Vena safena umana Isolamento delle cellule endoteliali ed esposizione a livelli controllati di stress da taglio e allungamento

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per isolare e coltivare cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC). Forniamo anche metodi dettagliati per produrre stress di taglio e allungamento per studiare lo stress meccanico nelle hSVEC.

Abstract

La chirurgia dell'innesto di bypass coronarico (CABG) è una procedura per rivascolarizzare il miocardio ischemico. La vena safena rimane utilizzata come condotto CABG nonostante la ridotta pervietà a lungo termine rispetto ai condotti arteriosi. Il brusco aumento dello stress emodinamico associato all'arterializzazione dell'innesto provoca danni vascolari, in particolare l'endotelio, che possono influenzare la bassa pervietà dell'innesto della vena safena (SVG). Qui, descriviamo l'isolamento, la caratterizzazione e l'espansione delle cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC). Le cellule isolate dalla digestione della collagenasi mostrano la tipica morfologia del ciottolo ed esprimono i marcatori delle cellule endoteliali CD31 e VE-caderina. Per valutare l'influenza dello stress meccanico, in questo studio sono stati utilizzati protocolli per studiare i due principali stimoli fisici, sforzo di taglio e allungamento, su SVG arterializzati. Le hSVEC sono coltivate in una camera di flusso a piastre parallele per produrre stress di taglio, mostrando allineamento nella direzione del flusso e una maggiore espressione di KLF2, KLF4 e NOS3. Le hSVEC possono anche essere coltivate in una membrana di silicio che consente l'allungamento cellulare controllato che imita l'allungamento venoso (basso) e arterioso (alto). Il pattern F-actina delle cellule endoteliali e la secrezione di ossido nitrico (NO) sono modulati di conseguenza dall'allungamento arterioso. In sintesi, presentiamo un metodo dettagliato per isolare le hSVEC per studiare l'influenza dello stress meccanico emodinamico su un fenotipo endoteliale.

Introduzione

La disfunzione delle cellule endoteliali (EC) è un attore chiave nel fallimento dell'innesto di vena safena 1,2,3,4. L'aumento sostenuto dello sforzo di taglio e dello stiramento ciclico induce il fenotipo proinfiammatorio delle cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC)3,4,5,6. I percorsi molecolari sottostanti non sono ancora completamente compresi e protocolli standardizzati per studi in vitro possono sfruttare gli sforzi per nuove intuizioni nell'area. Qui, descriviamo un semplice protocollo per isolare, caratterizzare ed espandere le hSVEC e come esporle a livelli variabili di stress da taglio e allungamento ciclico, imitando le condizioni emodinamiche venose e arteriose.

Le hSVEC sono isolate mediante incubazione della collagenasi e possono essere utilizzate fino al passaggio 8. Questo protocollo richiede meno manipolazione del vaso rispetto agli altri protocolli disponibili⁷, che riduce la contaminazione con cellule muscolari lisce e fibroblasti. D'altra parte, richiede un segmento di vaso più grande di almeno 2 cm per avere un'estrazione EC efficiente. In letteratura, è stato riportato che le EC da grandi navi possono anche essere ottenute mediante rimozione meccanica ^7,8. Sebbene efficace, l'approccio fisico presenta gli svantaggi di una bassa resa EC e di una maggiore contaminazione da fibroblasti. Per aumentare la purezza, sono necessari ulteriori passaggi utilizzando sfere magnetiche o smistamento cellulare, aumentando il costo del protocollo a causa dell'acquisizione di perline e anticorpi ^7,8. Il metodo enzimatico ha risultati più rapidi e migliori per quanto riguarda la purezza e la vitalità CE ^7,8.

Le EC più frequentemente utilizzate per studiare la disfunzione endoteliale sono le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). È noto che il fenotipo EC cambia in diversi letti vascolari, ed è essenziale sviluppare metodi che rappresentino il vaso in esame ^9,10. A questo proposito, l'istituzione di un protocollo per isolare una hSVEC e coltivarla sotto stress meccanico è uno strumento prezioso per comprendere il contributo della disfunzione hSVEC nella malattia del trapianto venoso.

Protocollo

Segmenti inutilizzati di vene safene sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia di bypass aortocoronarico presso l'Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School. Tutti gli individui hanno dato il consenso informato a partecipare allo studio, che è stato esaminato e approvato dal comitato etico locale.

1. Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule endoteliali primarie della vena safena umana (hSVECs)

1. Preparazione
   1. Autoclave un paio di pinze dritte o curve e forbici di tessuto (7-8 cm).
   2. Preparare la gelatina sterile. Mescolare 0,1 g (0,1% p/v) o 3 g (3% p/v) di gelatina suina con 100 ml di acqua ultrapura, in autoclave per 15 minuti e conservare a 4 °C. Riscaldare a 37 °C per liquefare prima di rivestire le piastre e i vetrini di coltura cellulare.
   3. Preparare collagenasi sterile (1 mg/ml) all'interno della cappa a flusso laminare. Diluire la collagenasi in PBS e sterilizzarla con un filtro da 0,2 μm.
   4. Rivestire un piatto di coltura cellulare da 60 mm e un vetrino a 8 pozzetti con gelatina allo 0,1% p/v per almeno 30 minuti a 37 °C. Rimuovere la gelatina in eccesso prima di seminare le cellule.
   5. Preparare un mezzo cellulare endoteliale completo: mezzo basale di crescita delle cellule endoteliali (EBM-2) integrato con fattori di crescita EGM2.
      NOTA: I fattori di crescita EGM2 sono forniti in kit da una società elencata nella tabella dei materiali. La concentrazione dei fattori non è divulgata dalla società.
   6. Produrre soluzioni di sieroalbumina bovina al 2% e al 5% (BSA), paraformaldeide (PFA) al 4% e Triton X-100 allo 0,1%, il tutto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Isolamento e cultura delle hSVEC
   1. Raccogliere almeno un segmento di vena safena lungo almeno 2-3 cm per questa procedura.
      NOTA. Tutte le procedure di coltura cellulare devono essere eseguite in condizioni sterili e all'interno di una cappa a flusso laminare.
   2. Trasferire il segmento di vena in una capsula di Petri riempita con PBS preriscaldato. Inserire una punta di pipetta in un'estremità della vena e sciacquare delicatamente con PBS per rimuovere tutto il sangue all'interno del lume. Sciacquare fino a quando il flusso di lavaggio diventa completamente chiaro.
   3. Chiudere una delle estremità della vena con una sutura di cotone sterile. Riempire accuratamente il recipiente con 1 mg/mL di soluzione di collagenasi di tipo II. Chiudere l'altra estremità del recipiente con una sutura di cotone (Figura 1A). Incubare il recipiente con una soluzione di collagenasi in atmosfera umidificata al 5% di CO₂ a 37 °C per 1 ora.
   4. Successivamente, tagliare una delle estremità della nave all'interno di un tubo da 15 ml e raccogliere la soluzione di collagenasi. Tagliare l'altra estremità e lavare la superficie luminale con 1-2 ml di PBS per raccogliere tutti gli EC staccati. Mettere tutto il PBS insieme con la soluzione di collagenasi all'interno dello stesso tubo.
   5. Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) per pellettare le celle.
      NOTA. Il pellet cellulare è molto piccolo e difficile da visualizzare. Se il sangue non viene completamente rimosso prima del trattamento con collagenasi (fase 1.2.2.), anche le cellule del sangue precipiteranno e il pellet sarà rossastro.
   6. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3-4 ml di mezzo cellulare endoteliale completo (EBM-2 integrato con fattori di crescita EGM2) e una soluzione aggiuntiva di eparina (5 U/mL, concentrazione finale). Placcare le cellule in un piatto di coltura cellulare da 60 mm pre-rivestito con gelatina al 3% p/v.
      NOTA: La gelatina è stata la prima scelta grazie alla sua facilità di accessibilità e basso costo. Poiché il rivestimento con gelatina mantiene con successo il fenotipo CE, non è stata testata nessun'altra sostanza di rivestimento. Il collagene e la fibronectina possono essere testati in studi volti a studiare l'influenza di diversi componenti della matrice extracellulare sull'adesione EC e sul fenotipo.
   7. Incubare le celle a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO₂ per 4 giorni senza cambiare il mezzo. Dopodiché, cambia i media a giorni alterni. Da questo momento in poi, l'integrazione di mezzi cellulari aggiuntivi con eparina non è più necessaria. Esaminare la piastra al microscopio per assicurarsi che i globuli rossi siano stati rimossi.
   8. Dopo 3-10 giorni dall'estrazione, a seconda delle dimensioni e del diametro del segmento venoso, visualizzare le hSVEC mediante microscopia a contrasto di fase.
   9. Valutare il grado di confluenza e la loro morfologia di ciottoli in microscopia a contrasto di fase.
   10. Continuare a cambiare il supporto ogni 2 giorni fino a quando le celle raggiungono il 70% -80% di confluenza.
   11. Far passare le hSVEC con una soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) allo 0,25% di tripsina-0,02%.
       1. Lavare le celle con PBS preriscaldato.
       2. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA al piatto di coltura cellulare da 60 mm. Incubare a 37 °C per 2 minuti o fino al distacco di tutte le cellule.
       3. Aggiungere 2 ml di mezzo completo di cellule endoteliali per inattivare la tripsina.
       4. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 3 minuti a RT.
       5. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno di coltura.
       6. Contare la sospensione cellulare in blu tripano 1:1 (0,4%) per placcare le cellule vitali.
       7. Per espandere la coltura, placcare le cellule in un piatto di coltura cellulare da 100 mm con 10 ml di mezzo cellulare endoteliale completo preriscaldato e coltivarlo a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO₂.
          NOTA. In media, la semina di 4 x 10⁴ hSVEC/cm² sarà confluente al 100% dopo 48 ore.
   12. Per crioconservare le cellule, risospendere il pellet dal punto 1.2.11.5 in 5% di dimetilsolfossido (DMSO) nel siero fetale bovino (FBS) e conservare in azoto liquido.
3. Caratterizzazione delle hSVEC: colorazione con citometria a flusso per CD31
   1. Trasferire 1 x 10 5 hSVEC in una provetta da^1,5 mL e centrifugare a 300 x g per 3 minuti a RT. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μL di PBS contenente il 2% di BSA e anticorpo monoclonale CD31-FITC (1:100).
   2. Macchiare le celle per 30 minuti a RT al buio.
   3. Lavare le cellule colorate aggiungendo 0,5 ml di PBS e centrifugarle a 300 x g per 3 minuti a RT. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 400 μL di PBS con il 2% di BSA.
   4. Utilizzare hSVEC non etichettate, senza anticorpi CD31, come controllo negativo.
   5. Procedere all'analisi di acquisizione del citometro a flusso utilizzando un laser blu e un canale FITC (eccitazione/emissione max [Ex/Em] di 498/517 nm). Se vengono utilizzati altri fluorocromi, verificare se il citometro dispone di set di filtri appropriati per il loro rilevamento. Separare le cellule dai detriti in funzione delle loro dimensioni e granularità, quindi eliminare le singole celle mediante dispersione in avanti e dispersione laterale.
4. Caratterizzazione delle hSVEC: colorazione fluorescente per CD31 e VE-caderina
   1. Piastra 0,1 x 10⁵ celle nel vetrino a 8 pozzetti rivestito di gelatina. Incubare le cellule per una notte a 37 °C, 5 % CO₂, per consentire alle cellule di attaccarsi alla superficie di coltura.
   2. Rimuovere il mezzo e lavare le celle una volta con PBS.
   3. Aggiungere 0,3 ml / pozzetto di PFA al 4% per fissare le cellule. Incubare per 15 minuti a RT.
   4. Lavare tre volte con PBS.
   5. Aggiungere 0,3 mL/pozzetto di soluzione Triton X-100 allo 0,1% per permeabilizzare le cellule. Incubare per 15 minuti a RT.
   6. Lavare tre volte con PBS.
   7. Per bloccare i siti di legame anticorpale non specifici, aggiungere 0,3 ml / pozzetto di soluzione BSA al 5% alle cellule. Incubare per 15 minuti a RT.
   8. Lavare tre volte con PBS.
   9. Incubare le cellule con gli anticorpi primari (CD31 e VE-caderina, 1:100) diluiti in PBS con 2% di BSA durante la notte con oscillazione delicata a 4 °C. Lasciare un pozzo in incubazione con PBS con BSA al 2% (nessun anticorpo primario) come controllo negativo.
   10. Lavare tre volte con PBS.
   11. Incubare le cellule con anticorpi secondari marcati con fluorescenza diluiti (1:500) in PBS per 1 ora a RT. Aggiungere 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per la colorazione nucleare ad una concentrazione finale di 1 mg/ml.
   12. Lavare tre volte con PBS.
   13. Rimuovere la camera dei supporti con il separatore. Posizionare una goccia del reagente del mezzo di montaggio (50% di glicerolo in PBS) e posizionare un vetrino (24 mm x 60 mm) evitando di intrappolare le bolle.
   14. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza.
       NOTA: DAPI viene rilevato con un cubo luminoso DAPI (Es: 335-379 nm; Em: 417-477 nm), e la CD31/VE-caderina viene rilevata utilizzando un cubo luminoso di proteina fluorescente verde (GFP) (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Anche i cubi luminosi con una gamma di lunghezze d'onda di eccitazione / emissione simili sono adeguati per questi fluorocromi. Se vengono utilizzati altri fluorocromi, verificare se il microscopio utilizzato dispone di set di filtri appropriati per il loro rilevamento.

2. Sforzo di taglio sulle hSVEC

1. Preparazione
   1. Rivestire il vetrino della camera di flusso con gelatina allo 0,1% p/v per almeno 30 minuti a 37 °C. Rimuovere la gelatina in eccesso prima di seminare le cellule.
   2. Equilibrare l'unità fluidica e il set di perfusione sterile con serbatoi da 10 ml durante la notte all'interno dell'incubatore in un'atmosfera umidificata del 5% di CO₂ a 37 °C.
2. Esperimento di sforzo di taglio
   1. Seme 2 x 10⁵ EC sospeso in 100 μL di terreno EC nel vetrino della camera di flusso rivestito di gelatina. Incubare le cellule per 4 ore a 37 °C e 5% di CO₂ per consentire alle cellule di attaccarsi alla superficie di coltura.
   2. Posizionare il set di perfusione sull'unità fluidica come descritto nelle istruzioni del produttore. Riempire i serbatoi e la perfusione impostata in circa 12 ml di mezzo cellulare endoteliale completo preriscaldato. Rimuovere manualmente le bolle d'aria dal set di perfusione per equilibrare il livello di entrambi i serbatoi a 5 ml.
   3. Posizionare l'unità fluidica con il set di perfusione montato, senza la slitta della camera, nell'incubatore e collegare il suo cavo elettrico alla pompa regolata dal computer. Rimuovere tutte le bolle d'aria dai serbatoi e dal set di perfusione, eseguendo un protocollo predefinito nel software di controllo della pompa.
      NOTA. È molto importante rimuovere le bolle d'aria affinché il sistema funzioni correttamente.
   4. Prendere l'unità fluidica con la perfusione montata impostata sulla cappa a flusso laminare e fissare i vetrini con un monostrato a cella confluente.
   5. Posizionare l'unità fluidica con la perfusione montata e le guide con le celle nell'incubatore e collegare il suo cavo elettrico alla pompa.
   6. Nel software di controllo della pompa, impostare i seguenti parametri: viscosità del fluido (0,0072), tipo di slitta, fattore di calibrazione del set di perfusione, velocità di sollecitazione di taglio (20 dyn/cm²), tipo di flusso (unidirezionale) e tempo (72 h) e avviare il flusso (vedere le istruzioni dell'apparecchiatura per ulteriori dettagli). Raccogliere le cellule trattate con gli stessi mezzi senza esposizione al flusso come controlli statici.
   7. Dopo che lo stimolo è completato, lavare le cellule una volta con PBS e procedere alla raccolta dei campioni secondo il test richiesto. Per la colorazione fluorescente, vedere il punto 2.3.1, e per l'estrazione dell'RNA, vedere il punto 2.3.2.
3. Dimostrazione dell'efficacia del protocollo di sforzo di taglio
   1. Colorazione fluorescente dei filamenti di actina (F-actina)
      1. Fissare e permeabilizzare le cellule come indicato nei punti 1.4.2-1.4.6. Utilizzare un volume di 100 μL nel vetrino μ.
      2. Colorare la F-actina con falloidina marcata con fluorescenza (diluita a 1:200 in PBS) e controcolorare il nucleo con DAPI (concentrazione finale di 1 mg/ml in PBS) per 2 ore a RT, al riparo dalla luce.
      3. Lavare tre volte con PBS.
      4. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza.
         NOTA: DAPI viene rilevato con un cubo luminoso DAPI (Es: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) e la falloidina viene rilevata con un cubo luminoso GFP (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Anche i cubi di luce con una gamma simile di lunghezza d'onda di eccitazione / emissione sono adeguati per questi fluorocromi. Se vengono utilizzati altri fluorocromi, verificare se il microscopio utilizzato dispone di set di filtri appropriati per il loro rilevamento.
   2. Espressione genica mediante trascrizione inversa quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)
      1. Raccogliere le cellule dal vetrino μ con 350 μL di un tampone commerciale di lisi contenente guanidina-tiocianato. Isolare l'RNA totale con kit di estrazione basati su colonne, secondo le istruzioni del produttore.
         NOTA: A causa del numero limitato di cellule coltivate nel vetrino μ, si raccomanda l'uso dell'estrazione basata su colonne di RNA.
      2. Preparare il cDNA utilizzando un kit di sintesi del cDNA con enzima inverso trascrittasi, secondo le istruzioni del produttore.
      3. Verificare l'espressione dei geni regolati dallo sforzo di taglio: KLF2, KLF4 e NOS3. Utilizzare il gene governante PPIA / ciclofilina per normalizzare i risultati. I primer specifici per la reazione sono elencati nella Tabella 1.
      4. Eseguire RT-qPCR utilizzando un kit di colorazione di DNA fluorescente verde SYBR nelle seguenti condizioni di reazione: i) 50 °C per 2 min, ii) 95 °C per 15 min, iii) 94 °C per 15 s, iv) 60 °C per 30 s, v) 72 °C per 30 s. Ripetere i passaggi da iii a v per 40 cicli. Aggiungere una fase di fusione alla fine della reazione per verificare la specificità del primer.

3. Allungamento ciclico su hSVEC

1. Preparazione
   1. Applicare lubrificante a base di silicone sulle parti superiori e laterali della stazione di carico equibiassiale a 6 pozzetti da 25 mm.
      NOTA: Questo riduce l'attrito tra la membrana della piastra di coltura e la stazione, consentendo una migliore distribuzione della deformazione ciclica. Questo passaggio deve essere fatto prima di ogni esperimento.
2. Esperimento di allungamento ciclico
   1. Seme 4 x 10⁵ cellule sospese in 3 ml a ciascun pozzetto delle piastre di coltura a fondo flessibile a 6 pozzetti rivestite con collagene I (Tabella dei materiali). Pianificare di avere una o più piastre in condizioni statiche come gruppo di controllo. Tenere le celle nell'incubatore (37 °C in aria umidificata con 5% di CO₂) fino a quando non raggiungono il 100% di confluenza (di solito 48 ore dopo la semina). Prima dell'inizio del protocollo di allungamento, lavare le cellule una volta con PBS preriscaldato e aggiungere 3 ml di terreno di coltura fresco per pozzetto.
   2. Inserire la piastra di base con tutte le stazioni di carico lubrificate nell'incubatore e collegare opportunamente il tubo con l'apparecchiatura di controllo del sistema di allungamento del bioreattore della cella di trazione (vedere le istruzioni dell'apparecchiatura per ulteriori dettagli).
   3. Attaccare ogni piastra di coltura a una guarnizione rossa, fornita dal sistema di allungamento del bioreattore della cella di tensione. Quindi, inseriscili nella piastra di base all'interno dell'incubatore.
      1. Assicurarsi che le piastre siano completamente posizionate, pressate e sigillate alla piastra di base per evitare perdite d'aria durante il pompaggio del vuoto. È importante avere tutte e quattro le piastre di coltura nella piastra di base per avere il vuoto e il carico di allungamento appropriati.
      2. In caso di numero inferiore di piastre sperimentali, utilizzarne una vuota per completare le quattro posizioni nella piastra di base. Aggiungere il foglio acrilico (fornito con l'apparecchiatura) sopra le piastre di coltura per migliorare la tenuta della piastra di base. Posizionare le piastre statiche nella stessa incubatrice.
   4. Accendere l'apparecchiatura del controller e il sistema informatico. Aprire l'icona del software e configurare il regime desiderato: dimensioni della stazione di carico da utilizzare, tipo di deformazione, percentuale di allungamento, forma d'onda, frequenza e tempo. Per informazioni dettagliate, consultare le istruzioni del produttore. Seleziona e scarica il regime. Qui è stato utilizzato il seguente regime: forma d'onda sinusale 1/2, frequenza 1 Hz, 5% di allungamento (per imitare l'allungamento venoso) e 15% di allungamento (per imitare l'allungamento arterioso) fino a 72 ore.
   5. Accendere il sistema di aspirazione e fare clic su Start sullo schermo del computer per eseguire lo stretching. Controlla se la membrana di silicone si muove e allunga le cellule.
   6. Dopo che lo stimolo è completato, lavare le cellule una volta con PBS e procedere alla raccolta dei campioni secondo il test richiesto. Qui, per dimostrare l'efficacia dell'allungamento ciclico, raccogliere il terreno di coltura hSVEC, mantenerlo a -80 °C per ulteriori misurazioni dell'ossido nitrico (NO) e fissare le cellule per la colorazione fluorescente.
      NOTA. La piastra di base non può essere conservata all'interno dell'incubatore quando non viene utilizzata; Altrimenti, la temperatura può modificare la forma piatta e renderla inutilizzabile.
3. Dimostrazione dell'efficacia del protocollo cyclic stretch
   1. Colorazione fluorescente di F-actina
      1. Fissare le celle come indicato al punto 1.4.3. Utilizzare un volume di 1 mL per pozzetto.
      2. Lavare le celle tre volte con PBS. Mantenere le cellule in PBS in modo che non si asciughino mentre si prepara la membrana di silicone per i passaggi successivi.
      3. Utilizzare un batuffolo di cotone per rimuovere il lubrificante a base di silicone in eccesso dal fondo della membrana. Quindi, applicare delicatamente il detergente per vetri o il sapone per le mani con un nuovo batuffolo di cotone. Ripetere il processo fino a quando tutto il lubrificante viene rimosso dalla membrana. Quindi, pulire con acqua deionizzata.
         NOTA. È importante rimuovere completamente il lubrificante dalla membrana siliconica per avere immagini al microscopio di buona qualità.
      4. Tagliare con cura le membrane siliconiche in piccoli pezzi per adattarle ai vetrini a 8 pozzetti per la colorazione. Permeabilizzare le cellule come indicato al punto 1.4.5.
      5. Dopo le fasi di lavaggio, colorare la F-actina usando la falloidina e il nucleo con DAPI. Procedere all'analisi, come indicato nei punti 2.3.1.2 e 2.3.1.3. Utilizzare un volume di 0,3 ml per camera pozzetto.
      6. Rimuovere la camera dei supporti con il separatore. Posizionare una goccia di reagente del mezzo di montaggio (50% di glicerolo in PBS) e posizionare un vetrino (24 mm x 60 mm).
      7. Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza.
         NOTA: DAPI viene rilevato con un cubo luminoso DAPI (Es: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) e la falloidina viene rilevata con un cubo luminoso a proteina fluorescente rossa (RFP) (Ex: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Anche i cubi di luce con una gamma simile di lunghezza d'onda di eccitazione / emissione sono adeguati per questi fluorocromi. Se vengono utilizzati altri fluorocromi, verificare se il microscopio utilizzato dispone di set di filtri appropriati per il loro rilevamento.
   2. Misura di NO stimata dall'accumulo di nitriti (NO₂) nel mezzo condizionato hSVEC utilizzando un saggio di chemiluminescenza riduttiva a base di ioduro di potassio
      1. Preparazione
         1. Preparare una curva standard da 0,01-10 mM di soluzione di nitrito di sodio (NaNO₂ in acqua ultrapura).
         2. Aggiungere 5 mL di acido acetico e 1 mL di ioduro di potassio (50 mg in 1 mL di acqua ultrapura) nel recipiente di spurgo dell'analizzatore di ossido nitrico.
      2. NESSUNA misurazione
         1. Aggiungere 20 μL della curva standard NaNO₂ nel recipiente di spurgo dell'analizzatore di ossido nitrico. Misurarlo secondo il protocollo del produttore.
   3. Aggiungere 20 μL del mezzo condizionato nel recipiente di spurgo dell'analizzatore di ossido nitrico. Misurarlo secondo il protocollo del produttore.
   4. Calcolare le concentrazioni di NO₂ in base alla calibrazione della curva standard. Regolare i valori ottenuti dal volume totale del mezzo condizionato analizzato ^6,11.

Risultati

Tipicamente, le EC aderenti possono essere osservate 3-4 giorni dopo l'estrazione. Le hSVEC formano inizialmente gruppi di cellule e mostrano una tipica morfologia "ciottolata" (Figura 1B). Esprimono i marcatori EC CD31 (Figura 1C,D) e VE-caderina (Figura 1D). Le hSVEC possono essere facilmente propagate su un piatto di coltura cellulare trattata non rivestita e mantengono il fenotipo endoteliale in coltura fino a o...

Discussione

Il segmento della vena safena deve essere di almeno 2 cm per isolare con successo le hSVEC. Piccoli segmenti sono difficili da gestire e legano le estremità del vaso per mantenere la soluzione di collagenasi per isolare le cellule. La ridotta superficie luminale non produce cellule sufficienti per espandere la coltura. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione con non-EC, la manipolazione del segmento della vena safena deve essere molto delicata durante l'intera procedura. È importante prestare attenzione quan...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution	Gibco	25200072
15 µ slide I 0.4 Luer	Ibidi	80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm	Flexcell International Corporation	LS-3000B25.VJW
8-well chamber slide with removable well	Thermo Fisher Scientific	154453
Acetic Acid (Glacial)	Millipore	100063
Acrylic sheet 1 cm thick	Plexiglass
Anti-CD31 antibody	Abcam	ab24590
Anti-CD31, FITC antibody	Thermo Fisher Scientific	MHCD3101
Anti-VE-cadherin antibody	Cell Signaling	2500
Bioflex plates collagen I	Flexcell International Corporation	BF3001C
Bovine serum albumin solution	Sigma-Aldrich	A8412
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm	Brasuture	AP524
Cyclophilin forward primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
Cyclophilin reverse primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540
EBM-2 basal medium	Lonza	CC3156
EGM-2 SingleQuots supplements	Lonza	CC4176
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	2657-029
Flexcell FX-5000 tension system	Flexcell International Corporation	FX-5000T
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma-Aldrich	F4680
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11001
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11008
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL	Blau Farmacêutica	SKU 68027
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)	Ibidi	10902
KLF2 forward primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
KLF2 reverse primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
KLF4 forward primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
KLF4 reverse primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
NOA 280 nitric oxide analyzer	Sievers Instruments	NOA-280i-1
NOS3 forward primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
NOS3 reverse primer	Thermo Fisher Scientific	Custom designed
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs	Ibidi	10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A12380
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010031
Potassium Iodide	Sigma-Aldrich	221945
QuanTitec SYBR green PCR kit	Qiagen	204143
QuantStudio 12K flex platform	Applied Biosystems	4471087
RNeasy micro kit	Quiagen	74004
Slide glass (24 mm x 60 mm)	Knittel Glass	VD12460Y1D.01
Sodium nitrite	Sigma-Aldrich	31443
SuperScript IV first-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18091200
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Trypan blue stain 0.4%	Gibco	15250-061
Type II collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C6885