores se desplazan.

Resultados

El mapeo óptico ha sido un enfoque popular en el estudio de arritmias cardíacas complejas en la última década. La configuración de mapeo óptico consiste en una cámara EMCCD, que proporciona una frecuencia de muestreo de hasta 1.000 Hz y una resolución espacial de 74 x 74 μm para cada píxel. Permite una relación señal-ruido bastante alta durante el muestreo de la señal (Figura 1). Una vez que el corazón perfundido por Langendorff alcanza un estado estable y finaliza la carga de ...

Discusión

Basándonos en nuestra experiencia, las claves para un mapeo óptico de doble colorante exitoso de un corazón de ratón incluyen una solución y un corazón bien preparados, la carga de colorante, lograr la mejor relación señal-ruido y reducir el artefacto de movimiento.

Preparación de la solución
La solución de Krebs es esencial para el éxito de un experimento cardíaco. Las soluciones madre de MgCl 2 y CaCl2 (1 mol/L) se preparan de antemano t...

Divulgaciones

Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este estudio cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81700308 a XO y 31871181 a ML, y 82270334 a XT), el Programa de Apoyo a la Ciencia y la Tecnología (CN) de la provincia de Sichuan (2021YJ0206 a XO, 23ZYZYTS0433 y 2022YFS0607 a XT, y 2022NSFSC1602 a TC) y el Laboratorio Estatal Clave de Química e Ingeniería Molecular de Recursos Medicinales (Universidad Normal de Guangxi) (CMEMR2017-B08 a XO), MRC (G10031871181 a ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE en Oxford (ML) subvenciones.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm syringe filterMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaN/ATo filter solution
15 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011150
1 mL Pasteur pipetteBeijing Labgic Technology Co., Ltd. China00900026
1 mL SyringeB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μL PCR tubeSangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. ChinaF611541-0010Aliquote the stock solutions  to avoid repeated freezing and thawing
50 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011500Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation
585/40 nm filterChroma TechnologyN/AFilter for calcium signal
630 nm long-pass filterChroma TechnologyG15604AJFilter for voltage signal
Avertin (2,2,2-tribromoethanol)Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United KingdomT48402-100GTo minimize suffering and pain reflex
BlebbistatinTocris Bioscience, Minneapolis, MN, United StatesSLBV5564Excitation-contraction uncoupler to  eliminate motion artifact during mapping
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBK1794VFor Tyrode's solution
Custom-made thermostatic bathMappingLab, United KingdomTBC-2.1To keep temperature of perfusion solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Solvent for dyes
Dumont forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAF030
ElectroMap softwareUniversity of BirminghamN/AQuantification of electrical parameters
EMCCD cameraEvolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United StatesA18G150001Acquire images for optical signals
ET525/36 sputter coated filterChroma Technology319106Excitation filter
GlucoseSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBT4811VFor Tyrode's solution
Heparin SodiumChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China(H51021209)To prevent blood clots in the coronary artery
 Iris forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAA010
IsoproterenolMedChemExpress, Carlsbad, CA, United StatesHY-B0468/CS-2582
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS5003For Tyrode's solution
MacroLEDCairn Research, Faversham, United Kingdom7355/7356The excitation light of fluorescence probes
MacroLED light sourceCairn Research, Faversham, United Kingdom7352Control the LEDs
Mayo scissorsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYBC010
MetaMorphMolecular DevicesN/AOptical signals sampling
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBS6841VFor Tyrode's solution
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, United KingdomM5337Connect the electrical stimulator and Spike2 software
MyoPacer EP field stimulatorIon Optix Co, Milton, MA, United StatesS006152Electric stimulator
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS2340VFor Tyrode's solution
NaH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBW9042For Tyrode's solution
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBX3605For Tyrode's solution
NeuroLog SystemDigitimerNL905-229For ECG amplifier
OmapScope5MappingLab, United KingdomN/ACalcium alternans and arrhythmia analysis
Ophthalmic scissorsHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, ChinaT4-3904
OptoSplitCairn Research, Faversham, United Kingdom6970Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm  simultaneously
Peristalic pumpLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,BT100-2JTo pump the solution
Petri dishBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Carlsbad, CA, United States1899021To enhance the loading with Rhod2AM
RH237Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States1971387Voltage-sensitive dye
Rhod-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, United States1890519Calcium indicator
Silica gel tubeLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,96402-16Connect with the peristaltic pump
Silk sutureYuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China20172650032To fix the aorta
Spike2Cambridge Electronic Design limited, United KingdomN/ATo record and analyze ECG data
Stimulation electrodeMappingLab, United KingdomSE1600-35-2020
T510lpxrChroma Technology312461For light source
T565lpxrChroma Technology321343For light source

Referencias

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