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Résumé

Ce protocole introduit une cartographie optique à double colorant des cœurs de souris obtenus à partir d’animaux de type sauvage et knock-in atteints de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique, y compris des mesures électrophysiologiques de la tension transmembranaire et des transitoires intracellulaires Ca2+ avec une haute résolution temporelle et spatiale.

Résumé

La tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique (TVPC) se manifeste par des épisodes de tachycardie ventriculaire polymorphe à la suite d’une activité physique, d’un stress ou d’un défi aux catécholamines, qui peuvent se détériorer en fibrillation ventriculaire potentiellement mortelle. Le cœur de souris est une espèce répandue pour modéliser les maladies arythmiques cardiaques héréditaires, y compris la TVPC. La cartographie optique simultanée du potentiel transmembranaire (Vm) et des transitoires calciques (CaT) à partir de cœurs de souris perfusés par Langendorff a le potentiel d’élucider les mécanismes sous-jacents à l’arythmogenèse. Par rapport à l’étude au niveau cellulaire, la technique de cartographie optique peut tester certains paramètres électrophysiologiques, tels que la détermination de l’activation, de la vitesse de conduction, de la durée du potentiel d’action et de la durée du CaT. Cet article présente le dispositif d’instrumentation et la procédure expérimentale pour la cartographie optique à haut débit du CaT et de la Vm dans des cœurs murins de type sauvage et hétérozygote RyR2-R2474S/+, combinés à une stimulation électrique programmée avant et pendant le défi isoprotérénol. Cette approche a démontré une méthode réalisable et fiable pour étudier mécanistiquement la maladie CPVT dans une préparation ex vivo de cœur de souris.

Introduction

La tachycardie ventriculaire polymorphe catécholaminergique héréditaire (TVPC) se manifeste par des épisodes de tachycardie ventriculaire polymorphe (TVP) à la suite d’une activité physique, d’un stress ou d’une provocation aux catécholamines, qui peuvent se détériorer en fibrillation ventriculaire potentiellement mortelle 1,2,3,4 . Des preuves récentes à la suite de son premier rapport en tant que syndrome clinique en 1995 ont impliqué des mutations dans sept gènes, tous impliqués dans la libération de Ca 2+ dans le stockage réticulaire sarcoplasmique (SR) dans cette condition : le récepteur RYR2 codant pour la ryanodine 2 (RyR2) le plus fréquemment rapporté des canaux de libération de Ca2+5,6, FKBP12.67, CASQ2 codant pour la calséquestrinecardiaque 8, TRDN codant pour la protéine jonctionnelle SR triadine 9, et CALM1 9, CALM2 10 et CALM3 codant de manière identique pour la calmoduline11,12. Ces profils génotypiques attribuent les événements arythmiques à la libération pathologique non régulée de SR stock Ca2+12.

La libération spontanée de Ca 2+ par SR peut être détectée sous forme d’étincelles de Ca 2+ ou d’ondes de Ca 2+, ce qui active l’échangeur Na+/Ca 2+ (NCX). L’échangeur d’un Ca2+ pour trois Na+ génère un courant entrant, qui accélère la dépolarisation diastolique et conduit la tension membranaire jusqu’au seuil du potentiel d’action (PA). Chez les souris knock-in RyR2, l’activité accrue de RyR2R4496C dans le nœud sino-auriculaire (SAN) conduit à une diminution inattendue de l’automaticité du SAN par une diminution dépendante du Ca 2+ de l’épuisement de l’ICa,L et du SR Ca2+ pendant la diastole, identifiant des altérations physiopathologiques subcellulaires contribuant au dysfonctionnement du SAN chez les patients atteints de CPVT13,14. L’apparition des ondes cytosoliques Ca 2+ cardiomyocytaires associées est plus probable après l’augmentation du cytosolique de fond [Ca2+] à la suite de la sensibilisation RyR par la catécholamine, y compris l’isoprotérénol (ISO).

Les changements cinétiques détaillés dans la signalisation du Ca 2+ après la libération de Ca2+ médiée par RyR2 en réponse à l’activation du potentiel d’action (PA) qui pourrait être la cause des arythmies ventriculaires observées dans les modèles de CPVT cardiaque intacts restent à déterminer pour l’ensemble des génotypes RyR2 rapportés12. Cet article présente le dispositif d’instrumentation et la procédure expérimentale pour la cartographie à haut débit des signaux Ca2+ et des potentiels transmembranaires (Vm) dans les cœurs murins de type sauvage (WT) et hétérozygotes RyR2-R2474S/+, combinés à une stimulation électrique programmée avant et après le défi isoprotérénol. Ce protocole fournit une méthode pour l’étude mécanistique de la maladie CPVT dans des cœurs de souris isolés.

Protocole

Des souris mâles de type sauvage âgées de 10 à 14 semaines ou des souris RyR2-R2474S/+ (fond C57BL/6) pesant 20 à 25 g sont utilisées pour les expériences. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale du Sud-Ouest, Sichuan, Chine (approbation NO :20160930) conformément aux directives nationales en vertu desquelles l’institution fonctionne.

1. Préparation

  1. Solutions de gestion des stocks
    1. Solution mère de blebbistatine : Ajouter 1 mL de diméthylsulfoxyde à 100 % (DMSO) dans le flacon d’origine contenant 2,924 mg de (-) poudre de blebbistatine pour atteindre une concentration de 10 mM.
    2. Indicateur de tension RH237 solution mère : Ajouter 1 mL de DMSO à 100 % dans le flacon d’origine avec 1 mg de poudre RH237 pour obtenir une concentration de 2,01 mM.
    3. Solution mère Rhod-2 AM pour indicateur de calcium : Ajouter 1 mL de DMSO à 100 % dans 1 mg de poudre Rhod-2 AM pour atteindre une concentration de 0,89 mM.
    4. Solution mère de Pluronic F127 : Ajouter 1 mL de DMSO à 100 % dans 200 mg de Pluronic F127 pour atteindre une concentration de 20 % p/v (0,66 mM).
    5. Aliquotez les solutions mères dans des tubes PCR de 200 μL dans des tubes de 21 à 51 μL (21 μL de RH237, 31 μL de Rhod-2 AM et 51 μL de blebbistatine) à usage simple ou double afin d’éviter la congélation et la décongélation répétées. Ensuite, enveloppez les solutions dans du papier d’aluminium et conservez-les à -20 °C, à l’exception de la solution mère Pluronic F127 placée dans une pièce sombre à température ambiante.
  2. Solution de perfusion
    1. Solution de Krebs (en mM) : Préparer 1 L de solution de Krebs (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1,0, KCl4,7, MgCl 2 1,05, CaCl2 1,35 et glucose 10).
    2. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre à aiguille aseptique de 0,22 μm et oxygéner avec 95 % d’O 2/5 % de CO2.
    3. Prélever 40 mL de solution de Krebs dans un tube centrifuge de 50 mL et le conserver à 4 °C pour un isolement cardiaque de suivi.
  3. Le système de perfusion Langendorff et le dispositif de cartographie optique
    1. Mise en place du système de perfusion Langendorff.
      1. Allumez le bain-marie et réglez la température à 37 °C.
      2. Lavez le système de perfusion Langendorff avec 1 L d’eau déminéralisée.
      3. Perfuser la solution à partir du conduit d’admission et ajuster le débit de sortie à 3,5-4 mL/min. Ensuite, oxygéner le perfusat avec du gaz O 2/CO2 (95%/5%) à 37 °C.
        REMARQUE : Une bulle n’est jamais autorisée dans le système de perfusion.
    2. Préparez le système de cartographie optique.
      1. Installez la caméra EMCCD (dispositif à couplage de charge multiplicateur d’électrons) (512 × 512 pixels), l’objectif (grossissement 40x), les diodes électroluminescentes (LED) séparatrices de longueur d’onde, le moniteur d’électrocardiogramme (ECG) et l’électrode de stimulation (Figure 1).
      2. Ajustez la distance de travail appropriée entre la lentille et la position du cœur.
      3. Placez deux LED en position diagonale du bain thermostatique pour un éclairage uniforme, fournissant une longueur d’onde de 530 nm pour générer une lumière d’excitation. Utilisez un filtre à revêtement pulvérisé ET525/50 pour éliminer toute lumière hors bande pour les LED.
      4. Ajustez l’interrupteur de la poignée pour obtenir un carré égal de la surface cible, ce qui permet aux images de tension et de calcium d’apparaître correctement sur l’interface d’acquisition.
      5. Tournez l’ouverture de l’objectif au diamètre maximum pour éviter toute fuite de signaux de tension ou de calcium.
      6. Ajustez l’objectif de la caméra à une hauteur appropriée, car il sert une bonne distance de travail par rapport au bain thermostatique, 10 cm sont généralement utilisés.
      7. Allumez la caméra pour une température d’échantillonnage stable à -50 °C.

2. Procédures

  1. Prélèvement, canulation et perfusion du cœur de souris
    1. Injecter par voie intrapéritonéale aux animaux une solution d’avertin (1,2 %, 0,5 à 0,8 ml) et de l’héparine (200 unités) pour minimiser la souffrance et le réflexe de douleur et prévenir la formation de caillots sanguins. Au bout de 15 minutes, sacrifiez les animaux par luxation cervicale.
    2. Ouvrez le coffre avec des ciseaux, prélevez soigneusement le cœur et placez-le dans la solution froide de Krebs (4 °C, 95 % d’O 2, 5 % de CO2) pour ralentir le métabolisme et protéger le cœur.
    3. Prélevez le tissu environnant de l’aorte, canulez l’aorte à l’aide d’une aiguille de canule sur mesure (diamètre extérieur : 0,8 mm, diamètre intérieur : 0,6 mm, longueur : 27 mm) et fixez-la avec une suture en soie 4-0.
    4. Perfusez le cœur avec le système Langendorff à une vitesse constante de 3,5-4,0 mL/min et maintenez la température à 37 ± 1 °C.
      REMARQUE : Toutes les procédures suivantes sont effectuées dans cette condition.
    5. Insérez un petit tube en plastique (0,7 mm de diamètre, 20 mm de longueur) dans le ventricule gauche pour libérer la congestion de la solution dans la chambre afin d’éviter une surcharge.
  2. Découplage de l’excitation-contraction et de la charge à double colorant
    1. Insérez deux sondes dans le perfusat dans le bain, allumez les alimentations du boîtier d’amplification ECG et du contrôleur de stimulation électrique, puis démarrez le logiciel ECG référencé et surveillez l’ECG en continu.
    2. Effectuez les étapes suivantes dans l’obscurité lorsque le cœur atteint un état stable (le cœur bat rythmiquement à ~400 bpm).
    3. Mélanger 50 μL de solution mère de blébbistatine à 10 mM avec 50 mL de solution de Krebs pour atteindre une concentration de 10 μM. Perfuser constamment le mélange de solution de blebbistatine-Krebs dans le cœur pendant 10 minutes pour dissocier la contraction de l’excitation et éviter les artefacts de contraction pendant le tournage.
    4. Utilisez une lampe de poche rouge pour vérifier si la contraction cardiaque s’arrête totalement, car la contraction influencera la qualité de la charge du colorant.
    5. Après le découplage excitation-contraction, mélanger 15 μL de solution mère de Rhod-2 AM avec 15 μL de solution mère de Pluronic F127 dans 50 mL de solution de Krebs pour obtenir les concentrations finales de 0,267 μM Rhod-2 AM et 0,198 μM de Pluronic F127. Ensuite, perfusez le cœur en continu avec la solution de travail Rhod-2 AM pendant 15 minutes dans le système de perfusion Langendorff.
    6. Maintenez l’apport d’oxygène pendant la charge intracellulaire du colorant calcique. Étant donné que les bulles se forment facilement dans le Pluronic F127, insérez un piège à bulles dans le système de perfusion pour éviter l’embolisation gazeuse des coronaires.
    7. Diluer 10 μL de solution mère RH237 dans 50 mL de perfusat pour atteindre la concentration finale à 0,402 μM et effectuer le chargement pendant 10 minutes.
    8. À la fin de la charge à double colorant, prenez une séquence de photos pour vous assurer que les signaux de tension et de calcium sont adéquats pour l’analyse (pas d’interaction entre deux signaux).
  3. Cartographie optique et induction de l’arythmie
    REMARQUE : La cartographie optique commence après l’arrêt de la contraction et une charge de colorant appropriée, et le cœur est perfusé consécutivement comme dans les étapes décrites ci-dessus à la section 2.1 (4).
    1. Allumez les deux LED pour les lumières d’excitation et ajustez leur intensité à une plage appropriée (assez forte pour l’éclairage et un tournage relativement simple, mais pas trop robuste pour la surexposition).
    2. Placez le cœur sous le dispositif de détection, assurez-vous qu’il est suffisamment éclairé par deux LED et ajustez le diamètre du point lumineux à 2 cm.
    3. Réglez la distance de travail entre l’objectif et le cœur sur 10 cm, ce qui donne un taux d’échantillonnage de près de 500 Hz et une résolution spatiale de 120 x 120 μm par pixel.
    4. Ouvrez le logiciel d’échantillonnage du signal pour contrôler numériquement la caméra afin de capturer simultanément les signaux de tension et de calcium.
    5. Démarrez le stimulateur de champ myopacer et réglez le modèle de stimulation sur Transistor Transistor Logic (TTL), une durée de stimulation de 2 ms pour chaque impulsion et 0,3 V comme intensité initiale.
    6. Utilisez 30 stimuli S1 consécutifs à 10 Hz pour tester le seuil de tension diastolique du cœur piloté par le logiciel d’enregistrement ECG. Augmentez progressivement l’amplitude de la tension jusqu’à ce que la capture 1 :1 soit réalisée (vérifiez l’onde QRS du moniteur ECG, le potentiel d’action (AP) et les signaux transitoires calciques (CaT)).
    7. Après avoir déterminé le seuil de tension, stimulez le cœur à une intensité de 2 fois le seuil de tension diastolique avec une paire d’électrodes en platine fixées à l’épicarde de l’apex du ventricule gauche (VG) (ELVA).
    8. Mettre en œuvre le protocole S1S1 pour mesurer le calcium ou le potentiel d’action des alternans et les propriétés de restitution. Rythmez le cœur consécutivement à une durée de cycle de base de 100 ms, en diminuant de 10 ms de la durée du cycle chaque séquence suivante jusqu’à ce que 50 ms soient atteints. Chaque épisode comprend 30 stimuli consécutifs avec une largeur d’impulsion de 2 ms. Dans le même temps, commencez la cartographie optique avant la stimulation (le temps d’échantillonnage comprend ~10 rythmes sinusaux et la durée de stimulation).
    9. Pour mesurer la période réfractaire effective ventriculaire (PAR) à l’aide du protocole de stimulus S1S2, commencez par une durée de cycle de stimulation S1S1 de 100 ms avec un S2 couplé à 60 ms avec un décrément par pas de 2 ms jusqu’à ce que S2 ne parvienne pas à capturer le complexe QRS ectopique.
    10. Pour l’induction de l’arythmie, effectuez une stimulation en rafale perpétuelle de 50 Hz (50 stimulations électriques continues avec une largeur d’impulsion de 2 ms) et effectuez le même épisode de stimulation après un intervalle de repos de 2 s.
    11. Observez attentivement les enregistrements ECG pendant la période de stimulation continue à haute fréquence afin que les enregistrements de cartographie optique simultanés puissent commencer rapidement lorsqu’une onde ECG arythmique intéressante se génère (étant donné que la plupart des arythmies cardiaques sont induites par la stimulation électrique, les signaux optiques sont échantillonnés 2 à 3 s avant la stimulation en rafale en cas de perte d’événements cardiaques importants).
    12. Image à l’aide d’une caméra EMCCD (fréquence d’échantillonnage : 500 Hz, taille des pixels : 64 x 64).
  4. Analyse des données
    1. Chargement d’images et traitement du signal
      1. Appuyez sur Select Folder et Load Images pour charger les images dans le logiciel d’acquisition d’images pour une analyse semi-automatique des données vidéo massives selon la configuration et le protocole décrits précédemment15,16.
      2. Entrez les paramètres d’échantillonnage corrects (tels que la taille des pixels et la fréquence d’images).
      3. Définissez le seuil d’image par saisie manuelle et sélectionnez la région d’intérêt (ROI).
      4. Implémentez un filtre spatial gaussien de 3 x 3 pixels, un filtre Savitzky-Goaly et une correction de ligne de base de type chapeau.
      5. Appuyez sur Process Images pour supprimer la ligne de base et calculer les paramètres électrophysiologiques, tels que APD80 et CaTD50.
    2. Analyse des paramètres électrophysiologiques
      1. Réglez le temps d’initiation de l’APD au pic et le point terminal à 80% de repolarisation (APD80) pour le calcul de l’APD80. De même, l’heure de début du CaTD est définie comme le pic et le point terminal est défini comme la relaxation de 80 %.
      2. La mesure de la vitesse de conduction (CV) dépend de la taille des pixels et du temps de conduction du potentiel d’action entre deux pixels ou plus. Calculez la vitesse moyenne de tous les pixels choisis, c’est-à-dire la vitesse de conduction moyenne de la région sélectionnée. Générez simultanément des cartes isochrones correspondantes pour une vue claire de la direction de la conduction.
        NOTE : O’Shea et al.15 ont rapporté la mesure CV en détail.
      3. Pour l’analyse des alternanes et de l’arythmie, les alternanes calciques sont définis comme une amplitude de crête continue de grande et de petite taille apparaissant alternativement. Utilisez le rapport d’amplitude de crête pour évaluer la gravité des alternants dépendants de la fréquence (1-A2/A1). Appliquez des cartes de phase pour analyser les arythmies complexes comme la tachycardie ventriculaire (TV). Recherchez les rotors apparaissant distinctement dans une région spécifique lorsque les rotors se déplacent.

Résultats

La cartographie optique a été une approche populaire dans l’étude des arythmies cardiaques complexes au cours de la dernière décennie. La configuration de cartographie optique se compose d’une caméra EMCCD, offrant un taux d’échantillonnage allant jusqu’à 1 000 Hz et une résolution spatiale de 74 x 74 μm pour chaque pixel. Il permet d’obtenir un rapport signal/bruit assez élevé lors de l’échantillonnage du signal (Figure 1). Une fois que le cœur perfusé par Langend...

Discussion

Sur la base de notre expérience, les clés d’une cartographie optique à double colorant réussie d’un cœur de souris comprennent une solution et un cœur bien préparés, la charge du colorant, l’obtention du meilleur rapport signal/bruit et la réduction de l’artefact de mouvement.

Préparation de la solution
La solution de Krebs est essentielle pour la réussite d’une expérience cardiaque. Les solutions mères de MgCl 2 et de CaCl2 (1 mol/L) sont ...

Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Cette étude est soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81700308 à XO et 31871181 à ML, et 82270334 à XT), le Programme de soutien à la science et à la technologie (CN) de la province du Sichuan (2021YJ0206 à XO, 23ZYZYTS0433 et 2022YFS0607 à XT et 2022NSFSC1602 à TC) et le Laboratoire d’État clé pour la chimie et l’ingénierie moléculaire des ressources médicinales (Université normale du Guangxi) (CMEMR2017-B08 à XO), MRC (G10031871181 à ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE à Oxford (ML) subventions.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm syringe filterMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaN/ATo filter solution
15 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011150
1 mL Pasteur pipetteBeijing Labgic Technology Co., Ltd. China00900026
1 mL SyringeB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μL PCR tubeSangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. ChinaF611541-0010Aliquote the stock solutions  to avoid repeated freezing and thawing
50 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011500Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation
585/40 nm filterChroma TechnologyN/AFilter for calcium signal
630 nm long-pass filterChroma TechnologyG15604AJFilter for voltage signal
Avertin (2,2,2-tribromoethanol)Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United KingdomT48402-100GTo minimize suffering and pain reflex
BlebbistatinTocris Bioscience, Minneapolis, MN, United StatesSLBV5564Excitation-contraction uncoupler to  eliminate motion artifact during mapping
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBK1794VFor Tyrode's solution
Custom-made thermostatic bathMappingLab, United KingdomTBC-2.1To keep temperature of perfusion solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Solvent for dyes
Dumont forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAF030
ElectroMap softwareUniversity of BirminghamN/AQuantification of electrical parameters
EMCCD cameraEvolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United StatesA18G150001Acquire images for optical signals
ET525/36 sputter coated filterChroma Technology319106Excitation filter
GlucoseSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBT4811VFor Tyrode's solution
Heparin SodiumChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China(H51021209)To prevent blood clots in the coronary artery
 Iris forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAA010
IsoproterenolMedChemExpress, Carlsbad, CA, United StatesHY-B0468/CS-2582
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS5003For Tyrode's solution
MacroLEDCairn Research, Faversham, United Kingdom7355/7356The excitation light of fluorescence probes
MacroLED light sourceCairn Research, Faversham, United Kingdom7352Control the LEDs
Mayo scissorsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYBC010
MetaMorphMolecular DevicesN/AOptical signals sampling
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBS6841VFor Tyrode's solution
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, United KingdomM5337Connect the electrical stimulator and Spike2 software
MyoPacer EP field stimulatorIon Optix Co, Milton, MA, United StatesS006152Electric stimulator
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS2340VFor Tyrode's solution
NaH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBW9042For Tyrode's solution
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBX3605For Tyrode's solution
NeuroLog SystemDigitimerNL905-229For ECG amplifier
OmapScope5MappingLab, United KingdomN/ACalcium alternans and arrhythmia analysis
Ophthalmic scissorsHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, ChinaT4-3904
OptoSplitCairn Research, Faversham, United Kingdom6970Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm  simultaneously
Peristalic pumpLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,BT100-2JTo pump the solution
Petri dishBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Carlsbad, CA, United States1899021To enhance the loading with Rhod2AM
RH237Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States1971387Voltage-sensitive dye
Rhod-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, United States1890519Calcium indicator
Silica gel tubeLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,96402-16Connect with the peristaltic pump
Silk sutureYuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China20172650032To fix the aorta
Spike2Cambridge Electronic Design limited, United KingdomN/ATo record and analyze ECG data
Stimulation electrodeMappingLab, United KingdomSE1600-35-2020
T510lpxrChroma Technology312461For light source
T565lpxrChroma Technology321343For light source

Références

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