JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציג מיפוי אופטי דו-צבעי של לבבות עכברים המתקבלים מחיות בר וחיות בר המושפעות מטכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית, כולל מדידות אלקטרופיזיולוגיות של מתח טרנסממברנה וטרנזיאנטים תוך-תאיים Ca2+ ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה.

Abstract

הפרעת הלב הפרו-אריתמית קטכולמינרגי טכיקרדיה חדרית פולימורפית (CPVT) מתבטאת באפיזודות טכיקרדיה חדרית פולימורפית בעקבות פעילות גופנית, מתח או אתגר קטכולאמין, אשר יכול להידרדר לפרפור חדרים שעלול להיות קטלני. לב עכבר הוא מין נפוץ למידול מחלות הפרעות קצב לב תורשתיות, כולל CPVT. מיפוי אופטי סימולטני של פוטנציאל טרנסממברנה (Vm) ומעברי סידן (CaT) מלבבות עכברים מחוררים לנגנדורף הוא בעל פוטנציאל להבהיר מנגנונים העומדים בבסיס הפרעת קצב. בהשוואה לחקירה ברמה התאית, טכניקת המיפוי האופטי יכולה לבדוק כמה פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים, כגון קביעת ההפעלה, מהירות ההולכה, משך פוטנציאל הפעולה ומשך CaT. מאמר זה מציג את מערך המכשור וההליך הניסיוני למיפוי אופטי בתפוקה גבוהה של CaT ו-V m בלבבות מסוג פרא מורין ו-RyR2-R2474S/+ הטרוזיגוטיים, בשילוב עם קצב חשמלי מתוכנת לפני ובמהלך אתגר האיזופרוטרנול. גישה זו הדגימה שיטה ישימה ואמינה ללימוד מכניסטי של מחלת CPVT בהכנת לב עכבר ex vivo.

Introduction

הפרעת לב תורשתית טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית (CPVT) מתבטאת באפיזודות טכיקרדיה חדרית פולימורפית (PVT) בעקבות פעילות גופנית, מתח או אתגר קטכולאמין, אשר יכולות להידרדר לפרפור חדרים שעלול להיות קטלני 1,2,3,4 . עדויות עדכניות בעקבות הדו"ח הראשון שלה כתסמונת קלינית בשנת 1995 היו מוטציות מעורבות בשבעה גנים, כולם מעורבים בשחרור רשתית סרקופלזמית (SR) Ca 2+ במצב זה: הדיווח הנפוץ ביותר על RYR2 המקודד קולטן ריאנודין 2 (RyR2) של Ca2+ ערוצי שחרור5,6, FKBP12.67, CASQ2 המקודד calsequestrin לב8, TRDN קידוד החלבון SR טריאדין 9, ו- CALM1 9, CALM2 10 ו- CALM3 מקודד באופן זהה קלמודולין11,12. דפוסים גנוטיפיים אלה מייחסים את האירועים הריתמיים לשחרור פתולוגי בלתי מווסת של חנות SR Ca2+12.

שחרור ספונטני של Ca 2+ מ-SR יכול להיות מזוהה כניצוצות Ca 2+ או גלי Ca 2+, אשר מפעיל את מחליף Na+/Ca 2+ (NCX). המחליף של Ca2+ אחד לשלושה Na+ מייצר זרם פנימי, אשר מאיץ את הדפולריזציה הדיאסטולית ומניע את מתח הממברנה לסף פוטנציאל הפעולה (AP). בעכברי RyR2, הפעילות המוגברת של RyR2R4496C בצומת הסינואפרוזדורי (SAN) מובילה לירידה בלתי צפויה באוטומטיות של SAN על ידי ירידה תלוית Ca 2+ של דלדול I Ca,L ו- SR Ca2+ במהלך דיאסטולה, זיהוי שינויים פתופיזיולוגיים תת-תאיים התורמים לתפקוד לקוי של SAN בחולי CPVT13,14. הופעה של גלי Ca 2+ ציטוסוליים הקשורים לקרדיומיוציטים היא סבירה יותר בעקבות עלייה בציטוסוליים ברקע [Ca2+] בעקבות רגישות RyR על ידי קטכולאמין, כולל איזופרוטרנול (ISO), אתגר.

שינויים קינטיים מפורטים באיתות Ca 2+ בעקבות שחרור Ca2+ בתיווך RyR2 בתגובה להפעלת פוטנציאל פעולה (AP) שעשויים להיות הגורם להפרעות קצב חדריות שנצפו במודלים שלמים של CPVT לב נותרו לקביעה עבור הטווח המלא של גנוטיפים מדווחים של RyR212. מאמר זה מציג את מערך המכשור ואת ההליך הניסיוני למיפוי בתפוקה גבוהה של אותות Ca2+ ופוטנציאלים טרנסממברנליים (Vm) בלבבות מסוג בר מורין (WT) ו- RyR2-R2-R2474S/+ הטרוזיגוטיים, בשילוב עם קצב חשמלי מתוכנת לפני ואחרי אתגר איזופרוטרנול. פרוטוקול זה מספק שיטה למחקר מכניסטי של מחלת CPVT בלבבות עכברים מבודדים.

Protocol

עכברי בר זכרים בני 10 עד 14 שבועות או עכברי RyR2-R2474S/+ (רקע C57BL/6) במשקל 20-25 גרם משמשים לניסויים. כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית סאות'ווסט, סצ'ואן, סין (אישור NO:20160930) בהתאם להנחיות הלאומיות לפיהן פועל המוסד.

1. הכנה

  1. פתרונות מלאי
    1. תמיסת מלאי Blebbistatin: הוסף 1 מ"ל של 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) בבקבוק המקורי המכיל 2.924 מ"ג של (-) אבקת blebbistatin כדי להגיע לריכוז של 10 mM.
    2. מחוון מתח RH237 פתרון מלאי: הוסף 1 מ"ל של 100% DMSO בבקבוק המקורי עם 1 מ"ג של אבקת RH237 כדי להשיג ריכוז של 2.01 mM.
    3. אינדיקטור סידן Rhod-2 AM תמיסת מניות: הוסף 1 מ"ל של 100% DMSO לתוך 1 מ"ג של אבקת Rhod-2 AM כדי להגיע לריכוז של 0.89 mM.
    4. תמיסת מלאי Pluronic F127: הוסף 1 מ"ל של 100% DMSO ל-200 מ"ג של Pluronic F127 כדי להגיע לריכוז של 20% w/v (0.66 מילימול).
    5. Aliquot את תמיסות המלאי לתוך צינורות PCR 200-μL ב 21-51 μL (21 μL של RH237, 31 μL של Rhod-2 AM, ו 51 μL של blebbistatin) לשימוש יחיד או כפול כדי למנוע הקפאה חוזרת והפשרה. לאחר מכן, עטפו את התמיסות ברדיד אלומיניום ואחסנו בטמפרטורה של -20°C, למעט תמיסת המלאי Pluronic F127 הממוקמת בחדר חשוך בטמפרטורת הסביבה.
  2. פתרון זילוח
    1. תמיסת קרבס (ב-mM): הכינו 1 ליטר של תמיסת קרבס (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO4 1.0, KCl 4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 וגלוקוז 10).
    2. סנן את התמיסה עם מסנן מחט אספטית 0.22 מיקרומטר וחמצן עם 95% O 2/5% CO2.
    3. קח 40 מ"ל של תמיסת קרבס לתוך צינור צנטריפוגלי 50 מ"ל ואחסן אותו ב 4 ° C לבידוד לב מעקב.
  3. מערכת זילוח לנגנדורף ומכשיר מיפוי אופטי
    1. הגדר את מערכת הזלוף Langendorff.
      1. הפעל את אמבט המים והגדר את הטמפרטורה ל 37 °C (77 °F).
      2. לשטוף את מערכת זילוח Langendorff עם 1 L של מים deionized.
      3. יש לנקב את התמיסה ממערכת היניקה ולהתאים את קצב היציאה ל-3.5-4 מ"ל/דקה. לאחר מכן, חמצן את הפרבוסט עם גז O 2/CO2 (95% / 5%) ב 37 ° C.
        הערה: לעולם אין להכניס בועה למערכת הזילוח.
    2. הכן את מערכת המיפוי האופטי.
      1. התקינו את מצלמת EMCCD (512 × 512 פיקסלים), את העדשה (הגדלה של 40x), את הדיודות פולטות האור (LED) של מפצל אורך הגל, את צג האלקטרוקרדיוגרמה (ECG) ואת אלקטרודת הגירוי (איור 1).
      2. התאימו את מרחק העבודה הנכון מהעדשה למיקום הלב.
      3. הגדר שתי נורות LED במיקום האלכסוני של האמבטיה התרמוסטטית לתאורה אחידה, וספק אורך גל של 530 ננומטר ליצירת אור עירור. השתמש במסנן ET525/50 עם ציפוי מרזב כדי להסיר נורות חוץ-פס עבור נורות ה-LED.
      4. כוונן את מתג הידית כדי להשיג ריבוע שווה של משטח המטרה, כך שתמונות המתח והסידן יופיעו כראוי בממשק הרכישה.
      5. סובב את מפתח הצמצם של העדשה לקוטר המרבי כדי למנוע דליפה של אותות מתח או סידן.
      6. כוונן את עדשת המצלמה בגובה מתאים, מכיוון שהיא משרתת מרחק עבודה נאה לאמבטיה התרמוסטטית, 10 ס"מ משמש בעיקר.
      7. הפעל את המצלמה לטמפרטורת דגימה יציבה ב -50 ° C.

2. נהלים

  1. קצירת לב עכבר, קנולציה וזילוח
    1. תוך צפקית להזריק לבעלי החיים תמיסת אברטין (1.2%, 0.5-0.8 מ"ל) והפרין (200 יחידות) כדי למזער סבל ורפלקס כאב ולמנוע היווצרות קרישי דם. לאחר 15 דקות, להקריב את החיות על ידי נקע צוואר הרחם.
    2. פתחו את החזה בעזרת מספריים, קצרו את הלב בזהירות והכניסו אותו לתמיסת קרבס הקרה (4°C, 95% O 2, 5% CO2) כדי להאט את חילוף החומרים ולהגן על הלב.
    3. מוציאים את הרקמה שמסביב לאבי העורקים, מקננים את אבי העורקים באמצעות מחט קנולציה בהתאמה אישית (קוטר חיצוני: 0.8 מ"מ, קוטר פנימי: 0.6 מ"מ, אורך: 27 מ"מ) ומקבעים אותו בתפר משי 4-0.
    4. לנקב את הלב עם מערכת לנגנדורף במהירות קבועה של 3.5-4.0 מ"ל / דקה ולשמור על הטמפרטורה על 37 ± 1 ° C.
      הערה: כל ההליכים הבאים מבוצעים במצב זה.
    5. הכנס צינור פלסטיק קטן (קוטר 0.7 מ"מ, אורך 20 מ"מ) לחדר השמאלי כדי לשחרר את גודש התמיסה בחדר כדי למנוע עומס יתר.
  2. Uncoupler של עירור-התכווצות והעמסת צבע כפול
    1. הכנס שני מוליכים לתוך הפרבוסט באמבטיה, הפעל את העוצמה של תיבת מגבר האק"ג ובקר הגירוי החשמלי, ולאחר מכן הפעל את תוכנת האק"ג המוזכרת ועקוב אחר האק"ג ברציפות.
    2. בצע את השלבים הבאים בחושך כאשר הלב מגיע למצב יציב (הלב פועם בקצב ~ 400 פעימות לדקה).
    3. יש לערבב 50 μL של 10 mM תמיסת מלאי blebbistatin עם 50 מ"ל של תמיסת קרבס כדי להגיע לריכוז של 10 μM. יש לערבב ללא הרף את תערובת תמיסת הבלביסטטין-קרבס לתוך הלב למשך 10 דקות כדי לשחרר את ההתכווצות מהעירור ולהימנע מתוצרי התכווצות במהלך הצילום.
    4. השתמשו בפנס אדום כדי לבדוק אם התכווצות הלב מפסיקה לחלוטין מכיוון שההתכווצות תשפיע על איכות העמסת הצבע.
    5. לאחר ביטול התכווצות העירור, ערבבו 15 מיקרוליטר של תמיסת מלאי Rhod-2 AM עם 15 מיקרוליטר של תמיסת סטוק פלורונית F127 ב-50 מ"ל של תמיסת קרבס כדי להשיג את הריכוזים הסופיים של 0.267 מיקרומטר Rhod-2 AM ו-0.198 מיקרומטר פלורוני F127. לאחר מכן, לנקב את הלב ברציפות עם פתרון עבודה Rhod-2 AM במשך 15 דקות במערכת זילוח לנגנדורף.
    6. שמור על אספקת החמצן במהלך העמסת צבע סידן תוך תאי. מכיוון שבועות נוצרות בקלות ב- F127 פלורוני, הכנס מלכודת בועות למערכת הזילוח כדי למנוע אמבוליזציה של גזים של הכליליים.
    7. לדלל 10 μL של תמיסת מלאי RH237 לתוך 50 מ"ל של perfusate כדי להגיע לריכוז הסופי ב 0.402 מיקרומטר ולבצע טעינה במשך 10 דקות.
    8. בסוף העמסת הצבע הכפול, צלם רצף של תמונות כדי להבטיח שגם אותות המתח וגם אותות הסידן מספיקים לניתוח (אין אינטראקציה בין שני אותות).
  3. מיפוי אופטי והשראת הפרעות קצב
    הערה: מיפוי אופטי מתחיל לאחר הפסקת התכווצות והעמסת צבע מתאימה, והלב מחורר ברציפות כמו בשלבים המתוארים לעיל ב 2.1 (4).
    1. הפעל את שתי נורות ה- LED עבור אורות עירור וכוונן את עוצמתן בטווח מתאים (חזק מספיק לתאורה וצילום פשוט יחסית אך לא חזק מדי לחשיפת יתר).
    2. שים את הלב מתחת למכשיר האיתור, ודא שהוא נמצא תחת תאורה נאותה של שתי נורות LED, וכוונן את קוטר נקודת האור ל -2 ס"מ.
    3. הגדר את מרחק העבודה מהעדשה ללב ל- 10 ס"מ, מה שנותן קצב דגימה של כמעט 500 הרץ ורזולוציה מרחבית של 120 x 120 מיקרומטר לפיקסל.
    4. פתח את תוכנת דגימת האותות כדי לשלוט במצלמה באופן דיגיטלי כדי ללכוד אותות מתח וסידן בו-זמנית.
    5. הפעל את מגרה שדה המיופסר, והגדר את תבנית הקצב ב- Transistor Transistor Logic (TTL), משך קצב של 2 אלפיות השנייה עבור כל פעימה, ו- 0.3 V כעוצמה התחלתית.
    6. השתמש 30 גירויים רצופים של 10 הרץ S1 כדי לבדוק את סף המתח הדיאסטולי של הלב המונע על ידי תוכנת הקלטת האק"ג. הגדל בהדרגה את משרעת המתח עד ללכידת 1:1 (בדוק גל QRS מצג האק"ג, פוטנציאל הפעולה (AP) ואותות מעבר סידן (CaT).
    7. לאחר קביעת סף המתח, יש לקצב את הלב בעוצמה של פי 2 מסף המתח הדיאסטולי בעזרת זוג אלקטרודות פלטינה המחוברות לאפיקרדיאלי של קודקוד החדר השמאלי (LV) (ELVA).
    8. יישם את פרוטוקול S1S1 כדי למדוד סידן או פעולה פוטנציאלית alternans ותכונות השבה. קצב את הלב ברציפות באורך מחזור בסיסי של 100 מילישניות, והקטנת 10 מילישניות מאורך המחזור בכל רצף עוקב עד שמגיעים ל- 50 מילישניות. כל פרק כולל 30 גירויים רצופים ברוחב פולס של 2 אלפיות השנייה. במקביל, התחל מיפוי אופטי לפני הגירוי (זמן הדגימה כולל ~ 10 מקצבי סינוס ומשך קצב).
    9. כדי למדוד את התקופה העקשנית האפקטיבית החדרית (ERP) באמצעות פרוטוקול גירוי S1S2, התחל עם אורך מחזור קצב S1S1 של 100 אלפיות השנייה עם S2 מצומד ב 60 ms עם ירידה של 2 ms צעד עד S2 נכשל ללכוד קומפלקס QRS חוץ רחמי.
    10. עבור השראת הפרעות קצב, בצע קצב פרץ תמידי של 50 הרץ (50 גירויים חשמליים רציפים עם רוחב פולס של 2 אלפיות השנייה), ובצע את אותו פרק קצב לאחר מרווח של 2 שניות של מנוחה.
    11. התבונן היטב ברישומי אק"ג במהלך תקופת הקצב הרציפה בתדר גבוה, כך שהקלטות המיפוי האופטי בו זמנית יוכלו להתחיל מיד כאשר גל א.ק.ג. מעניין יוצר (מכיוון שרוב הפרעות קצב הלב נגרמות על ידי קצב חשמלי, האותות האופטיים נדגמים 2-3 שניות לפני קצב פרץ במקרה של אובדן אירועים לבביים חשובים).
    12. תמונה באמצעות מצלמת EMCCD (קצב דגימה: 500 הרץ, גודל פיקסל: 64 x 64).
  4. ניתוח נתונים
    1. טעינת תמונות ועיבוד אותות
      1. לחץ על Select Folder and Load Images כדי לטעון את התמונות לתוכנת רכישת התמונות לניתוח נתוני וידאו מסיבי באופן אוטומטי למחצה בהתאם להגדרה ולפרוטוקול שתוארו קודם לכן15,16.
      2. הזינו את פרמטרי הדגימה הנכונים (כגון 'גודל פיקסל ' ו'קצב מסגרות').
      3. הגדר את סף התמונה באמצעות הזנה ידנית ובחר את אזור העניין (ROI).
      4. הטמע מסנן מרחבי גאוסיאני, מסנן Savitzky-Goaly ותיקון קו בסיס עליון.
      5. לחץ על תמונות פרוצס כדי להסיר את קו הבסיס ולחשב את הפרמטרים האלקטרופיזיולוגיים, כגון APD80 ו- CaTD50.
    2. ניתוח פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים
      1. הגדר את זמן האתחול של APD בשיא ואת נקודת הקצה ברפולריזציה של 80% (APD80) לצורך חישוב APD80. באופן דומה, זמן תחילת CaTD מוגדר כשיאו, ונקודת הטרמינל מוגדרת כ-80% הרפיה.
      2. מדידת מהירות ההולכה (CV) תלויה בגודל הפיקסלים ובזמן ההולכה הפוטנציאלי של הפעולה בין שני פיקסלים או יותר. חשב את המהירות הממוצעת מכל הפיקסלים שנבחרו - זוהי מהירות ההולכה הממוצעת של האזור שנבחר. צור מפות איזוכרוניות מתאימות בו זמנית לקבלת תצוגה ברורה של כיוון ההולכה.
        הערה: O'Shea et al.15 דיווחו בפירוט על מדידת קורות החיים.
      3. עבור ניתוח אלטרננים והפרעות קצב, אלטרננים של סידן מוגדרים כמשרעת שיא רציפה גדולה וקטנה המופיעה לחילופין. השתמש ביחס משרעת השיא כדי להעריך את חומרת האלטרננים תלויי התדר (1-A2/A1). החל מפות פאזה כדי לנתח הפרעות קצב מורכבות כמו טכיקרדיה חדרית (VT). חפש את הרוטורים המופיעים באופן מובהק באזור מסוים כאשר הרוטורים זזים.

תוצאות

מיפוי אופטי הוא גישה פופולרית בחקר הפרעות קצב לב מורכבות בעשור האחרון. מערך המיפוי האופטי מורכב ממצלמת EMCCD, המעניקה קצב דגימה של עד 1,000 הרץ ורזולוציה מרחבית של 74 x 74 מיקרומטר לכל פיקסל. הוא מאפשר יחס אות-רעש גבוה למדי במהלך דגימת אות (איור 1). ברגע שהלב המחורר בלנגנדורף מגיע למ?...

Discussion

בהתבסס על הניסיון שלנו, המפתחות למיפוי אופטי מוצלח של לב עכבר בצבע כפול כוללים פתרון מוכן היטב ולב, טעינת צבע, השגת יחס אות לרעש הטוב ביותר והפחתת חפץ התנועה.

הכנת פתרון
פתרון קרבס חיוני לניסוי לב מוצלח. תמיסות מלאי MgCl 2 ו- CaCl2 (1 mol/L) מוכנות מראש בהתחשב בספ...

Disclosures

לאף אחד מהכותבים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81700308 ל- XO ו- 31871181 ל- ML, ו- 82270334 ל- XT), תוכנית התמיכה במדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (CN) (2021YJ0206 ל- XO, 23ZYZYTS0433 ו- 2022YFS0607 ל- XT, ו- 2022NSFSC1602 ל- TC) ומעבדת מפתח המדינה לכימיה והנדסה מולקולרית של משאבים רפואיים (אוניברסיטת גואנגשי הרגילה) (CMEMR2017-B08 ל- XO), MRC (G10031871181 עד ML02647, G1002082, מ"ל), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE באוקספורד (ML).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm syringe filterMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaN/ATo filter solution
15 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011150
1 mL Pasteur pipetteBeijing Labgic Technology Co., Ltd. China00900026
1 mL SyringeB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μL PCR tubeSangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. ChinaF611541-0010Aliquote the stock solutions  to avoid repeated freezing and thawing
50 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011500Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation
585/40 nm filterChroma TechnologyN/AFilter for calcium signal
630 nm long-pass filterChroma TechnologyG15604AJFilter for voltage signal
Avertin (2,2,2-tribromoethanol)Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United KingdomT48402-100GTo minimize suffering and pain reflex
BlebbistatinTocris Bioscience, Minneapolis, MN, United StatesSLBV5564Excitation-contraction uncoupler to  eliminate motion artifact during mapping
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBK1794VFor Tyrode's solution
Custom-made thermostatic bathMappingLab, United KingdomTBC-2.1To keep temperature of perfusion solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Solvent for dyes
Dumont forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAF030
ElectroMap softwareUniversity of BirminghamN/AQuantification of electrical parameters
EMCCD cameraEvolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United StatesA18G150001Acquire images for optical signals
ET525/36 sputter coated filterChroma Technology319106Excitation filter
GlucoseSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBT4811VFor Tyrode's solution
Heparin SodiumChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China(H51021209)To prevent blood clots in the coronary artery
 Iris forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAA010
IsoproterenolMedChemExpress, Carlsbad, CA, United StatesHY-B0468/CS-2582
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS5003For Tyrode's solution
MacroLEDCairn Research, Faversham, United Kingdom7355/7356The excitation light of fluorescence probes
MacroLED light sourceCairn Research, Faversham, United Kingdom7352Control the LEDs
Mayo scissorsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYBC010
MetaMorphMolecular DevicesN/AOptical signals sampling
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBS6841VFor Tyrode's solution
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, United KingdomM5337Connect the electrical stimulator and Spike2 software
MyoPacer EP field stimulatorIon Optix Co, Milton, MA, United StatesS006152Electric stimulator
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS2340VFor Tyrode's solution
NaH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBW9042For Tyrode's solution
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBX3605For Tyrode's solution
NeuroLog SystemDigitimerNL905-229For ECG amplifier
OmapScope5MappingLab, United KingdomN/ACalcium alternans and arrhythmia analysis
Ophthalmic scissorsHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, ChinaT4-3904
OptoSplitCairn Research, Faversham, United Kingdom6970Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm  simultaneously
Peristalic pumpLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,BT100-2JTo pump the solution
Petri dishBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Carlsbad, CA, United States1899021To enhance the loading with Rhod2AM
RH237Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States1971387Voltage-sensitive dye
Rhod-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, United States1890519Calcium indicator
Silica gel tubeLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,96402-16Connect with the peristaltic pump
Silk sutureYuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China20172650032To fix the aorta
Spike2Cambridge Electronic Design limited, United KingdomN/ATo record and analyze ECG data
Stimulation electrodeMappingLab, United KingdomSE1600-35-2020
T510lpxrChroma Technology312461For light source
T565lpxrChroma Technology321343For light source

References

  1. Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
  2. Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
  3. Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
  4. Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
  5. Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
  6. Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
  7. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  8. Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
  9. Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. CACNA1C-related disorders. GeneReviews. , (1993).
  10. Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
  11. Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
  12. Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
  13. Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
  14. Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
  15. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
  16. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
  17. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  18. Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
  19. Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
  20. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
  21. Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  22. Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
  23. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
  24. He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
  25. Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
  26. Mal Baudot, ., et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
  27. Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
  28. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
  29. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  30. Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
  31. Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
  32. He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
  33. Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
  34. Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
  35. Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved