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摘要

该协议介绍了从受儿茶酚胺能多形性室性心动过速影响的野生型和敲入动物获得的小鼠心脏的双染料光学映射，包括具有高时间和空间分辨率的跨膜电压和细胞内Ca2 + 瞬变的电生理测量。

摘要

促心律失常性心脏病儿茶酚胺能性多形性室性心动过速 （CPVT） 表现为体力活动、应激或儿茶酚胺激发后多形性室性心动过速发作，可恶化为可能致命的心室颤动。小鼠心脏是用于模拟遗传性心律失常疾病（包括CPVT）的广泛物种。来自Langendorff灌注的小鼠心脏的跨膜电位（Vm）和钙瞬变（CaT）的同时光学映射有可能阐明心律失常发生的潜在机制。与细胞水平研究相比，光学映射技术可以测试一些电生理参数，如活化、传导速度、动作电位持续时间和CaT持续时间的测定。本文介绍了在异丙肾上腺素攻击前和异丙肾上腺素激发之前和期间，结合程序化电起搏，在小鼠野生型和杂合子 RyR2-R2474S/+ 心脏中高通量光学映射 CaT 和 V m 的仪器设置和实验程序。该方法为体外小鼠心脏制剂中CPVT疾病的机理研究提供了一种可行且可靠的方法。

引言

遗传性心脏病儿茶酚胺能性多形性室性心动过速 （CPVT） 表现为体力活动、应激或儿茶酚胺激发后多形性室性心动过速 （PVT） 发作，可恶化为可能致命的心室颤动 1,2,3,4 .在 1995 年首次报告为临床综合征后，最近的证据表明涉及七个基因的突变，这些基因都与肌浆网状 （SR） 存储在这种情况下的 Ca 2+ 释放有关:最常报道的编码 Ca 2+ 释放通道的 RyR2 编码 Ca2+ 释放通道 5,6、FKBP12.67、编码心脏钙螯合蛋白 8、TRDN 的 CASQ2编码连接 SR 蛋白 triadin 9，以及编码钙调蛋白 11,12 的 CALM1 9、CALM210 和 CALM3。这些基因型模式将心律失常事件归因于 SR 储存 Ca2+12 不受调节的病理释放。

SR 自发释放的 Ca 2+ 可以检测为 Ca 2+ 火花或 Ca 2+ 波，从而激活 Na+/Ca 2+ 交换剂 （NCX）。一个 Ca2+ 换三个 Na+ 的交换器产生向内电流，加速舒张去极化并将膜电压驱动到动作电位 （AP） 阈值。在 RyR2 敲入小鼠中，窦房结 （SAN） 中 RyR2R4496C 活性的增加导致 SAN 自动性意外降低，舒张期 I Ca，L 和 SR Ca 2+ 耗竭的 Ca2+ 依赖性降低，确定导致 CPVT 患者 SAN 功能障碍的亚细胞病理生理学改变13,14。在儿茶酚胺（包括异丙肾上腺素 （isoproterenol， ISO）激发后，背景胞质 [Ca 2+] 增加后，相关心肌细胞胞质 Ca2+ 波的发生更可能。

RyR2 介导的 Ca2+ 释放后 Ca2+ 信号转导响应动作电位 （AP） 激活的详细动力学变化，这可能是在完整心脏 CPVT 模型中观察到的室性心律失常的原因，仍有待确定所有报告的 RyR2 基因型12。本文介绍了小鼠野生型 （WT） 和杂合子 RyR2-R2474S/+ 心脏中 Ca2+ 信号和跨膜电位 （V m） 的高通量定位仪器设置和实验程序，并结合异丙肾上腺素攻击前后的程序化电起搏。该方案为分离小鼠心脏中CPVT疾病的机制研究提供了一种方法。

研究方案

使用体重为20-25g的雄性10至14周龄野生型小鼠或RyR2-R2474S / +小鼠（C57BL / 6背景）进行实验。所有程序均已获得中国四川西南医科大学动物护理和使用委员会（批准号:20160930）的批准，符合该机构运营所依据的国家指南。

1. 准备工作

  1. 库存解决方案
    1. 布比司他汀储备液:在含有 2.924 mg （-） 布比司他汀粉末的原始烧瓶中加入 1 mL 100% 二甲基亚砜 （DMSO），以达到 10 mM 的浓度。
    2. 电压指示器 RH237 储备溶液:在装有 1 mg RH237 粉末的原始烧瓶中加入 1 mL 100% DMSO，以达到 2.01 mM 的浓度。
    3. 钙指示剂Rhod-2 AM储备溶液:将1mL 100%DMSO加入1mg Rhod-2 AM粉末中，达到0.89mM的浓度。
    4. Pluronic F127储备溶液:将1mL 100% DMSO加入200mg Pluronic F127中，以达到20% w / v（0.66mM）的浓度。
    5. 将储备溶液分装到 21-51 μL（21 μL RH237、31 μL Rhod-2 AM 和 51 μL 布比司他丁）的 200 μL PCR 管中，用于单次或两次使用，以避免反复冻融。然后，用铝箔包裹溶液并储存在-20°C，除了在环境温度下放置在暗室中的Pluronic F127储备溶液。
  2. 灌注液
    1. 克雷布斯溶液（以mM计）:制备1 L克雷布斯溶液（NaCl 119，NaHCO3 25，NaH 2 PO 4 1.0，KCl 4.7，MgCl 2 1.05，CaCl2 1.35和葡萄糖10）。
    2. 用0.22μm无菌针头过滤器过滤溶液，并用95%O 2 / 5%CO2氧化。
    3. 将40mL克雷布斯溶液放入50mL离心管中，并将其储存在4°C下用于后续心脏分离。
  3. Langendorff灌注系统和光学映射装置
    1. 设置 Langendorff 灌注系统。
      1. 打开水浴，将温度设置为37°C。
      2. 用 1 L 去离子水洗涤 Langendorff 灌注系统。
      3. 从进气道灌注溶液，并将流出速率调节至 3.5-4 mL/min。然后，在37°C下用O 2 / CO2（95%/ 5%）气体对灌注液进行氧化。
        注意:灌注系统中绝不允许出现气泡。
    2. 准备光学测绘系统。
      1. 安装电子倍增电荷耦合器件 （EMCCD） 相机（512 × 512 像素）、镜头（40 倍放大倍率）、分波器发光二极管 （LED）、心电图 （ECG） 监视器和刺激电极（图 1）。
      2. 调整从镜头到心脏位置的适当工作距离。
      3. 在恒温浴槽的对角线位置设置两个 LED 以实现均匀照明，提供 530 nm 的波长以产生激发光。使用 ET525/50 溅射镀膜滤光片去除 LED 的任何带外光。
      4. 调整手柄开关，使目标表面的平方相等，使电压和钙图像充分出现在采集界面上。
      5. 将镜头的光圈调到最大直径，以避免任何泄漏tage 或钙信号。
      6. 将相机镜头调整到适当的高度，因为它与恒温浴槽的工作距离很远，通常使用 10 厘米。
      7. 打开相机以获得稳定的采样温度在-50°C。

2. 程序

  1. 小鼠心脏采集、插管和灌注
    1. 腹膜内注射动物阿弗丁溶液（1.2%，0.5-0.8mL）和肝素（200单位），以尽量减少痛苦和疼痛反射，防止血凝块形成。15分钟后，通过颈椎脱位处死动物。
    2. 用剪刀打开胸部，小心地采摘心脏，放入冷的克雷布斯溶液（4°C，95%O 2,5%CO2）中，以减缓新陈代谢，保护心脏。
    3. 去除主动脉周围组织，使用定制的插管针（外径:0.8 mm，内径:0.6 mm，长度:27 mm）插管主动脉，并用 4-0 丝线缝合固定。
    4. 用Langendorff系统以3.5-4.0 mL / min的恒定速度灌注心脏，并将温度保持在37±1°C。
      注意:所有后续过程都在此条件下执行。
    5. 将一根小塑料管（直径 0.7 毫米，长度 20 毫米）插入左心室，以释放腔室中溶液的充血，以避免超负荷。
  2. 激发-收缩和双染料负载的解耦器
    1. 将两根导线放入浴槽的灌注液中，打开心电图放大器盒和电刺激控制器的电源，然后启动参考心电图软件并连续监测心电图。
    2. 当心脏达到稳定状态（心脏以 ~400 bpm 的速度有节奏地跳动）时，在黑暗中执行后续步骤。
    3. 将 50 μL 的 10 mM blebbistatin 储备溶液与 50 mL 的 Krebs 溶液混合，以达到 10 μM 的浓度。 不断将 blebbistatin-Krebs 溶液混合物灌注到心脏中 10 分钟，以解除收缩与兴奋的耦合，并避免拍摄过程中的收缩伪影。
    4. 使用红色手电筒检查心脏收缩是否完全停止，因为收缩会影响染料负载质量。
    5. 解除激发-收缩后，将 15 μL Rhod-2 AM 储备溶液与 15 μL Pluronic F127 储备溶液在 50 mL Krebs 溶液中混合，以达到 0.267 μM Rhod-2 AM 和 0.198 μM Pluronic F127 的终浓度。然后，在Langendorff灌注系统中用Rhod-2 AM工作溶液连续灌注心脏15分钟。
    6. 在细胞内钙染料加载期间保持氧气供应。由于 Pluronic F127 中很容易形成气泡，因此在灌注系统中插入气泡阱以避免冠状动脉气体栓塞。
    7. 将 10 μL RH237 储备溶液稀释到 50 mL 灌注液中，以达到 0.402 μM 的终浓度，并进行加载 10 分钟。
    8. 在双染料上样结束时，拍摄一系列照片，以确保电压和钙信号都足以进行分析（两个信号之间没有相互作用）。
  3. 光学标测和心律失常诱导
    注:在收缩停止和适当的染料加载后开始光学映射，并按照上述步骤2.1（4）连续灌注心脏。
    1. 打开两个激发灯的 LED，并在适当的范围内调整其强度（足够强的照明和相对简单的拍摄，但不要太坚固而过度曝光）。
    2. 将心脏放在检测装置下方，确保其处于两个 LED 的足够照明下，并将光斑直径调整为 2 厘米。
    3. 将镜头到心脏的工作距离设置为 10 厘米，采样率接近 500 Hz，空间分辨率为每像素 120 x 120 μm。
    4. 打开信号采样软件，对相机进行数字控制，同时采集电压和钙信号。
    5. 启动肌起搏器场刺激器，并将起搏模式设置为晶体管晶体管逻辑 （TTL），每个脉冲的起搏持续时间为 2 ms，初始强度为 0.3 V。
    6. 使用 30 个连续的 10 Hz S1 刺激来测试由心电图记录软件驱动的心脏舒张压阈值。逐渐增加电压幅度，直到实现 1:1 捕获（检查来自 ECG 监护仪的 QRS 波、动作电位 （AP） 和钙瞬变 （CaT） 信号）。
    7. 确定电压阈值后，将一对铂电极连接到左心室 （LV） 心尖 （ELVA） 的心外膜，以舒张压阈值的 2 倍强度起搏心脏。
    8. 实施 S1S1 方案以测量钙或动作电位交替和恢复特性。以 100 毫秒的基本周期长度连续起搏心脏，每隔一个序列减少 10 毫秒的周期长度，直到达到 50 毫秒。每集包括 30 个脉冲宽度为 2 ms 的连续刺激。同时，在刺激前开始光学映射（采样时间包括~10个窦性心律和起搏持续时间）。
    9. 要使用 S1S2 刺激方案测量心室有效不应期 （ERP），从 100 ms 的 S1S1 起搏周期长度开始，S2 以 60 ms 耦合，步长递减 2 ms，直到 S2 无法捕获异位 QRS 波群。
    10. 对于心律失常诱发，进行永久 50 Hz 突发起搏（50 次连续电刺激，脉冲宽度为 2 ms），并在休息 2 秒间隔后进行相同的起搏发作。
    11. 在连续高频起搏期间仔细观察心电图记录，以便在产生有趣的心律失常心电图波时立即开始同步光学映射记录（由于大多数心律失常是由电起搏引起的，因此在失去重要心脏事件的情况下，在突发起搏前 2-3 秒对光学信号进行采样）。
    12. 使用EMCCD相机拍摄的图像（采样率:500 Hz，像素大小:64 x 64）。
  4. 数据分析
    1. 图像加载和信号处理
      1. 按"选择文件夹"和"加载图像"，将图像加载到图像采集软件中，根据前面描述的设置和协议进行半自动海量视频数据分析15,16。
      2. 输入正确的采样参数（例如 像素大小 和 帧速率）。
      3. 通过手动输入设置图像阈值，然后选择感兴趣区域 （ROI）。
      4. 实现 3 x 3 像素高斯空间滤波器、Savitzky-Goaly 滤波器和顶帽基线校正。
      5. 按 处理图像 删除基线并计算电生理参数，例如 APD80 和 CaTD50。
    2. 电生理参数分析
      1. 设置APD在峰值处的起始时间，在80%复极化（APD80）处设置终点的起始时间，以计算APD80。同样，CaTD开始时间定义为峰值，终点定义为80%的弛豫。
      2. 传导速度 （CV） 的测量取决于像素大小和两个或更多像素之间的动作电位传导时间。计算所有选定像素的平均速度 - 这是所选区域的平均传导速度。同时生成相应的等时图，以清晰地了解传导方向。
        注:O'Shea等人15 详细报告了CV测量结果。
      3. 对于交替体和心律失常分析，交替钙被定义为连续的大和小峰值振幅交替出现。使用峰值振幅比来评估频率依赖替 （1-A2/A1） 的严重程度。应用相位图来分析复杂的心律失常，如室性心动过速 （VT）。寻找转子移动时明显出现在特定区域的转子。

结果

在过去十年中，光学标测一直是研究复杂心律失常的流行方法。光学映射装置由EMCCD相机组成，每个像素的采样率高达1,000 Hz，空间分辨率为74 x 74 μm。它在信号采样期间实现了相当高的信噪比（图 1）。一旦朗根道夫灌注的心脏达到稳定状态并且染料上样完成，心脏在两个 530 nm LED 的照射下放置在等温室中，用于激励电压指示器 RH237 和 Ca2+ 指示器 Rhod-2 AM。发射光被?...

讨论

根据我们的经验，成功对小鼠心脏进行双染料光学成像的关键包括精心准备的溶液和心脏、染料上样、实现最佳信噪比以及减少运动伪影。

溶液的制备
克雷布斯解决方案对于成功的心脏实验至关重要。MgCl 2 和 CaCl2 储备溶液 （1 mol/L） 是预先制备的，考虑到它们的吸水性，并在所有其他组分都溶解在纯水中后加入克雷布斯溶液中，因为 Mg 2+ 和 ...

披露声明

所有作者均无任何利益冲突可声明。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（81700308 至 XO，31871181 至 ML，82270334 至 XT）、四川省科技支撑计划（CN）（2021YJ0206 至 XO、23ZYZYTS0433、2022YFS0607 至 XT、2022NSFSC1602 至 TC）和广西师范大学化学与分子工程国家重点实验室（CMEMR2017-B08 至 XO）， MRC（G10031871181 至 ML02647、G1002082、ML）、BHF（PG/14/80/31106、PG/16/67/32340、PG/12/21/29473、PG/11/59/29004 ML）、BHF CRE 在牛津 （ML） 赠款。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm syringe filterMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaN/ATo filter solution
15 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011150
1 mL Pasteur pipetteBeijing Labgic Technology Co., Ltd. China00900026
1 mL SyringeB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μL PCR tubeSangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. ChinaF611541-0010Aliquote the stock solutions  to avoid repeated freezing and thawing
50 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011500Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation
585/40 nm filterChroma TechnologyN/AFilter for calcium signal
630 nm long-pass filterChroma TechnologyG15604AJFilter for voltage signal
Avertin (2,2,2-tribromoethanol)Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United KingdomT48402-100GTo minimize suffering and pain reflex
BlebbistatinTocris Bioscience, Minneapolis, MN, United StatesSLBV5564Excitation-contraction uncoupler to  eliminate motion artifact during mapping
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBK1794VFor Tyrode's solution
Custom-made thermostatic bathMappingLab, United KingdomTBC-2.1To keep temperature of perfusion solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Solvent for dyes
Dumont forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAF030
ElectroMap softwareUniversity of BirminghamN/AQuantification of electrical parameters
EMCCD cameraEvolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United StatesA18G150001Acquire images for optical signals
ET525/36 sputter coated filterChroma Technology319106Excitation filter
GlucoseSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBT4811VFor Tyrode's solution
Heparin SodiumChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China(H51021209)To prevent blood clots in the coronary artery
 Iris forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAA010
IsoproterenolMedChemExpress, Carlsbad, CA, United StatesHY-B0468/CS-2582
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS5003For Tyrode's solution
MacroLEDCairn Research, Faversham, United Kingdom7355/7356The excitation light of fluorescence probes
MacroLED light sourceCairn Research, Faversham, United Kingdom7352Control the LEDs
Mayo scissorsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYBC010
MetaMorphMolecular DevicesN/AOptical signals sampling
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBS6841VFor Tyrode's solution
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, United KingdomM5337Connect the electrical stimulator and Spike2 software
MyoPacer EP field stimulatorIon Optix Co, Milton, MA, United StatesS006152Electric stimulator
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS2340VFor Tyrode's solution
NaH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBW9042For Tyrode's solution
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBX3605For Tyrode's solution
NeuroLog SystemDigitimerNL905-229For ECG amplifier
OmapScope5MappingLab, United KingdomN/ACalcium alternans and arrhythmia analysis
Ophthalmic scissorsHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, ChinaT4-3904
OptoSplitCairn Research, Faversham, United Kingdom6970Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm  simultaneously
Peristalic pumpLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,BT100-2JTo pump the solution
Petri dishBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Carlsbad, CA, United States1899021To enhance the loading with Rhod2AM
RH237Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States1971387Voltage-sensitive dye
Rhod-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, United States1890519Calcium indicator
Silica gel tubeLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,96402-16Connect with the peristaltic pump
Silk sutureYuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China20172650032To fix the aorta
Spike2Cambridge Electronic Design limited, United KingdomN/ATo record and analyze ECG data
Stimulation electrodeMappingLab, United KingdomSE1600-35-2020
T510lpxrChroma Technology312461For light source
T565lpxrChroma Technology321343For light source

参考文献

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