Isolement des cellules endothéliales de la veine saphène humaine et exposition à des niveaux contrôlés de contrainte de cisaillement et d’étirement

Résumé

Nous décrivons un protocole pour isoler et cultiver des cellules endothéliales de veine saphène humaine (hSVEC). Nous fournissons également des méthodes détaillées pour produire une contrainte de cisaillement et un étirement pour étudier la contrainte mécanique dans les hSVEC.

Résumé

Le pontage aortocoronarien (PAC) est une procédure de revascularisation du myocarde ischémique. La veine saphène reste utilisée comme conduit de pontage coronarien malgré la perméabilité réduite à long terme par rapport aux conduits artériels. L’augmentation brutale du stress hémodynamique associé à l’artérialisation du greffon entraîne des lésions vasculaires, en particulier de l’endothélium, qui peuvent influencer la faible perméabilité de la greffe de la veine saphène (SVG). Ici, nous décrivons l’isolement, la caractérisation et l’expansion des cellules endothéliales de la veine saphène humaine (hSVEC). Les cellules isolées par digestion de la collagénase présentent la morphologie typique des pavés et expriment les marqueurs cellulaires endothéliaux CD31 et VE-cadhérine. Pour évaluer l’influence des contraintes mécaniques, des protocoles ont été utilisés dans cette étude pour étudier les deux principaux stimuli physiques, la contrainte de cisaillement et l’étirement, sur les SVG artérialisés. Les hSVEC sont cultivés dans une chambre d’écoulement à plaques parallèles pour produire une contrainte de cisaillement, montrant un alignement dans la direction de l’écoulement et une expression accrue de KLF2, KLF4 et NOS3. Les hSVEC peuvent également être cultivés dans une membrane de silicium qui permet un étirement cellulaire contrôlé imitant l’étirement veineux (bas) et artériel (haut). Le diagramme F-actine des cellules endothéliales et la sécrétion d’oxyde nitrique (NO) sont modulés en conséquence par l’étirement artériel. En résumé, nous présentons une méthode détaillée pour isoler les hSVEC afin d’étudier l’influence du stress mécanique hémodynamique sur un phénotype endothélial.

Introduction

Le dysfonctionnement des cellules endothéliales (CE) est un acteur clé de l’échec de la greffe de veine saphène 1,2,3,4. L’augmentation soutenue de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique induit le phénotype pro-inflammatoire des cellules endothéliales de la veine saphène humaine (hSVEC)3,4,5,6. Les voies moléculaires sous-jacentes ne sont pas encore entièrement comprises, et les protocoles normalisés pour les études in vitro peuvent tirer parti des efforts pour de nouvelles connaissances dans le domaine. Ici, nous décrivons un protocole simple pour isoler, caractériser et étendre les hSVEC et comment les exposer à des niveaux variables de contrainte de cisaillement et d’étirement cyclique, imitant les conditions hémodynamiques veineuses et artérielles.

Les hSVEC sont isolés par incubation de collagénase et peuvent être utilisés jusqu’au passage 8. Ce protocole nécessite moins de manipulation du vaisseau par rapport aux autres protocoles disponibles⁷, ce qui réduit la contamination par les cellules musculaires lisses et les fibroblastes. D’autre part, il faut un segment de récipient plus grand d’au moins 2 cm pour avoir une extraction EC efficace. Dans la littérature, il a été rapporté que les CEs des grands navires peuvent également être obtenues par enlèvement mécanique ^7,8. Bien qu’efficace, l’approche physique présente les inconvénients d’un faible rendement EC et d’une contamination plus élevée par les fibroblastes. Pour augmenter la pureté, des étapes supplémentaires sont nécessaires en utilisant des billes magnétiques ou le tri cellulaire, ce qui augmente le coût du protocole en raison de l’acquisition de billes et d’anticorps ^7,8. La méthode enzymatique donne des résultats plus rapides et meilleurs en ce qui concerne la pureté et la viabilité de la CE ^7,8.

Les CE les plus fréquemment utilisées pour étudier le dysfonctionnement endothélial sont les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). On sait que le phénotype EC change dans différents lits vasculaires, et il est essentiel de développer des méthodes qui représentent le vaisseau étudié ^9,10. À cet égard, la mise en place d’un protocole permettant d’isoler une hSVEC et de la cultiver sous contrainte mécanique est un outil précieux pour comprendre l’apport du dysfonctionnement de l’hSVEC dans la maladie du greffon veineux.

Protocole

Des segments inutilisés de veines saphènes ont été obtenus chez des patients subissant un pontage aortocoronarien à l’Institut de cardiologie (InCor) de la faculté de médecine de l’Université de São Paulo. Toutes les personnes ont donné leur consentement éclairé pour participer à l’étude, qui a été examinée et approuvée par le comité d’éthique local.

1. Isolement, culture et caractérisation des cellules endothéliales de la veine saphène humaine primaire (CSESh)

1. Préparation
   1. Autoclave une paire de pinces droites ou incurvées et des ciseaux en tissu (7-8 cm).
   2. Préparer de la gélatine stérile. Mélanger 0,1 g (0,1 % p/v) ou 3 g (3 % p/v) de gélatine pour peau de porc avec 100 mL d’eau ultrapure, autoclaver pendant 15 minutes et conserver à 4 °C. Chauffer à 37 °C pour liquéfier avant d’enrober les boîtes de culture cellulaire et les lames.
   3. Préparer la collagénase stérile (1 mg/mL) à l’intérieur de la hotte à flux laminaire. Diluer la collagénase dans du PBS et la stériliser avec un filtre de 0,2 μm.
   4. Enduire une capsule de culture cellulaire de 60 mm et une lame de chambre à 8 puits avec de la gélatine à 0,1 % p/v pendant au moins 30 minutes à 37 °C. Retirez l’excès de gélatine avant d’ensemencer les cellules.
   5. Préparer un milieu cellulaire endothélial complet : milieu de base de croissance des cellules endothéliales (EBM-2) complété par des facteurs de croissance EGM2.
      REMARQUE: Les facteurs de croissance EGM2 sont fournis sous forme de kit par une entreprise répertoriée dans le tableau des matériaux. La concentration des facteurs n’est pas divulguée par la société.
   6. Fabriquer des solutions d’albumine sérique bovine (BSA) à 2 % et à 5 %, de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et de Triton X-100 à 0,1 %, le tout dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Isolement et culture des hSVEC
   1. Prélever au moins un segment de veine saphène de 2-3 cm de long pour cette procédure.
      NOTE. Toutes les procédures de culture cellulaire doivent être effectuées dans des conditions stériles et à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire.
   2. Transférer le segment veineux dans une boîte de Petri remplie de PBS préchauffé. Insérez un embout de pipette dans une extrémité de la veine et rincez doucement avec du PBS pour éliminer tout le sang à l’intérieur de la lumière. Rincez-le jusqu’à ce que le flux de lavage devienne complètement clair.
   3. Fermez l’une des extrémités de la veine avec une suture de coton stérile. Remplissez délicatement le récipient avec 1 mg/mL de solution de collagénase de type II. Fermez l’autre extrémité du récipient à l’aide d’une suture en coton (figure 1A). Incuber le récipient avec une solution de collagénase dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO₂ à 37 °C pendant 1 h.
   4. Après cela, coupez l’une des extrémités du récipient à l’intérieur d’un tube de 15 ml et recueillez la solution de collagénase. Couper l’autre extrémité et rincer la surface luminale avec 1-2 mL de PBS pour recueillir tous les EC détachés. Mettez tout le PBS ensemble avec la solution de collagénase à l’intérieur du même tube.
   5. Centrifuger le tube à 400 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) pour granuler les cellules.
      NOTE. La pastille de cellule est très petite et difficile à visualiser. Si le sang n’est pas complètement éliminé avant le traitement à la collagénase (étape 1.2.2.), les cellules sanguines précipiteront également et la pastille sera rougeâtre.
   6. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 3-4 mL de milieu cellulaire endothélial complet (EBM-2 complété par des facteurs de croissance EGM2) et une solution d’héparine supplémentaire (5 U/mL, concentration finale). Plaquer les cellules dans une boîte de culture cellulaire de 60 mm pré-enrobée de gélatine à 3 % p/v.
      REMARQUE: La gélatine était le premier choix en raison de sa facilité d’accès et de son faible coût. Comme l’enrobage avec de la gélatine maintient avec succès le phénotype CE, aucune autre substance de revêtement n’a été testée. Les collagènes et la fibronectine peuvent être testés dans des études visant à étudier l’influence de différents composants de la matrice extracellulaire sur l’adhésion EC et le phénotype.
   7. Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO₂ pendant 4 jours sans changer le milieu. Après cela, changez de média tous les deux jours. À partir de ce moment, la supplémentation supplémentaire en milieu cellulaire avec de l’héparine n’est plus nécessaire. Examinez la plaque au microscope pour vous assurer que les globules rouges ont été retirés.
   8. Après 3 à 10 jours après l’extraction, en fonction de la taille et du diamètre du segment veineux, visualisez les hSVEC par microscopie à contraste de phase.
   9. Évaluer le degré de confluence et leur morphologie pavée en microscopie à contraste de phase.
   10. Continuez à changer le milieu tous les 2 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 70% à 80% de confluence.
   11. Faire passer les hSVEC avec une solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25% de trypsine-0,02%.
       1. Lavez les cellules avec du PBS préchauffé.
       2. Ajouter 1 mL de solution trypsine-EDTA à la boîte de culture cellulaire de 60 mm. Incuber à 37 °C pendant 2 min ou jusqu’à ce que toutes les cellules soient détachées.
       3. Ajouter 2 mL de milieu cellulaire endothélial complet pour inactiver la trypsine.
       4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA.
       5. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de culture.
       6. Compter la suspension cellulaire dans du trypan bleu 1:1 (0,4%) pour plaquer les cellules viables.
       7. Pour étendre la culture, plaquez les cellules dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm avec 10 ml de milieu endothélial complet préchauffé et cultivez-la à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO₂.
          NOTE. En moyenne, l’ensemencement de 4 x 10⁴ hSVEC/^cm2 sera 100% confluent après 48 h.
   12. Pour cryoconserver les cellules, remettre en suspension la pastille de l’étape 1.2.11.5 dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 5 % dans du sérum fœtal bovin (FBS) et conserver dans de l’azote liquide.
3. Caractérisation des hSVECs : coloration par cytométrie de flux pour CD31
   1. Transvaser 1 x 10 5 hSVEC dans un tube de^1,5 mL et centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 100 μL de PBS contenant 2 % d’anticorps monoclonaux BSA et CD31-FITC (1:100).
   2. Colorer les cellules pendant 30 min à TA dans l’obscurité.
   3. Laver les cellules colorées en ajoutant 0,5 mL de PBS et les centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 400 μL de PBS avec 2% de BSA.
   4. Utilisez des hSVEC non marqués, sans anticorps CD31, comme témoin négatif.
   5. Procéder à l’analyse d’acquisition du cytomètre en flux à l’aide d’un laser bleu et d’un canal FITC (excitation/émission max [Ex/Em] de 498/517 nm). Si d’autres fluorochromes sont utilisés, vérifiez si le cytomètre dispose d’ensembles de filtres appropriés pour leur détection. Séparez les cellules des débris en fonction de leur taille et de leur granularité, puis grillez les cellules individuelles par diffusion vers l’avant et par diffusion latérale.
4. Caractérisation des hSVECs : coloration fluorescente pour CD31 et VE-cadhérine
   1. Plaque 0,1 x 10⁵ cellules dans la lame de chambre à 8 puits recouverte de gélatine. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 °C, 5 % de CO₂, pour permettre aux cellules de se fixer à la surface de culture.
   2. Retirez le milieu et lavez les cellules une fois avec PBS.
   3. Ajouter 0,3 mL/puits de PFA à 4 % pour fixer les cellules. Incuber pendant 15 min à TA.
   4. Lavez trois fois avec du PBS.
   5. Ajouter 0,3 mL/puits de solution de Triton X-100 à 0,1 % pour perméabiliser les cellules. Incuber pendant 15 min à TA.
   6. Lavez trois fois avec du PBS.
   7. Pour bloquer les sites de liaison d’anticorps non spécifiques, ajouter 0,3 mL/puits de solution de BSA à 5 % aux cellules. Incuber pendant 15 min à TA.
   8. Lavez trois fois avec du PBS.
   9. Incuber les cellules avec les anticorps primaires (CD31 et VE-cadhérine, 1:100) dilués dans du PBS avec 2% de BSA pendant une nuit avec un léger balancement à 4 ° C. Laisser un puits en incubation avec PBS avec 2% BSA (pas d’anticorps primaire) comme témoin négatif.
   10. Lavez trois fois avec du PBS.
   11. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence dilués (1:500) dans du PBS pendant 1 h à TA. Ajouter le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour la coloration nucléaire à une concentration finale de 1 mg/mL.
   12. Lavez trois fois avec du PBS.
   13. Retirez la chambre multimédia à l’aide du séparateur. Placez une goutte du réactif du milieu de montage (50% de glycérol dans PBS) et placez une lame de verre (24 mm x 60 mm) tout en évitant de piéger les bulles.
   14. Observez les cellules au microscope à fluorescence.
       REMARQUE : DAPI est détecté avec un cube lumineux DAPI (Ex : 335-379 nm ; Em: 417-477 nm) et la cadhérine CD31/VE est détectée à l’aide d’un cube lumineux de protéine fluorescente verte (GFP) (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Des cubes légers avec une gamme de longueurs d’onde d’excitation/émission similaire sont également adéquats pour ces fluorochromes. Si d’autres fluorochromes sont utilisés, vérifiez si le microscope utilisé dispose d’ensembles de filtres appropriés pour leur détection.

2. Contrainte de cisaillement sur les CSSVE

1. Préparation
   1. Enduire la lame de la chambre d’écoulement de gélatine à 0,1 % p/v pendant au moins 30 minutes à 37 °C. Enlevez l’excès de gélatine avant d’ensemencer les cellules.
   2. Équilibrer l’unité fluidique et la perfusion stérile avec des réservoirs de 10 mL pendant une nuit à l’intérieur de l’incubateur dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂ à 37 °C.
2. Expérience de contrainte de cisaillement
   1. Semer 2 x 10⁵ EC en suspension dans 100 μL de milieu EC dans la lame de chambre d’écoulement recouverte de gélatine. Incuber les cellules pendant 4 h à 37 °C et 5% de CO₂ pour permettre aux cellules de se fixer à la surface de culture.
   2. Placez le jeu de perfusion sur l’unité fluidique comme décrit dans les instructions du fabricant. Remplir les réservoirs et la perfusion dans environ 12 mL de milieu endothélial complet préchauffé. Retirer manuellement les bulles d’air du jeu de perfusion pour équilibrer le niveau des deux réservoirs à 5 mL.
   3. Placez l’unité fluidique avec le jeu de perfusion monté, sans la glissière de la chambre, dans l’incubateur et connectez son câble électrique à la pompe régulée par ordinateur. Retirez toutes les bulles d’air des réservoirs et du jeu de perfusion, en exécutant un protocole prédéfini dans le logiciel de contrôle de la pompe.
      NOTE. Il est très important d’éliminer les bulles d’air pour que le système fonctionne correctement.
   4. Prenez l’unité fluidique avec le perfusion monté réglé sur la hotte à flux laminaire et fixez les lames avec une monocouche à cellules confluentes.
   5. Placez l’unité fluidique avec la perfusion montée et les glissières avec les cellules dans l’incubateur et connectez son câble électrique à la pompe.
   6. Dans le logiciel de contrôle de la pompe, configurez les paramètres suivants : viscosité du fluide (0,0072), type de glissière, facteur d’étalonnage réglé de perfusion, taux de contrainte de cisaillement (20 dyn/cm²), type d’écoulement (unidirectionnel) et temps (72 h), et démarrez le débit (voir les instructions de l’équipement pour plus de détails). Récolter les cellules traitées avec le même milieu sans exposition au flux que les témoins statiques.
   7. Une fois le stimulus terminé, lavez les cellules une fois avec du PBS et procédez à la récolte des échantillons selon le test requis. Pour la coloration fluorescente, voir l’étape 2.3.1, et pour l’extraction de l’ARN, voir l’étape 2.3.2.
3. Démonstration de l’efficacité du protocole de contrainte de cisaillement
   1. Coloration fluorescente des filaments d’actine (F-actine)
      1. Fixez et perméabilisez les cellules comme indiqué aux étapes 1.4.2-1.4.6. Utilisez un volume de 100 μL dans la lame μ.
      2. Colorer la F-actine avec de la phalloïdine marquée par fluorescence (diluée à 1:200 dans du PBS) et contre-colorer le noyau avec du DAPI (concentration finale de 1 mg/mL dans le PBS) pendant 2 h à TA, à l’abri de la lumière.
      3. Lavez trois fois avec du PBS.
      4. Observez les cellules au microscope à fluorescence.
         REMARQUE : DAPI est détecté avec un cube lumineux DAPI (Ex : 335-379 nm ; Em: 417-477 nm) et la phalloïdine est détectée avec un cube lumineux GFP (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Des cubes légers avec une gamme similaire de longueurs d’onde d’excitation/émission sont également adéquats pour ces fluorochromes. Si d’autres fluorochromes sont utilisés, vérifiez si le microscope utilisé dispose d’ensembles de filtres appropriés pour leur détection.
   2. Expression génique par transcription inverse quantitative en temps réel (RT-qPCR)
      1. Recueillir les cellules de la lame de μ avec 350 μL d’un tampon de lyse commercial contenant de la guanidine-thiocyanate. Isoler l’ARN total avec des kits d’extraction à base de colonnes, selon les instructions du fabricant.
         REMARQUE: En raison du nombre limité de cellules cultivées dans la lame-μ, l’utilisation de l’extraction de l’ARN par colonne est recommandée.
      2. Préparez l’ADNc à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc contenant une enzyme inverse de transcriptase, conformément aux instructions du fabricant.
      3. Vérifier l’expression du ou des gènes régulés par la contrainte de cisaillement : KLF2, KLF4 et NOS3. Utilisez le gène de la gouvernante PPIA/cyclophiline pour normaliser les résultats. Les amorces spécifiques de la réaction sont énumérées dans le tableau 1.
      4. Effectuer la RT-qPCR à l’aide d’un kit de coloration d’ADN fluorescent vert SYBR dans les conditions de réaction suivantes : i) 50 °C pendant 2 min, ii) 95 °C pendant 15 min, iii) 94 °C pendant 15 s, iv) 60 °C pendant 30 s, v) 72 °C pendant 30 s. Répétez les étapes iii à v pendant 40 cycles. Ajouter une étape de fusion à la fin de la réaction pour vérifier la spécificité de l’amorce.

3. Étirement cyclique sur les hSVEC

1. Préparation
   1. Appliquez un lubrifiant à base de silicone sur le dessus et les côtés de la station de chargement équibiaxiale à 6 puits de 25 mm.
      REMARQUE: Cela réduit le frottement entre la membrane de la plaque de culture et la station, permettant une meilleure répartition de la déformation cyclique. Cette étape doit être effectuée avant chaque expérience.
2. Expérience d’étirement cyclique
   1. Ensemencer 4 x 10⁵ cellules en suspension dans 3 mL dans chaque puits des plaques de culture à fond flexible à 6 puits recouvertes de collagène I (Table des matériaux). Prévoyez d’avoir une ou plusieurs plaques en état statique comme groupe témoin. Conserver les cellules dans l’incubateur (37 °C dans de l’air humidifié avec 5% de CO₂) jusqu’à ce qu’elles atteignent 100% de confluence (généralement 48 h après l’ensemencement). Avant le début du protocole d’étirement, laver les cellules une fois avec du PBS préchauffé et ajouter 3 ml de milieu de culture frais par puits.
   2. Insérez la plaque de base avec toutes les stations de chargement lubrifiées dans l’incubateur et connectez correctement le tube à l’équipement de contrôle du système de bioréacteur d’étirement de cellule de tension (voir les instructions d’équipement pour plus de détails).
   3. Fixez chaque plaque de culture à un joint rouge, fourni par le système de bioréacteur d’étirement de cellule de tension. Ensuite, placez-les dans la plaque de base à l’intérieur de l’incubateur.
      1. Assurez-vous que les plaques sont bien insérées, pressées et scellées à la plaque de base pour éviter les fuites d’air pendant le pompage sous vide. Il est important d’avoir les quatre plaques de culture dans la plaque de base pour avoir le vide et la charge d’étirement appropriés.
      2. Si vous avez moins de plaques expérimentales, utilisez une ou plusieurs plaques vides pour compléter les quatre positions dans la plaque de base. Ajoutez la feuille d’acrylique (fournie avec l’équipement) sur les plaques de culture pour améliorer l’étanchéité de la plaque de base. Placez les plaques statiques dans le même incubateur.
   4. Mettez sous tension le contrôleur et le système informatique. Ouvrez l’icône du logiciel et configurez le schéma souhaité : taille de la station de chargement à utiliser, type de déformation, pourcentage d’allongement, forme d’onde, fréquence et durée. Pour plus d’informations, consultez les instructions du fabricant. Sélectionnez et téléchargez le régime. Ici, le schéma suivant a été utilisé: 1/2 forme d’onde sinusale, fréquence 1 Hz, 5% d’allongement (pour imiter l’étirement veineux) et 15% d’allongement (pour imiter l’étirement artériel) jusqu’à 72 h.
   5. Allumez le système d’aspiration et cliquez sur Démarrer sur l’écran de l’ordinateur pour exécuter l’étirement. Vérifiez si la membrane de silicone bouge et étire les cellules.
   6. Une fois le stimulus terminé, lavez les cellules une fois avec du PBS et procédez à la récolte des échantillons selon le test requis. Ici, pour démontrer l’efficacité de l’étirement cyclique, collectez le milieu de culture hSVEC, maintenez-le à -80 °C pour une mesure ultérieure de l’oxyde nitrique (NO) et fixez les cellules pour la coloration fluorescente.
      NOTE. La plaque de base ne peut pas être stockée à l’intérieur de l’incubateur lorsqu’elle n’est pas utilisée; Sinon, la température peut modifier la forme plate et la rendre inutile.
3. Démonstration de l’efficacité du protocole d’étirement cyclique
   1. Coloration fluorescente de la F-actine
      1. Fixez les cellules comme indiqué à l’étape 1.4.3. Utilisez un volume de 1 mL par puits.
      2. Lavez les cellules trois fois avec du PBS. Maintenez les cellules dans le PBS afin qu’elles ne sèchent pas tout en préparant la membrane de silicone pour les prochaines étapes.
      3. Utilisez un coton-tige pour enlever l’excès de lubrifiant à base de silicone du bas de la membrane. Ensuite, appliquez délicatement le nettoyant pour vitres ou le savon pour les mains avec un nouveau coton-tige. Répétez le processus jusqu’à ce que tout le lubrifiant soit retiré de la membrane. Ensuite, nettoyez avec de l’eau désionisée.
         NOTE. Il est important de retirer complètement le lubrifiant de la membrane de silicone pour avoir des images de microscopie de bonne qualité.
      4. Coupez soigneusement les membranes de silicone en petits morceaux pour les adapter sur des lames de chambre à 8 puits pour les colorer. Perméabiliser les cellules comme indiqué à l’étape 1.4.5.
      5. Après les étapes de lavage, colorer la F-actine à l’aide de phalloïdine et le noyau avec du DAPI. Procéder à l’analyse, comme indiqué aux étapes 2.3.1.2 et 2.3.1.3. Utiliser un volume de 0,3 mL par puits de chambre.
      6. Retirez la chambre multimédia à l’aide du séparateur. Placez une goutte de réactif de support de montage (50% de glycérol dans PBS) et placez une lame de verre (24 mm x 60 mm).
      7. Observez les cellules au microscope à fluorescence.
         REMARQUE : DAPI est détecté avec un cube lumineux DAPI (Ex : 335-379 nm ; Em: 417-477 nm) et la phalloïdine est détectée avec un cube lumineux de protéine fluorescente rouge (RFP) (Ex: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Des cubes légers avec une gamme similaire de longueurs d’onde d’excitation/émission sont également adéquats pour ces fluorochromes. Si d’autres fluorochromes sont utilisés, vérifiez si le microscope utilisé dispose d’ensembles de filtres appropriés pour leur détection.
   2. Mesure du NO estimée par l’accumulation de nitrite (NO₂) dans le milieu conditionné par l’hSVEC à l’aide d’un dosage de chimiluminescence réductrice à base d’iodure de potassium
      1. Préparation
         1. Préparer une courbe étalon de 0,01 à 10 mM de solution de nitrite de sodium (NaNO₂ dans de l’eau ultrapure).
         2. Ajouter 5 mL d’acide acétique et 1 mL d’iodure de potassium (50 mg dans 1 mL d’eau ultrapure) dans le récipient de purge de l’analyseur d’oxyde nitrique.
      2. AUCUNE mesure
         1. Ajouter 20 μL de la courbe standard NaNO₂ dans la cuve de purge de l’analyseur d’oxyde nitrique. Mesurez-le selon le protocole du fabricant.
   3. Ajouter 20 μL du milieu conditionné dans la cuve de purge de l’analyseur d’oxyde nitrique. Mesurez-le selon le protocole du fabricant.
   4. Calculer les concentrations de NO₂ sur la base de l’étalonnage de la courbe étalon. Ajustez les valeurs obtenues par le volume total du milieu conditionné analysé ^6,11.

Résultats

En règle générale, les EC adhérentes peuvent être observées 3-4 jours après l’extraction. Les hSVEC forment initialement des amas de cellules et présentent une morphologie typique de « pavés » (Figure 1B). Ils expriment les marqueurs CE CD31 (figure 1C, D) et VE-cadhérine (figure 1D). Les hSVEC peuvent être facilement multipliés sur une boîte de culture cellulaire traitée non enrobée, et ils conse...

Discussion

Le segment de la veine saphène doit avoir été d’au moins 2 cm pour isoler avec succès les hSVEC. Les petits segments sont difficiles à manipuler et attachent les extrémités du vaisseau pour maintenir la solution de collagénase pour isoler les cellules. La surface luminale réduite ne produit pas suffisamment de cellules pour étendre la culture. Pour minimiser le risque de contamination par des non-CE, la manipulation du segment de la veine saphène doit être très douce pendant toute la procédure. Il est imp...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution	Gibco	25200072
15 µ slide I 0.4 Luer	Ibidi	80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm	Flexcell International Corporation	LS-3000B25.VJW
8-well chamber slide with removable well	Thermo Fisher Scientific	154453
Acetic Acid (Glacial)	Millipore	100063
Acrylic sheet 1 cm thick	Plexiglass
Anti-CD31 antibody	Abcam	ab24590
Anti-CD31, FITC antibody	Thermo Fisher Scientific	MHCD3101
Anti-VE-cadherin antibody	Cell Signaling	2500
Bioflex plates collagen I	Flexcell International Corporation	BF3001C
Bovine serum albumin solution	Sigma-Aldrich	A8412
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm	Brasuture	AP524
Cyclophilin forward primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
Cyclophilin reverse primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540
EBM-2 basal medium	Lonza	CC3156
EGM-2 SingleQuots supplements	Lonza	CC4176
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	2657-029
Flexcell FX-5000 tension system	Flexcell International Corporation	FX-5000T
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma-Aldrich	F4680
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11001
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11008
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL	Blau Farmacêutica	SKU 68027
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)	Ibidi	10902
KLF2 forward primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
KLF2 reverse primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
KLF4 forward primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
KLF4 reverse primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
NOA 280 nitric oxide analyzer	Sievers Instruments	NOA-280i-1
NOS3 forward primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
NOS3 reverse primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs	Ibidi	10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A12380
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010031
Potassium Iodide	Sigma-Aldrich	221945
QuanTitec SYBR green PCR kit	Qiagen	204143
QuantStudio 12K flex platform	Applied Biosystems	4471087
RNeasy micro kit	Quiagen	74004
Slide glass (24 mm x 60 mm)	Knittel Glass	VD12460Y1D.01
Sodium nitrite	Sigma-Aldrich	31443
SuperScript IV first-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18091200
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Trypan blue stain 0.4%	Gibco	15250-061
Type II collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C6885