Aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento

Resumen

Describimos un protocolo para aislar y cultivar células endoteliales de venas safenas humanas (hSVECs). También proporcionamos métodos detallados para producir esfuerzo cortante y estiramiento para estudiar el estrés mecánico en hSVEC.

Resumen

La cirugía de injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG, por sus siglas en inglés) es un procedimiento para revascularizar el miocardio isquémico. La vena safena sigue siendo utilizada como conducto de la CABG a pesar de la reducción de la permeabilidad a largo plazo en comparación con los conductos arteriales. El aumento abrupto del estrés hemodinámico asociado con la arterialización del injerto resulta en daño vascular, especialmente el endotelio, que puede influir en la baja permeabilidad del injerto de vena safena (SVG). Aquí, describimos el aislamiento, caracterización y expansión de las células endoteliales de la vena safena humana (hSVEC). Las células aisladas por digestión de colagenasa muestran la morfología típica de adoquines y expresan marcadores celulares endoteliales CD31 y VE-cadherina. Para evaluar la influencia del estrés mecánico, se utilizaron protocolos en este estudio para investigar los dos estímulos físicos principales, el esfuerzo cortante y el estiramiento, en SVG arterializados. Los hSVEC se cultivan en una cámara de flujo de placa paralela para producir esfuerzo cortante, mostrando alineación en la dirección del flujo y mayor expresión de KLF2, KLF4 y NOS3. Los hSVEC también se pueden cultivar en una membrana de silicio que permite un estiramiento celular controlado que imita el estiramiento venoso (bajo) y arterial (alto). El patrón de actina F de las células endoteliales y la secreción de óxido nítrico (NO) se modulan en consecuencia por el estiramiento arterial. En resumen, presentamos un método detallado para aislar hSVECs para estudiar la influencia del estrés mecánico hemodinámico en un fenotipo endotelial.

Introducción

La disfunción de las células endoteliales (CE) es un actor clave en el fracaso del injerto de vena safena 1,2,3,4. El aumento sostenido del esfuerzo cortante y el estiramiento cíclico induce el fenotipo proinflamatorio de las células endoteliales de la vena safena humana (hSVECs⁾3,4,5,6. Las vías moleculares subyacentes aún no se comprenden completamente, y los protocolos estandarizados para estudios in vitro pueden aprovechar los esfuerzos para obtener nuevos conocimientos en el área. Aquí, describimos un protocolo simple para aislar, caracterizar y expandir los hSVEC y cómo exponerlos a niveles variables de esfuerzo cortante y estiramiento cíclico, imitando las condiciones hemodinámicas venosas y arteriales.

Los hSVEC se aíslan por incubación de colagenasa y se pueden utilizar hasta el paso 8. Este protocolo requiere menos manipulación del vaso en comparación con los otros protocolos disponibles⁷, lo que reduce la contaminación con células musculares lisas y fibroblastos. Por otro lado, requiere un segmento de recipiente más grande de al menos 2 cm para tener una extracción eficiente de la CE. En la literatura, se ha relatado que las CE de grandes vasos también pueden obtenerse por eliminación mecánica ^7,8. Aunque eficaz, el enfoque físico tiene las desventajas de un bajo rendimiento de EC y una mayor contaminación por fibroblastos. Para aumentar la pureza, se necesitan pasos adicionales utilizando perlas magnéticas o clasificación celular, aumentando el costo del protocolo debido a la adquisición de perlas y anticuerpos ^7,8. El método enzimático tiene resultados más rápidos y mejores en cuanto a la pureza y viabilidad de la CE ^7,8.

Las CE más utilizadas para estudiar la disfunción endotelial son las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Se sabe que el fenotipo CE cambia en diferentes lechos vasculares, y es esencial desarrollar métodos que representen el vaso investigado ^9,10. En este sentido, el establecimiento de un protocolo para aislar un hSVEC y cultivarlo bajo estrés mecánico es una herramienta valiosa para comprender la contribución de la disfunción hSVEC en la enfermedad del injerto venoso.

Protocolo

Se obtuvieron segmentos no utilizados de venas safenas de pacientes sometidos a cirugía de bypass aortocoronario en el Instituto del Corazón (InCor), Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo. Todos los individuos dieron su consentimiento informado para participar en el estudio, que fue revisado y aprobado por el comité de ética local.

1. Aislamiento, cultivo y caracterización de células endoteliales primarias de venas safenas humanas (hSVECs)

1. Preparación
   1. Autoclave un par de pinzas rectas o curvas y tijeras de tejido (7-8 cm).
   2. Preparar gelatina estéril. Mezclar 0,1 g (0,1% p/v) o 3 g (3% p/v) de gelatina de piel porcina con 100 ml de agua ultrapura, en autoclave durante 15 min, y conservar a 4 °C. Calentar a 37 °C para licuar antes de cubrir las placas y portaobjetos de cultivo celular.
   3. Prepare colagenasa estéril (1 mg/ml) dentro de la campana de flujo laminar. Diluir la colagenasa en PBS y esterilizarla con un filtro de 0,2 μm.
   4. Cubra una placa de cultivo celular de 60 mm y un portaobjetos de cámara de 8 pocillos con gelatina al 0,1% p/v durante al menos 30 min a 37 °C. Retire el exceso de gelatina antes de sembrar las células.
   5. Preparar medio celular endotelial completo: medio basal de crecimiento celular endotelial (EBM-2) suplementado con factores de crecimiento EGM2.
      NOTA: Los factores de crecimiento EGM2 se suministran como un kit por una empresa que figura en la Tabla de materiales. La concentración de los factores no es revelada por la empresa.
   6. Hacer albúmina sérica bovina (BSA) al 2% y 5%, paraformaldehído al 4% (PFA) y Triton X-100 al 0,1%, todo en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Aislamiento y cultivo de hSVECs
   1. Recoja al menos un segmento de vena safena de 2-3 cm de largo para este procedimiento.
      NOTA. Todos los procedimientos de cultivo celular deben llevarse a cabo en condiciones estériles y dentro de una campana de flujo laminar.
   2. Transfiera el segmento de la vena a una placa de Petri llena de PBS precalentado. Inserte una punta de pipeta en un extremo de la vena y enjuague suavemente con PBS para eliminar toda la sangre dentro de la luz. Enjuague hasta que el flujo de lavado se aclare por completo.
   3. Cierre uno de los extremos de la vena con una sutura de algodón estéril. Llene cuidadosamente el vaso con 1 mg/ml de solución de colagenasa tipo II. Cierre el otro extremo del recipiente con una sutura de algodón (Figura 1A). Incubar el recipiente con solución de colagenasa en una atmósfera humidificada de 5% de_CO2 a 37 °C durante 1 h.
   4. Después de eso, corte uno de los extremos del vaso dentro de un tubo de 15 ml y recoja la solución de colagenasa. Corte el otro extremo y enjuague la superficie luminal con 1-2 ml de PBS para recoger todos los EC separados. Coloque todo el PBS junto con la solución de colagenasa dentro del mismo tubo.
   5. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) para granular las células.
      NOTA. El pellet celular es muy pequeño y difícil de visualizar. Si la sangre no se elimina completamente antes del tratamiento con colagenasa (paso 1.2.2.), las células sanguíneas también precipitarán y el pellet será rojizo.
   6. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 3-4 mL de medio celular endotelial completo (EBM-2 suplementado con factores de crecimiento EGM2) y una solución adicional de heparina (5 U/mL, concentración final). Coloque las células en una placa de cultivo celular de 60 mm pre-recubierta con gelatina al 3% p/v.
      NOTA: La gelatina fue la primera opción debido a su facilidad de accesibilidad y bajo costo. Como el recubrimiento con gelatina mantiene con éxito el fenotipo CE, no se probó ninguna otra sustancia de recubrimiento. Los colágenos y la fibronectina se pueden probar en estudios destinados a investigar la influencia de diferentes componentes de la matriz extracelular en la adhesión de la CE y el fenotipo.
   7. Incubar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de_CO2 durante 4 días sin cambiar el medio. Después de eso, cambie los medios cada dos días. A partir de este momento, la suplementación adicional de medios celulares con heparina ya no es necesaria. Examine la placa bajo el microscopio para asegurarse de que se hayan eliminado los glóbulos rojos.
   8. Después de 3-10 días después de la extracción, dependiendo del tamaño y diámetro del segmento de la vena, visualice los hSVEC mediante microscopía de contraste de fase.
   9. Evaluar el grado de confluencia y su morfología de adoquines en microscopía de contraste de fase.
   10. Continuar cambiando los medios cada 2 días hasta que las células alcancen el 70%-80% de confluencia.
   11. Pasar los hSVEC con solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25% de tripsina-0,02%.
       1. Lave las celdas con PBS precalentado.
       2. Añadir 1 ml de solución de tripsina-EDTA a la placa de cultivo celular de 60 mm. Incubar a 37 °C durante 2 min o hasta que se desprendan todas las células.
       3. Agregue 2 ml de medio celular endotelial completo para inactivar la tripsina.
       4. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugar a 300 x g durante 3 min a RT.
       5. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo.
       6. Contar la suspensión celular en azul de tripano 1:1 (0,4%) para placar células viables.
       7. Para expandir el cultivo, emplatar las células en una placa de cultivo celular de 100 mm con 10 ml de medio celular endotelial completo precalentado y cultivarlo a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de_CO2.
          NOTA. En promedio, la siembra de 4 x 10⁴ hSVEC/^cm2 será 100% confluente después de 48 h.
   12. Para criopreservar las células, resuspender el pellet del paso 1.2.11.5 en dimetilsulfóxido al 5% (DMSO) en suero bovino fetal (FBS) y almacenar en nitrógeno líquido.
3. Caracterización de hSVECs: Tinción por citometría de flujo para CD31
   1. Transfiera 1 x 10 5 hSVEC a un tubo de^1,5 ml y centrifugar a 300 x g durante 3 min a RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 μL de PBS que contenga 2% de BSA y anticuerpo monoclonal CD31-FITC (1:100).
   2. Manche las celdas durante 30 minutos en RT en la oscuridad.
   3. Lave las células teñidas añadiendo 0,5 ml de PBS y centrifugarlas a 300 x g durante 3 min a RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 400 μL de PBS con BSA al 2%.
   4. Use hSVEC no marcados, sin anticuerpos CD31, como control negativo.
   5. Proceda al análisis de adquisición del citómetro de flujo utilizando un láser azul y un canal FITC (excitación/emisión máx. [Ex/Em] de 498/517 nm). Si se utilizan otros fluorocromos, compruebe si el citómetro tiene conjuntos de filtros adecuados para su detección. Separe las celdas de los desechos en función de su tamaño y granularidad, luego compruebe celdas individuales mediante dispersión hacia adelante y dispersión lateral.
4. Caracterización de hSVECs: Tinción fluorescente para CD31 y VE-cadherina
   1. Placa 0.1 x 10⁵ celdas en el portaobjetos de cámara de 8 pocillos recubierto de gelatina. Incubar las células durante la noche a 37 °C, 5 % de_CO2, para permitir que las células se adhieran a la superficie de cultivo.
   2. Retire el medio y lave las células una vez con PBS.
   3. Agregue 0.3 ml / pocillo de PFA al 4% para fijar las células. Incubar durante 15 min en RT.
   4. Lavar tres veces con PBS.
   5. Agregue 0.3 ml / pocillo de solución Triton X-100 al 0.1% para permeabilizar las células. Incubar durante 15 min en RT.
   6. Lavar tres veces con PBS.
   7. Para bloquear los sitios de unión de anticuerpos no específicos, agregue 0.3 ml / pocillo de solución BSA al 5% a las células. Incubar durante 15 min en RT.
   8. Lavar tres veces con PBS.
   9. Incubar las células con los anticuerpos primarios (CD31 y VE-cadherina, 1:100) diluidos en PBS con BSA al 2% durante la noche con balanceo suave a 4 °C. Dejar un pozo incubando con PBS con BSA al 2% (sin anticuerpo primario) como control negativo.
   10. Lavar tres veces con PBS.
   11. Incubar las células con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia diluidos (1:500) en PBS durante 1 h en RT. Añadir 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción nuclear a una concentración final de 1 mg/ml.
   12. Lavar tres veces con PBS.
   13. Retire la cámara de medios con el separador. Coloque una gota del reactivo del medio de montaje (50% de glicerol en PBS) y coloque un portaobjetos de vidrio (24 mm x 60 mm) evitando atrapar burbujas.
   14. Observe las células bajo un microscopio de fluorescencia.
       NOTA: DAPI se detecta con un cubo de luz DAPI (Ej: 335-379 nm; Em: 417-477 nm), y CD31/VE-cadherina se detecta utilizando un cubo de luz de proteína fluorescente verde (GFP) (Ej: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Los cubos de luz con un rango de longitud de onda de excitación/emisión similar también son adecuados para estos fluorocromos. Si se utilizan otros fluorocromos, compruebe si el microscopio utilizado tiene conjuntos de filtros adecuados para su detección.

2. Esfuerzo cortante en hSVECs

1. Preparación
   1. Cubra el portaobjetos de la cámara de flujo con gelatina al 0,1% p/v durante al menos 30 min a 37 °C. Retire el exceso de gelatina antes de sembrar las células.
   2. Equilibrar la unidad fluídica y el conjunto de perfusión estéril con depósitos de 10 ml durante la noche dentro de la incubadora en una atmósfera humidificada de 5% de_CO2 a 37 °C.
2. Experimento de esfuerzo cortante
   1. Semilla 2 x 10⁵ EC suspendidas en 100 μL de medio EC en el portaobjetos de la cámara de flujo recubierta de gelatina. Incubar las células durante 4 h a 37 °C y 5% de_CO2 para permitir que las células se adhieran a la superficie de cultivo.
   2. Coloque el equipo de perfusión en la unidad fluídica como se describe en las instrucciones del fabricante. Llene los reservorios y la perfusión en aproximadamente 12 ml de medio celular endotelial completo precalentado. Retire manualmente las burbujas de aire del conjunto de perfusión para equilibrar el nivel de ambos depósitos a 5 ml.
   3. Coloque la unidad fluídica con el conjunto de perfusión montado, sin la corredera de la cámara, en la incubadora y conecte su cable eléctrico a la bomba regulada por computadora. Elimine todas las burbujas de aire de los depósitos y el conjunto de perfusión, ejecutando un protocolo predefinido en el software de control de la bomba.
      NOTA. Es muy importante eliminar las burbujas de aire para que el sistema funcione correctamente.
   4. Tome la unidad fluídica con el conjunto de perfusión montado en la campana de flujo laminar y fije los portaobjetos con una monocapa de celda confluente.
   5. Coloque la unidad fluídica con la perfusión montada y los portaobjetos con celdas en la incubadora y conecte su cable eléctrico a la bomba.
   6. En el software de control de la bomba, configure los siguientes parámetros: viscosidad del medio (0,0072), tipo de portaobjetos, factor de calibración del conjunto de perfusión, velocidad de esfuerzo cortante (20 dina/cm²), tipo de caudal (unidireccional) y tiempo (72 h), e inicie el caudal (consulte las instrucciones del equipo para obtener más detalles). Cosechar las células tratadas con los mismos medios sin exposición al flujo como controles estáticos.
   7. Después de completar el estímulo, lave las células una vez con PBS y proceda a cosechar las muestras de acuerdo con el ensayo requerido. Para la tinción fluorescente, ver paso 2.3.1, y para la extracción de ARN, ver paso 2.3.2.
3. Demostración de la eficacia del protocolo de esfuerzo cortante
   1. Tinción fluorescente de filamentos de actina (F-actina)
      1. Fijar y permeabilizar las células como se indica en los pasos 1.4.2-1.4.6. Utilice un volumen de 100 μL en el portaobjetos μ.
      2. Teñir la actina F con faloidina marcada con fluorescencia (diluida a 1:200 en PBS) y contrateñir el núcleo con DAPI (concentración final de 1 mg/ml en PBS) durante 2 h en RT, protegido de la luz.
      3. Lavar tres veces con PBS.
      4. Observe las células bajo un microscopio de fluorescencia.
         NOTA: DAPI se detecta con un cubo de luz DAPI (Ej: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) y la faloidina se detecta con un cubo de luz GFP (Ej: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Los cubos de luz con un rango similar de longitud de onda de excitación/emisión también son adecuados para estos fluorocromos. Si se utilizan otros fluorocromos, compruebe si el microscopio utilizado tiene conjuntos de filtros adecuados para su detección.
   2. Expresión génica por transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
      1. Recoja las células del portaobjetos de μ con 350 μL de un tampón de lisis comercial que contiene guanidina-tiocianato. Aísle el ARN total con kits de extracción basados en columnas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
         NOTA: Debido al número limitado de células cultivadas en el portaobjetos de μ, se recomienda el uso de la extracción de ARN basada en columnas.
      2. Prepare el ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc con enzima inversa transcriptasa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      3. Verificar la expresión de los genes regulados por el esfuerzo cortante: KLF2, KLF4 y NOS3. Use el gen del ama de llaves PPIA/ciclofilina para normalizar los resultados. Los cebadores específicos para la reacción se enumeran en la Tabla 1.
      4. Realizar RT-qPCR utilizando un kit de tinción de ADN fluorescente verde SYBR bajo las siguientes condiciones de reacción: i) 50 °C durante 2 min, ii) 95 °C durante 15 min, iii) 94 °C durante 15 s, iv) 60 °C durante 30 s, v) 72 °C durante 30 s. Repita los pasos iii a v durante 40 ciclos. Agregue un paso de fusión al final de la reacción para verificar la especificidad del cebador.

3. Estiramiento cíclico en hSVECs

1. Preparación
   1. Aplicar lubricante a base de silicona en la parte superior y lateral de la estación de carga equibiaxial de 6 pocillos de 25 mm.
      NOTA: Esto reduce la fricción entre la membrana de la placa de cultivo y la estación, lo que permite una mejor distribución de la tensión cíclica. Este paso debe realizarse antes de cada experimento.
2. Experimento de estiramiento cíclico
   1. Semilla 4 x 10⁵ células suspendidas en 3 mL a cada pocillo de las placas de cultivo de fondo flexible de 6 pocillos recubiertas con colágeno I (Tabla de materiales). Planifique tener una placa (s) en condición estática como grupo de control. Mantener las células en la incubadora (37 °C en aire humidificado con 5% de_CO2) hasta que alcancen el 100% de confluencia (generalmente 48 h después de la siembra). Antes del inicio del protocolo de estiramiento, lave las células una vez con PBS precalentado y agregue 3 ml de medio de cultivo fresco por pocillo.
   2. Inserte la placa base con todas las estaciones de carga lubricadas en la incubadora y conecte adecuadamente el tubo con el equipo controlador del sistema de biorreactor de estiramiento de células de tensión (consulte las instrucciones del equipo para obtener más detalles).
   3. Fije cada placa de cultivo a una junta roja, proporcionada por el sistema de biorreactor de estiramiento de células de tensión. Luego, colóquelos en la placa base dentro de la incubadora.
      1. Asegúrese de que las placas estén completamente asentadas, presionadas y selladas a la placa base para evitar fugas de aire durante el bombeo de vacío. Es importante tener las cuatro placas de cultivo en la placa base para tener el vacío adecuado y la carga de estiramiento.
      2. En caso de tener menos placas experimentales, use una(s) vacía(s) para completar las cuatro posiciones en la placa base. Agregue la lámina de acrílico (suministrada con el equipo) encima de las placas de cultivo para mejorar el sellado de la placa base. Coloque las placas estáticas en la misma incubadora.
   4. Encienda el equipo controlador y el sistema informático. Abra el icono del software y configure el régimen deseado: tamaño de la estación de carga a utilizar, tipo de deformación, porcentaje de elongación, forma de onda, frecuencia y tiempo. Para obtener información detallada, consulte las instrucciones del fabricante. Seleccione y descargue el régimen. Aquí, se utilizó el siguiente régimen: 1/2 forma de onda sinusal, frecuencia de 1 Hz, 5% de elongación (para imitar el estiramiento venoso) y 15% de elongación (para imitar el estiramiento arterial) hasta 72 h.
   5. Encienda el sistema de vacío y haga clic en Inicio en la pantalla de la computadora para ejecutar el estiramiento. Compruebe si la membrana de silicona se está moviendo y estirando las células.
   6. Después de completar el estímulo, lave las células una vez con PBS y proceda a cosechar las muestras de acuerdo con el ensayo requerido. Aquí, para demostrar la efectividad del estiramiento cíclico, recolecte el medio de cultivo hSVEC, manténgalo a -80 ° C para una mayor medición de óxido nítrico (NO) y fije las células para la tinción fluorescente.
      NOTA. La placa base no se puede almacenar dentro de la incubadora cuando no está en uso; De lo contrario, la temperatura puede modificar la forma plana y hacerla inútil.
3. Demostración de la eficacia del protocolo de estiramiento cíclico
   1. Tinción fluorescente de F-actina
      1. Corrija las celdas como se indica en el paso 1.4.3. Use un volumen de 1 ml por pocillo.
      2. Lave las celdas tres veces con PBS. Mantenga las células en PBS para que no se sequen mientras prepara la membrana de silicona para los próximos pasos.
      3. Use un hisopo de algodón para eliminar el exceso de lubricante a base de silicona de la parte inferior de la membrana. Luego, aplique suavemente el limpiador de ventanas o jabón de manos con un nuevo hisopo de algodón. Repita el proceso hasta que se elimine todo el lubricante de la membrana. Luego, limpie con agua desionizada.
         NOTA. Es importante eliminar completamente el lubricante de la membrana de silicona para tener imágenes de microscopía de buena calidad.
      4. Corte cuidadosamente las membranas de silicona en trozos pequeños para que quepan en portaobjetos de cámara de 8 pocillos para teñir. Permeabilizar las células como se indica en el paso 1.4.5.
      5. Después de los pasos de lavado, tiñe la actina F usando faloidina y el núcleo con DAPI. Proceda al análisis, como se indica en los pasos 2.3.1.2 y 2.3.1.3. Use un volumen de 0.3 ml por pocillo de cámara.
      6. Retire la cámara de medios con el separador. Coloque una gota de medio de montaje de reactivo (50% de glicerol en PBS) y coloque un portaobjetos de vidrio (24 mm x 60 mm).
      7. Observe las células bajo un microscopio de fluorescencia.
         NOTA: DAPI se detecta con un cubo de luz DAPI (Ej: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) y la faloidina se detecta con un cubo de luz de proteína fluorescente roja (RFP) (Ej: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Los cubos de luz con un rango similar de longitud de onda de excitación/emisión también son adecuados para estos fluorocromos. Si se utilizan otros fluorocromos, compruebe si el microscopio utilizado tiene conjuntos de filtros adecuados para su detección.
   2. Medición de NO: estimada por la acumulación de nitrito (NO₂) en el medio acondicionado hSVEC mediante un ensayo de quimioluminiscencia reductiva a base de yoduro de potasio
      1. Preparación
         1. Preparar una curva estándar de 0,01-10 mM de solución de nitrito de sodio (NaNO₂ en agua ultrapura).
         2. Agregue 5 ml de ácido acético y 1 ml de yoduro de potasio (50 mg en 1 ml de agua ultrapura) en el recipiente de purga del analizador de óxido nítrico.
      2. SIN medición
         1. Añadir 20 μL de la curva estándar NaNO₂ en el recipiente de purga del analizador de óxido nítrico. Mítelo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   3. Añadir 20 μL del medio acondicionado en el recipiente de purga del analizador de óxido nítrico. Mítelo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   4. Calcule las concentraciones de NO₂ basándose en la calibración de la curva estándar. Ajustar los valores obtenidos por el volumen total del medio acondicionado analizado ^6,11.

Resultados

Por lo general, los CE adheridos se pueden observar 3-4 días después de la extracción. Los hSVEC inicialmente forman grupos de células y muestran una morfología típica de "adoquines" (Figura 1B). Expresan los marcadores CE CD31 (Figura 1C,D) y VE-cadherina (Figura 1D). Los hSVEC se pueden propagar fácilmente en una placa de cultivo celular tratado no recubierto, y conservan el fenotipo endotelial en cultivo h...

Discusión

El segmento de la vena safena debe tener al menos 2 cm para aislar con éxito los hSVEC. Los segmentos pequeños son difíciles de manejar y atan los extremos del vaso para mantener la solución de colagenasa para aislar las células. La superficie luminal reducida no produce suficientes células para expandir el cultivo. Para minimizar el riesgo de contaminación con no CE, la manipulación del segmento de la vena safena debe ser muy suave durante todo el procedimiento. Es importante tener cuidado al introducir las punt...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution	Gibco	25200072
15 µ slide I 0.4 Luer	Ibidi	80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm	Flexcell International Corporation	LS-3000B25.VJW
8-well chamber slide with removable well	Thermo Fisher Scientific	154453
Acetic Acid (Glacial)	Millipore	100063
Acrylic sheet 1 cm thick	Plexiglass
Anti-CD31 antibody	Abcam	ab24590
Anti-CD31, FITC antibody	Thermo Fisher Scientific	MHCD3101
Anti-VE-cadherin antibody	Cell Signaling	2500
Bioflex plates collagen I	Flexcell International Corporation	BF3001C
Bovine serum albumin solution	Sigma-Aldrich	A8412
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm	Brasuture	AP524
Cyclophilin forward primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
Cyclophilin reverse primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540
EBM-2 basal medium	Lonza	CC3156
EGM-2 SingleQuots supplements	Lonza	CC4176
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	2657-029
Flexcell FX-5000 tension system	Flexcell International Corporation	FX-5000T
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma-Aldrich	F4680
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11001
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11008
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL	Blau Farmacêutica	SKU 68027
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)	Ibidi	10902
KLF2 forward primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
KLF2 reverse primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
KLF4 forward primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
KLF4 reverse primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
NOA 280 nitric oxide analyzer	Sievers Instruments	NOA-280i-1
NOS3 forward primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
NOS3 reverse primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs	Ibidi	10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A12380
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010031
Potassium Iodide	Sigma-Aldrich	221945
QuanTitec SYBR green PCR kit	Qiagen	204143
QuantStudio 12K flex platform	Applied Biosystems	4471087
RNeasy micro kit	Quiagen	74004
Slide glass (24 mm x 60 mm)	Knittel Glass	VD12460Y1D.01
Sodium nitrite	Sigma-Aldrich	31443
SuperScript IV first-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18091200
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Trypan blue stain 0.4%	Gibco	15250-061
Type II collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C6885