Ligadura do átrio esquerdo no embrião aviário como modelo de carga hemodinâmica alterada durante o desenvolvimento vascular inicial

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo visual detalhado para a execução do modelo de ligadura atrial esquerda (LAL) no embrião aviário. O modelo LAL altera o fluxo intracardíaco, o que altera a carga de tensão de cisalhamento da parede, mimetizando a síndrome da hipoplasia do coração esquerdo. Uma abordagem para superar os desafios deste difícil modelo de microcirurgia é apresentada.

Resumo

Devido à sua configuração ventricular madura de quatro câmaras, facilidade de cultivo, acesso à imagem e eficiência, o embrião aviário é um modelo animal vertebrado preferido para estudar o desenvolvimento cardiovascular. Estudos com o objetivo de compreender o desenvolvimento normal e o prognóstico das cardiopatias congênitas adotam amplamente esse modelo. Técnicas cirúrgicas microscópicas são introduzidas para alterar os padrões normais de carregamento mecânico em um ponto de tempo embrionário específico e rastrear a cascata molecular e genética a jusante. As intervenções mecânicas mais comuns são ligadura da veia vitelínea esquerda, bandagem conotruncal e ligadura atrial esquerda (LAE), modulando a pressão vascular intramural e o estresse de cisalhamento da parede devido ao fluxo sanguíneo. O LAL, particularmente se realizado em ovo, é a intervenção mais desafiadora, com rendimentos amostrais muito pequenos devido às operações microcirúrgicas sequenciais extremamente finas. Apesar de seu alto risco, in ovoLAL é muito valioso cientificamente, pois mimetiza a patogênese da síndrome do coração esquerdo hipoplásico (SHCE). A SHCE é uma cardiopatia congênita complexa e clinicamente relevante observada em recém-nascidos humanos. Um protocolo detalhado para in ovo LAL está documentado neste artigo. Resumidamente, embriões de aves fertilizados foram incubados a 37,5 °C e 60% de umidade constante tipicamente até atingirem os estágios 20 a 21 de Hamburger-Hamilton (HH). As cascas dos ovos foram abertas e as membranas externa e interna foram removidas. O embrião foi rodado suavemente para expor o bulbo atrial esquerdo do átrio comum. Micronós pré-montados a partir de pontos de náilon 10-0 foram suavemente posicionados e amarrados ao redor do broto atrial esquerdo. Finalmente, o embrião foi devolvido à sua posição original, e LAL foi completado. Ventrículos normais e instrumentados em LAL demonstraram diferenças estatisticamente significativas na compactação tecidual. Um pipeline eficiente de geração de modelos LAL contribuiria para estudos com foco na manipulação mecânica e genética sincronizada durante o desenvolvimento embrionário de componentes cardiovasculares. Da mesma forma, este modelo fornecerá uma fonte de células perturbadas para pesquisa em cultura de tecidos e biologia vascular.

Introdução

As cardiopatias congênitas (DCC) são distúrbios estruturais decorrentes do desenvolvimento embrionário anormal¹. Além das condições genéticas, a patogênese é influenciada pela carga mecânica alterada ^2,3. A síndrome de hipoplasia do coração esquerdo (SHCE), uma cardiopatia congênita, resulta em ventrículo/aorta subdesenvolvidos ao nascimento⁴ com alta taxa de mortalidade ^5,6. Apesar dos recentes avanços em seu manejo clínico, a dinâmica de crescimento e desenvolvimento vascular da SHCE ainda não^{está clara7}. No desenvolvimento embrionário normal, o endocárdio e o miocárdio do ventrículo esquerdo (VE) originam-se de progenitores cardíacos à medida que a formação precoce do tubo cardíaco embrionário progride. É relatada a presença gradual de trabeculação miocárdica, espessamento das camadas e proliferação de cardiomiócitos². Para a SHCE, observa-se alteração do remodelamento trabecular e achatamento do ventrículo esquerdo, contribuindo ainda mais para a hipoplasia miocárdica devido^{à migração} anormal de cardiomiócitos2,8,9,10

Dentre os organismos-modelo amplamente utilizados para estudar o desenvolvimento cardíaco e compreender as condições hemodinâmicas 11, o embrião aviário é preferido devido ao seu coração maduro de quatro câmaras e à facilidade de cultivo^11,12,13,14. Por outro lado, o acesso avançado à imagem de embriões de peixe-zebra e camundongos transgênicos/knockout oferece vantagens distintas^11,12. Várias intervenções mecânicas têm sido testadas para o embrião aviário que alteram a pressão intramural e a tensão de cisalhamento da parede no desenvolvimento de componentes cardiovasculares. Esses modelos incluem ligadura vitelíntica esquerda, bandagem conotruncal15 e ligadura atrial esquerda (LAL)^11,12,16. O fenótipo resultante devido à carga mecânica alterada pode ser observado aproximadamente 24-48 h após a intervenção cirúrgica em estudos com foco no prognóstico precoce^11,13. A intervenção no LAL é uma técnica popular para estreitar o volume funcional do átrio esquerdo (AE) através da colocação de uma alça de sutura ao redor da abertura atrioventricular. Da mesma forma, intervenções microcirúrgicas também têm sido realizadas visando a ligadura atrial direita (RAL)^17,18. Da mesma forma, alguns pesquisadores têm como alvo o apêndice atrial esquerdo (AAE) utilizando microclipes para reduzir o volume do AE ^19,20. Em alguns estudos, um fio de náilon cirúrgico é aplicado no nó atrioventricular^19,21. Uma das intervenções utilizadas é o LAL, que pode mimetizar a SHCE, mas também é o modelo mais difícil de ser realizado, com rendimentos amostrais muito pequenos devido às operações microcirúrgicas extremamente finas necessárias. Em nosso laboratório, o LBA é realizado em ovo entre os estágios 20 e 21 de Hamburger-Hamilton (HH), antes que o átrio comum esteja completamente septado6,14,22,23. Uma sutura cirúrgica é colocada ao redor do AL, o que altera as correntes sanguíneas intracardíacas. Nos modelos de LAL da SHCE, observa-se aumento da rigidez da parede do ventrículo, alteração dos ângulos das miofibras e diminuição do tamanho da cavidade do VE^14,24.

Neste artigo em vídeo, um protocolo detalhado e abordagem para in ovo LAL é fornecido. Resumidamente, os embriões de aves fertilizados foram incubados para microcirurgia, a casca do ovo foi rachada e as membranas externa e interna foram limpas. O embrião foi então girado lentamente para que o AE fosse acessível. Uma sutura cirúrgica com náilon 10-0 foi amarrada ao broto atrial e o embrião foi devolvido à sua orientação original, completando o procedimento LAL²⁵. LAL e ventrículos normais são comparados quanto à compactação do tecido e volume ventricular através de tomografia de coerência óptica e histologia básica.

Um pipeline de modelos LAL executado com sucesso, como descrito aqui, contribuirá para estudos básicos com foco no desenvolvimento embrionário de componentes cardiovasculares. Este modelo também pode ser usado em conjunto com manipulações genéticas e modalidades avançadas de imagem. Da mesma forma, o modelo LAL agudo é uma fonte estável de células vasculares doentes para experimentos de cultura de tecidos.

Protocolo

Os ovos brancos férteis de Leghorn são obtidos de fornecedores confiáveis e incubados de acordo com as diretrizes aprovadas pela universidade. Embriões de pintinhos, estágios 18 (dia 3) a 24 (dia 4) (os estágios apresentados neste artigo) não são considerados animais vertebrados vivos pela diretiva 2010/63/EU da União Europeia (UE) e pelas diretrizes do comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) nos EUA. Os embriões de pintinhos são considerados "animais vivos" após o 19º dia de incubação de acordo com as leis dos EUA, mas não para a UE. Cada ovo é rotulado com a data de início da eclosão e está programado para eclodir o mais tardar no^10º dia de incubação. Após a eclosão dos ovos, os filhotes são retirados da incubadora. O protocolo é realizado em duas estações de operação de bancada (Estação 1 e Estação 2), com foco em etapas especializadas de geração de modelos.

1. Preparo antes da microcirurgia

1. Obtenha ovos fertilizados de um centro de desenvolvimento de vacinas com um grau específico livre de patógenos (SPF) ou através de uma fazenda de fornecedor comercial confiável por um mensageiro de entrega frágil em recipientes secos de poliestireno. Antes da incubação, limpe suavemente a casca do ovo com lenços sem fiapos embebidos em etanol 70% para remover a contaminação.
2. Critérios de inclusão/exclusão de embriões
   1. Não incube ovos que foram rachados ou danificados durante o transporte.
   2. Se for observado sangramento durante o procedimento LAL ou após a reincubação, não use o embrião.
   3. Não use embriões que se desenvolvam na posição do lado esquerdo para cima, pois o fluxo sanguíneo hemodinâmico pode diferir da orientação normal.
   4. Embriões de Dıscard desenvolvendo-se com defeitos congênitos em procedimentos pré e pós-cirúrgicos.
   5. Incluir embriões que atinjam o estágio alvo de desenvolvimento em sua localização original, imitando a SHCE como um modelo LAL.
3. Incubar os ovos de galinha (Gallus gallus domesticus L .), fertilizados, até o estágio desejado tipicamente em HH20-21¹⁵ (37,5 °C, 60% de umidade, 3,5 dias) (Figura 1).
   OBS: É importante manter os ovos em temperatura e umidade constantes para aumentar o rendimento. Dependendo do modelo da incubadora, a adição de uma panela cheia de água destilada manterá a umidade estável. Plantas de um sistema de controle de temperatura e umidade adicional/auxiliar que se encaixaria na maioria das incubadoras são desenvolvidas pelos autores e recomendadas. Os detalhes eletrônicos, de hardware e de código dessa unidade de sensor/controle construída internamente são fornecidos em um repositório de dados²⁶. A agitação suave contínua (rotação) dos ovos durante a incubação pode permitir o posicionamento ideal do embrião e, assim, levar a uma maior porcentagem de embriões "operáveis". A agitação também pode trabalhar com incubadoras com essa capacidade e aumentar ainda mais a produtividade.
4. Antes de iniciar o procedimento, prepare o número necessário de nós amarrando um nó overhand solto em uma sutura 10-0 de 1,5 cm de comprimento. Certifique-se de que o nó não é apertado e é grande o suficiente para caber sobre os átrios facilmente durante a operação (Figura 2).
   NOTA: Amarre os nós antes do tempo e mantenha-os em uma solução estéril de campainha de pintinho antes de usar. A operação de amarração de nós requer o uso de duas mãos para operar a pinça de forma síncrona. Por se tratar de uma etapa crítica do protocolo, pode-se confeccionar um modelo de átrio para a prática dessa etapa (Figura 3). Isso melhorará as habilidades de microcirurgia tridimensional necessárias para executar o passo 3.2.3 na Estação 2 (Figura 4).

2. Operações na Estação 1 (Figura 4A)

1. Abra uma janela da extremidade romba do ovo e remova as membranas externa e interna¹⁵ (Figura 5A-D).
2. Abra a casca do ovo rachando suavemente com a extremidade inversa da pinça, com os dedos livres apoiando firmemente o ovo para reduzir a propagação indesejada de rachaduras.
3. Como o LAL é um procedimento longo, conserve a temperatura e a umidade do embrião, pois a frequência cardíaca depende da temperatura. Assim, certifique-se de que a janela inicial do shell seja criada o menor possível, apenas o suficiente para executar as operações.
   NOTA: Nenhum sistema de controle de umidade ou temperatura é empregado durante a operação, mas esses sistemas, se disponíveis, beneficiariam o rendimento. Se possível, o sistema de ar condicionado no laboratório é desligado e o procedimento é realizado na temperatura ambiente (RT) mais alta possível. A otimização da frequência cardíaca embrionária, que pode ser controlada pela temperatura, durante a operação também é recomendada. Alguns laboratórios mantêm a frequência cardíaca em taxas ligeiramente inferiores a 120 bpm através do controle de temperatura durante a operação LAL. Dessa forma, o controle da umidade empregado ao redor da zona cirúrgica aumentaria ainda mais o rendimento. As janelas da casca do ovo são criadas o menor possível, apenas grandes o suficiente para permitir o acesso cirúrgico. Isso também é aplicável à membrana externa espessa, que normalmente é menor do que a casca do ovo apenas na extensão da circunferência do embrião. Estes garantem a manutenção da temperatura e umidade do embrião. Ao abrir uma janela da extremidade romba do ovo, os pequenos fragmentos de casca são limpos para que esses pedaços não danifiquem a integridade vascular da vitelina ou levem a artefatos indesejados. Além disso, outros laboratórios usam tesouras curvas microsserrilhadas para fazer janelas. Além disso, duas larguras de fita Scotch podem ser usadas para estabilizar a casca do ovo para controlar a rachadura.
4. Remova apenas a membrana de vitelina necessária usando micro tesoura (Vídeo Suplementar 1).
5. O desenvolvimento embrionário normal é do lado direito para cima. Uma vez que o embrião esteja livre da membrana vitelina, coloque a pinça com as pontas fechadas sob o segmento dorsal do embrião e vire suavemente o embrião para expor o lado esquerdo (ou seja, configuração do lado esquerdo para cima) (Figura 6A,B; Vídeo Suplementar 2).
6. Certifique-se de que o broto atrial esquerdo esteja agora exposto, mas ainda coberto por um complexo sistema de membrana, tipicamente consistindo de uma dupla camada do pericárdio.
7. Remova as membranas, incluindo as finas, imediatamente ao redor do broto atrial. Esta é outra etapa crítica; realizar a remoção da membrana das membranas grosseiras e progredir para as finas ao redor do broto atrial esquerdo. Reserve as pinças mais finas para remoção da membrana fina (Vídeo Suplementar 3).
8. Durante o processo de remoção da membrana, orientar o embrião em uma posição do lado esquerdo para cima, de modo que a operação de colocação do nó na etapa 3.2 possa ser realizada sem reposicionamento adicional. Para conseguir isso, levante o embrião usando as membranas na etapa 2.6 e pendure-o na casca do ovo, garantindo que o lado esquerdo fique voltado para cima.
   NOTA: Alguns embriões podem estar localizados próximos à periferia da casca do ovo e podem ser difíceis de operar. Ainda assim, esses embriões provavelmente serão orientados para o lado direito e apresentarão comportamento normal, e podem ser incluídos no estudo. Nesses casos, se necessário, o átrio obscurecido pode ser tornado mais acessível limpando-se suavemente a membrana pericárdica com pinça fina #4 e removendo a casca do ovo no sentido inverso (em direção à abertura da casca). Esses embriões também podem ser levantados usando partes das membranas extraembrionárias e fixados na posição desejada, prendendo uma extremidade da membrana (a extremidade da pinça) à casca do ovo, usando sua aderência natural. Além disso, o espaço entre a cabeça e a região da medula espinhal do embrião pode ser expandido com a ajuda de uma pinça para revelar o átrio obscurecido.

3. Operações na Estação 2 (Figura 4B)

1. Sob o estereomicroscópio, posicionar o nó pré-preparado do passo 1.4 próximo ao embrião em local acessível (Figura 6B). O broto atrial já está pronto para ser amarrado (Vídeo Suplementar 4).
2. Recuperar o nó aberto pré-preparado e orientá-lo sobre o botão atrial esquerdo. Para que o LAL funcione, coloque o ovo em uma orientação tridimensional exclusivamente inclinada.
   1. Orientar corretamente o nó para executar o processo de aperto sem danificar os embriões.
   2. Limpe as membranas finas de forma ideal no passo 2.7 para reduzir o efeito de um coração batendo.
   3. Apertar a sutura (Figura 6C). Para essa etapa, praticar com a massa é muito útil. Para embriões falsos, aperte o nó apenas o suficiente para segurar o nó.
3. Em seguida, utilizar a microtesoura para cortar o excesso de extremidades da sutura o mais próximo possível da gema (Vídeo Suplementar 5).
4. Tenha muito cuidado para que as extremidades recém-cortadas da sutura amarrada não estejam em posição de perfurar vasos próximos durante a rotação ou devido aos batimentos cardíacos.
5. Com a pinça, retirar o excesso de sutura cortado no passo 3.3.
6. Por fim, utilizando pinça fechada, devolva o embrião à sua posição original, como na etapa 2.5 (Vídeo Suplementar 6).
7. Depois de completar o processo LAL, cubra o ovo com uma camada dupla de parafilme e incube-o novamente. Um fechamento apertado e estéril dos ovos é fundamental para a sobrevivência, especialmente após 24 h de incubação. Se o acesso visual também for desejado, use cera de parafina com lâminas de vidro.
   NOTA: À medida que o período embrionário inicial é estudado, os ovos são tipicamente incubados por 24-48 h até atingirem aproximadamente HH25 ou HH27. No entanto, não há limite, e etapas posteriores podem ser estudadas, como tentado por outros pesquisadores. Para velocidades de operação rápidas, recomenda-se pelo menos uma equipe de duas pessoas. Uma pessoa deve ser treinada e é responsável pela abertura do ovo, limpeza inicial da membrana, rotação e limpeza da membrana ao redor do broto atrial esquerdo. A outra pessoa é responsável apenas pela preparação inicial do nó, colocação do nó e aperto. A rotação final do embrião pode ser realizada pela Pessoa 1. A operação cirúrgica para um único embrião leva cerca de 4-5 minutos.
8. Antes/depois das operações cirúrgicas, limpe as superfícies de bancada e os instrumentos com etanol. Certificar-se de aplicar solução fresca de ringer de pintinho (NaCl, KCl, CaCl₂ e NaHCO₃)^16,27 nos instrumentos metálicos que tocam os tecidos embrionários.

Resultados

Técnicas avançadas de imagem resolvidas no tempo podem ser empregadas para observar as alterações estruturais e morfológicas decorrentes da intervenção LAL¹⁰. Além disso, amostras de LAL também são passíveis de métodos moleculares e biológicos^19,28. Na Tabela 1, são apresentados os estudos amostrais que utilizaram os resultados do modelo LAL. Nesse contexto, a intervenção LAL foi realizada em embriões de p...

Discussão

Na SHCE, o fluxo sanguíneo é alterado devido a defeitos estruturais, levando a morfologia anormal no lado esquerdo ^4,6. O presente modelo fornece um sistema experimental prático para melhor compreender a progressão da SHCE e pode até mimetizar sua patogênese8. No entanto, estabelecer um modelo animal de SHCE clinicamente equivalente é uma tarefa desafiadora. Além do modelo LAL aviário aqui apresentado, estudos recentes em camundon...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo