Ligadura auricular izquierda en embrión aviar como modelo de carga hemodinámica alterada durante el desarrollo vascular temprano

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo visual detallado para ejecutar el modelo de ligadura auricular izquierda (LAL) en el embrión aviar. El modelo LAL altera el flujo intracardíaco, lo que cambia la carga de tensión de cizallamiento de la pared, imitando el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico. Se presenta un enfoque para superar los desafíos de este difícil modelo de microcirugía.

Resumen

Debido a su configuración ventricular madura de cuatro cámaras, facilidad de cultivo, acceso a imágenes y eficiencia, el embrión aviar es un modelo animal vertebrado preferido para estudiar el desarrollo cardiovascular. Los estudios que tienen como objetivo comprender el desarrollo normal y el pronóstico de las cardiopatías congénitas adoptan ampliamente este modelo. Se introducen técnicas quirúrgicas microscópicas para alterar los patrones normales de carga mecánica en un punto de tiempo embrionario específico y rastrear la cascada molecular y genética posterior. Las intervenciones mecánicas más comunes son la ligadura de la vena vitelina izquierda, la banda conotruncal y la ligadura auricular izquierda (LAL), modulando la presión vascular intramural y el esfuerzo de cizallamiento de la pared debido al flujo sanguíneo. La LAL, especialmente si se realiza en ovo, es la intervención más difícil, con rendimientos de muestra muy pequeños debido a las operaciones microquirúrgicas secuenciales extremadamente finas. A pesar de su alto riesgo, el LAL in ovo es muy valioso científicamente, ya que imita la patogénesis del síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS). La HLHS es una cardiopatía congénita compleja clínicamente relevante que se observa en recién nacidos humanos. En este documento se documenta un protocolo detallado para la LAL in ovo . Brevemente, los embriones aviares fertilizados se incubaron a 37,5 °C y 60% de humedad constante, por lo general, hasta que alcanzaron las etapas 20 a 21 de Hamburger-Hamilton (HH). Las cáscaras de huevo se abrieron y se quitaron las membranas externas e internas. El embrión se rotó suavemente para exponer el bulbo auricular izquierdo de la aurícula común. Los micronudos preensamblados de suturas de nailon 10-0 se colocaron suavemente y se ataron alrededor de la yema auricular izquierda. Finalmente, el embrión fue devuelto a su posición original y se completó la LAL. Los ventrículos normales e instrumentados por LAL demostraron diferencias estadísticamente significativas en la compactación tisular. Una línea eficiente de generación de modelos LAL contribuiría a los estudios centrados en la manipulación mecánica y genética sincronizada durante el desarrollo embrionario de los componentes cardiovasculares. Del mismo modo, este modelo proporcionará una fuente celular perturbada para la investigación de cultivos de tejidos y biología vascular.

Introducción

Los defectos cardíacos congénitos (CC) son trastornos estructurales que ocurren debido a un desarrollo embrionario anormal¹. Además de las condiciones genéticas, la patogenia está influenciada por la alteración de la carga mecánica ^2,3. El síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS), una cardiopatía congénita, da lugar a un ventrículo/aorta subdesarrollado al nacer⁴ con una alta tasa de mortalidad ^5,6. A pesar de los recientes avances en su manejo clínico, la dinámica de crecimiento y desarrollo vascular del HLHS aún no está clara⁷. En el desarrollo embrionario normal, el endocardio y el miocardio del ventrículo izquierdo (VI) se originan a partir de progenitores cardíacos a medida que avanza la formación temprana del tubo cardíaco embrionario. Se reporta la presencia gradual de trabeculación miocárdica, engrosamiento de capas y proliferación de cardiomiocitos². Para el HLHS, se observa alteración del remodelado trabecular y aplanamiento del ventrículo izquierdo, lo que contribuye aún más a la hipoplasia miocárdica debido a la migración anormal de los cardiomiocitos 2,8,9,10

Entre los organismos modelo ampliamente utilizados para estudiar el desarrollo del corazón y comprender las condiciones hemodinámicas 11, se prefiere el embrión aviar debido a su corazón maduro de cuatro cámaras y su facilidad de cultivo^11,12,13,14. Por otro lado, el acceso avanzado a la obtención de imágenes de embriones de pez cebra y ratones transgénicos/knockout proporciona claras ventajas^11,12. Se han probado varias intervenciones mecánicas para el embrión aviar que alteran la presión intramural y el estrés de cizallamiento de la pared en el desarrollo de componentes cardiovasculares. Estos modelos incluyen la ligadura vitelina izquierda, la banda conotruncal¹⁵ y la ligadura auricular izquierda (LAL)^11,12,16. El fenotipo resultante debido a la alteración de la carga mecánica se puede observar aproximadamente 24-48 h después de la intervención quirúrgica en estudios centrados en el pronóstico precoz^11,13. La intervención LAL es una técnica popular para estrechar el volumen funcional de la aurícula izquierda (AI) mediante la colocación de un asa de sutura alrededor de la abertura auriculoventricular. Asimismo, también se han realizado intervenciones microquirúrgicas dirigidas a la ligadura auricular derecha (RAL)^17,18. Del mismo modo, algunos investigadores se dirigen a la orejuela auricular izquierda (AIF) utilizando microclips para reducir el volumen de la AI^19,20. En algunos estudios, se aplica un hilo de nylon quirúrgico en el nódulo auriculoventricular^19,21. Una de las intervenciones utilizadas es la LAL, que puede imitar el HLHS, pero también es el modelo más difícil de realizar, con rendimientos de muestra muy pequeños debido a las operaciones microquirúrgicas extremadamente finas que se requieren. En nuestro laboratorio, la LAL se realiza in ovo entre los estadios 20 y 21 de Hamburger-Hamilton (HH), antes de que la aurícula común esté completamente septada 6,14,22,23. Se coloca una sutura quirúrgica alrededor de la AI, que altera las corrientes de flujo sanguíneo intracardíaco. En los modelos LAL de HLHS, se observa un aumento de la rigidez de la pared del ventrículo, una alteración de los ángulos de las miofibras y una disminución del tamaño de la cavidad del VI^14,24.

En este artículo de video, se proporciona un protocolo detallado y un enfoque para LAL in ovo . Brevemente, los embriones aviares fertilizados se incubaron para microcirugía, se abrió la cáscara del huevo y se limpiaron las membranas externa e interna. A continuación, el embrión se rotó lentamente para que el LA fuera accesible. Se ató una sutura quirúrgica de nylon 10-0 a la yema auricular y el embrión fue devuelto a su orientación original, completando el procedimiento LAL²⁵. La LAL y los ventrículos normales se comparan para la compactación tisular y el volumen del ventrículo mediante tomografía de coherencia óptica e histología básica.

Un modelo de LAL ejecutado con éxito, como se describe aquí, contribuirá a los estudios básicos centrados en el desarrollo embrionario de los componentes cardiovasculares. Este modelo también se puede utilizar junto con manipulaciones genéticas y modalidades avanzadas de imagen. Del mismo modo, el modelo LAL agudo es una fuente estable de células vasculares enfermas para experimentos de cultivo de tejidos.

Protocolo

Los huevos fértiles de Livorno blanco se obtienen de proveedores confiables y se incuban de acuerdo con las pautas aprobadas por la universidad. Los embriones de pollo, estadios 18 (día 3) a 24 (día 4) (los estadios presentados en este artículo) no se consideran animales vertebrados vivos por la directiva 2010/63/UE de la Unión Europea (UE) y las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en los Estados Unidos. Los embriones de pollo se consideran "animales vivos" después del día 19 de incubación según las leyes de EE. UU., pero no para la UE. Cada huevo está etiquetado con la fecha de inicio de la eclosión y está programado para eclosionar a más tardar el^{décimo día de} incubación. Después de que los huevos eclosionan, los pollitos se retiran de la incubadora. El protocolo se realiza en dos estaciones de operación de sobremesa (Estación 1 y Estación 2), centrándose en etapas especializadas de generación de modelos.

1. Preparación antes de la microcirugía

1. Obtenga óvulos fertilizados de un centro de desarrollo de vacunas con un grado específico libre de patógenos (SPF) o a través de una granja de proveedores comerciales de confianza por un mensajero de entrega frágil en contenedores de poliestireno seco. Antes de la incubación, limpie suavemente la cáscara del huevo con toallitas sin pelusa empapadas en etanol al 70% para eliminar la contaminación.
2. Criterios de inclusión/exclusión embrionaria
   1. No incube huevos que se hayan agrietado o dañado durante el transporte.
   2. Si se observa sangrado durante el procedimiento de LAL o después de la reinincubación, no utilice el embrión.
   3. No utilice embriones que se desarrollen en la posición del lado izquierdo hacia arriba, ya que el flujo sanguíneo hemodinámico puede diferir de la orientación normal.
   4. Embriones Dıscard que se desarrollan con defectos congénitos tanto en procedimientos pre como postquirúrgicos.
   5. Incluir embriones que alcancen la etapa deseada desarrollándose en su ubicación original, imitando el HLHS como modelo LAL.
3. Incubar los huevos fertilizados de gallina blanca de Livorno (Gallus gallus domesticus L.), con el extremo romo hacia arriba, hasta la etapa deseada, típicamente a HH20-21¹⁵ (37,5 °C, 60% de humedad, 3,5 días) (Figura 1).
   NOTA: Es importante mantener los huevos a una temperatura y humedad constantes para aumentar el rendimiento. Dependiendo del modelo de incubadora, la adición de una olla llena de agua destilada mantendrá una humedad estable. Los autores desarrollan y recomiendan los planos de un sistema de control de temperatura y humedad adicional/auxiliar que se adaptaría a la mayoría de las incubadoras. Los detalles electrónicos, de hardware y de código de esta unidad de sensor/control de fabricación propia se proporcionan en un repositorio de datos²⁶. La agitación suave y continua (rotación) de los huevos durante la incubación puede permitir un posicionamiento óptimo del embrión y, por lo tanto, conducir a un mayor porcentaje de embriones "operables". Shaking también puede trabajar con incubadoras con esta capacidad y aumentar aún más la productividad.
4. Antes de comenzar el procedimiento, prepare el número requerido de nudos atando un nudo suelto en una sutura 10-0 de 1,5 cm de largo. Asegúrese de que el nudo no esté apretado y que sea lo suficientemente grande como para caber fácilmente sobre las aurículas durante la operación (Figura 2).
   NOTA: Haga los nudos con anticipación y manténgalos en una solución estéril de timbre para pollitos antes de usar. La operación de atado de nudos requiere el uso de las dos manos para operar las pinzas de forma sincronizada. Dado que esta es una etapa crítica en el protocolo, se puede hacer un modelo de la aurícula con masilla para practicar este paso (Figura 3). Esto mejorará las habilidades de microcirugía tridimensional necesarias para realizar el paso 3.2.3 en la Estación 2 (Figura 4).

2. Operaciones en la Estación 1 (Figura 4A)

1. Abra una ventana desde el extremo romo del huevo y retire las membranas externa e interna¹⁵ (Figura 5A-D).
2. Abra la cáscara del huevo rompiéndola suavemente con el extremo inverso de las pinzas, con los dedos libres sosteniendo firmemente el huevo para reducir la propagación no deseada de grietas.
3. Dado que la LAL es un procedimiento largo, se debe conservar la temperatura y la humedad del embrión, ya que la frecuencia cardíaca depende de la temperatura. Por lo tanto, asegúrese de que la ventana de shell inicial se cree lo más pequeña posible, lo suficiente para ejecutar las operaciones.
   NOTA: No se emplean sistemas de control de humedad o temperatura durante la operación, pero estos sistemas, si están disponibles, beneficiarían el rendimiento. Si es posible, se apaga el sistema de aire acondicionado del laboratorio y el procedimiento se realiza a la temperatura ambiente más alta posible. También se recomienda la optimización de la frecuencia cardíaca embrionaria, que puede controlarse mediante la temperatura, durante la operación. Algunos laboratorios mantienen la frecuencia cardíaca a frecuencias ligeramente inferiores a 120 lpm mediante el control de la temperatura durante el funcionamiento de LAL. Como tal, el control de la humedad empleado alrededor de la zona quirúrgica aumentaría aún más el rendimiento. Las ventanas de cáscara de huevo se crean lo más pequeñas posible, lo suficientemente grandes como para permitir el acceso quirúrgico. Esto también es aplicable a la membrana externa gruesa, que suele ser más pequeña que la cáscara del huevo solo en la medida de la circunferencia del embrión. Estos aseguran mantener la temperatura y la humedad del embrión. Al abrir una ventana desde el extremo romo del huevo, los pequeños fragmentos de cáscara se limpian para que estos trozos no dañen la integridad vascular vitelina ni den lugar a artefactos no deseados. Además, otros laboratorios utilizan tijeras curvas microdentadas para hacer ventanas. Además, se pueden usar dos anchos de cinta adhesiva para estabilizar la cáscara de huevo y controlar el agrietamiento.
4. Retire solo la membrana vitelina necesaria con unas microtijeras (Video complementario 1).
5. El desarrollo embrionario normal es del revés. Una vez que el embrión esté libre de la membrana vitelina, coloque la pinza con las puntas cerradas debajo del segmento dorsal del embrión y voltee suavemente el embrión para exponer el lado izquierdo (es decir, la configuración del lado izquierdo hacia arriba) (Figura 6A, B; Video complementario 2).
6. Asegúrese de que la yema auricular izquierda esté ahora expuesta, pero aún cubierta por un complejo sistema de membranas, que generalmente consiste en una doble capa del pericardio.
7. Retire las membranas, incluidas las finas, inmediatamente alrededor de la yema auricular. Esta es otra etapa crítica; Realice la extracción de membranas gruesas y progrese a las finas alrededor de la yema auricular izquierda. Reserve las pinzas más finas para retirar la membrana fina (Video complementario 3).
8. Durante el proceso de extracción de la membrana, oriente el embrión en posición hacia arriba, de modo que la operación de colocación del nudo en el paso 3.2 se pueda realizar sin necesidad de reposicionarlo. Para ello, levanta el embrión con las membranas del paso 2.6 y cuélgalo de la cáscara del huevo, asegurándote de que el lado izquierdo quede hacia arriba.
   NOTA: Algunos embriones pueden estar ubicados cerca de la periferia de la cáscara del huevo y pueden ser difíciles de operar. Aun así, lo más probable es que estos embriones estén orientados hacia arriba y muestren un comportamiento normal, y pueden incluirse en el estudio. En estos casos, si es necesario, la aurícula oscurecida se puede hacer más accesible limpiando suavemente la membrana pericárdica con pinzas finas # 4 y retirando la cáscara del huevo en la dirección inversa (hacia la abertura de la cáscara). Estos embriones también pueden levantarse utilizando partes de las membranas extraembrionarias y fijarse en la posición deseada uniendo un extremo de la membrana (el extremo de la pinza) a la cáscara del huevo, utilizando su pegajosidad natural. Además, el espacio entre la cabeza y la región de la médula espinal del embrión se puede expandir con la ayuda de pinzas para revelar la aurícula oscurecida.

3. Operaciones en la Estación 2 (Figura 4B)

1. Bajo el microscopio estereoscópico, coloque el nudo preparado previamente del paso 1.4 cerca del embrión en un lugar accesible (Figura 6B). La yema auricular ya está lista para ser atada (Video complementario 4).
2. Recupere el nudo abierto preparado previamente y oriéntelo sobre la yema auricular izquierda. Para que el LAL funcione, coloque el huevo en una orientación tridimensional inclinada de manera única.
   1. Orientar correctamente el nudo para ejecutar el proceso de apriete sin dañar los embriones.
   2. Limpie las membranas finas de manera óptima en el paso 2.7 para reducir el efecto de un corazón latiendo.
   3. Apriete la sutura (Figura 6C). Para este paso, practicar con la masilla es muy útil. En el caso de los embriones falsos, aprieta el nudo lo suficiente como para sostenerlo.
3. A continuación, utilice las microtijeras para cortar los extremos sobrantes de la sutura lo más cerca posible de la yema (Vídeo complementario 5).
4. Tenga mucho cuidado de que los extremos recién cortados de la sutura atada no estén en condiciones de perforar los vasos cercanos durante la rotación o debido a los latidos del corazón.
5. Con las pinzas, retire el exceso de piezas de sutura cortadas en el paso 3.3.
6. Por último, con unas pinzas cerradas, devolver el embrión a su posición original, como en el paso 2.5 (Vídeo complementario 6).
7. Después de completar el proceso LAL, cubra el huevo con una doble capa de parafilm y vuelva a incubarlo. Un cierre hermético y estéril de los huevos es primordial para la supervivencia, especialmente después de las 24 h de incubación. Si también desea acceso visual, use cera de parafina con portaobjetos de vidrio.
   NOTA: A medida que se estudia el período embrionario temprano, los huevos generalmente se incuban durante 24-48 h hasta que alcanzan aproximadamente HH25 o HH27. Sin embargo, no hay límite, y se pueden estudiar estadios posteriores, como han intentado otros investigadores. Para velocidades de operación rápidas, se recomienda al menos un equipo de dos personas. Una persona debe estar capacitada y es responsable de la apertura del huevo, la limpieza inicial de la membrana, la rotación y la limpieza de la membrana alrededor de la yema auricular izquierda. La otra persona es responsable solo de la preparación inicial del nudo, la colocación del nudo y el apriete. La rotación embrionaria final puede ser realizada por la Persona 1. La operación quirúrgica de un solo embrión dura unos 4-5 minutos.
8. Antes y después de las operaciones quirúrgicas, limpie las superficies de sobremesa y los instrumentos con etanol. Asegúrese de aplicar una solución fresca de anillador de pollitos (NaCl, KCl, CaCl₂ y NaHCO₃)^16,27 a los instrumentos metálicos que tocan los tejidos embrionarios.

Resultados

Se pueden emplear técnicas avanzadas de imagen resueltas en el tiempo para observar los cambios estructurales y morfológicos debidos a la intervención de LAL¹⁰. Además, las muestras de LAL también son susceptibles a métodos moleculares y biológicos^19,28. En la Tabla 1, se proporcionan los resultados de los estudios de muestra que emplearon el modelo LAL. En este contexto, se realizó la intervención de LAL en embri...

Discusión

En el HLHS, el flujo sanguíneo se altera debido a defectos estructurales, lo que lleva a una morfología anormal en el lado izquierdo ^4,6. El presente modelo proporciona un sistema experimental práctico para comprender mejor la progresión del HLHS e incluso puede imitar su patogenia⁸. Sin embargo, establecer un modelo animal de HLHS totalmente equivalente desde el punto de vista clínico es una tarea difícil. Además del modelo de LAL ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo