Legatura atriale sinistra nell'embrione aviario come modello per l'alterato carico emodinamico durante lo sviluppo vascolare precoce

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo visivo dettagliato per l'esecuzione del modello di legatura atriale sinistra (LAL) nell'embrione aviario. Il modello LAL altera il flusso intracardiaco, che modifica il carico di sollecitazione da taglio della parete, imitando la sindrome del cuore sinistro ipoplasico. Viene presentato un approccio per superare le sfide di questo difficile modello di microchirurgia.

Abstract

Grazie alla sua configurazione ventricolare matura a quattro camere, alla facilità di coltura, all'accesso all'imaging e all'efficienza, l'embrione aviario è un modello animale vertebrato preferito per lo studio dello sviluppo cardiovascolare. Gli studi che mirano a comprendere lo sviluppo normale e la prognosi dei difetti cardiaci congeniti adottano ampiamente questo modello. Vengono introdotte tecniche chirurgiche microscopiche per alterare i normali modelli di carico meccanico in uno specifico momento embrionale e tracciare la cascata molecolare e genetica a valle. Gli interventi meccanici più comuni sono la legatura della vena vitellina sinistra, il bendaggio conotruncale e la legatura atriale sinistra (LAL), che modula la pressione vascolare intramurale e lo stress da taglio della parete dovuto al flusso sanguigno. La LAL, in particolare se eseguita in ovo, è l'intervento più impegnativo, con rese di campione molto ridotte a causa delle operazioni microchirurgiche sequenziali estremamente fini. Nonostante il suo alto rischio, in ovo la LAL è molto preziosa dal punto di vista scientifico in quanto imita la patogenesi della sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS). L'HLHS è una cardiopatia congenita complessa clinicamente rilevante osservata nei neonati umani. Un protocollo dettagliato per l'in ovo LAL è documentato in questo documento. In breve, gli embrioni aviari fecondati sono stati incubati a 37,5 °C e al 60% di umidità costante fino a quando non hanno raggiunto gli stadi di Hamburger-Hamilton (HH) da 20 a 21. I gusci delle uova sono stati aperti e le membrane esterne e interne sono state rimosse. L'embrione è stato ruotato delicatamente per esporre il bulbo atriale sinistro dell'atrio comune. I micro-nodi pre-assemblati da suture di nylon 10-0 sono stati delicatamente posizionati e legati attorno alla gemma atriale sinistra. Infine, l'embrione è stato riportato nella sua posizione originale e LAL è stato completato. I ventricoli normali e quelli strumentati con LAL hanno dimostrato differenze statisticamente significative nella compattazione dei tessuti. Un'efficiente pipeline di generazione di modelli LAL contribuirebbe a studi incentrati sulla manipolazione meccanica e genetica sincronizzata durante lo sviluppo embrionale delle componenti cardiovascolari. Allo stesso modo, questo modello fornirà una fonte di cellule perturbate per la ricerca sulle colture tissutali e la biologia vascolare.

Introduzione

I difetti cardiaci congeniti (CHD) sono disturbi strutturali che si verificano a causa di uno sviluppo embrionale anormale¹. Oltre alle condizioni genetiche, la patogenesi è influenzata da un alterato carico meccanico ^2,3. La sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS), una cardiopatia congenita, provoca un ventricolo/aorta sottosviluppato alla nascita⁴ con un alto tasso di mortalità ^5,6. Nonostante i recenti progressi nella sua gestione clinica, la crescita vascolare e le dinamiche di sviluppo dell'HLHS non sono ancora chiare⁷. Nel normale sviluppo embrionale, l'endocardio e il miocardio del ventricolo sinistro (LV) originano dai progenitori cardiaci man mano che la formazione precoce del tubo cardiaco embrionale progredisce. Viene segnalata la presenza graduale di trabecolazione miocardica, ispessimento degli strati e proliferazione dei cardiomiociti². Per l'HLHS, si osserva un alterato rimodellamento trabecolare e un appiattimento ventricolare sinistro, che contribuiscono ulteriormente all'ipoplasia miocardica dovuta a una migrazione anomala dei cardiomiociti 2,8,9,10

Tra gli organismi modello ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo del cuore e comprendere le condizioni emodinamiche 11, l'embrione aviario è preferito per il suo cuore maturo a quattro camere e la sua facilità di coltura^11,12,13,14. D'altra parte, l'accesso avanzato all'imaging di embrioni di zebrafish e topi transgenici/knockout offre vantaggi distinti^11,12. Per l'embrione aviario sono stati testati vari interventi meccanici che alterano la pressione intramurale e lo stress da taglio della parete nello sviluppo di componenti cardiovascolari. Questi modelli includono la legatura vitellina sinistra, il bendaggio connotruncale¹⁵ e la legatura atriale sinistra (LAL)^11,12,16. Il fenotipo risultante dovuto all'alterato carico meccanico può essere osservato circa 24-48 ore dopo l'intervento chirurgico in studi incentrati sulla prognosi precoce^11,13. L'intervento LAL è una tecnica popolare per restringere il volume funzionale dell'atrio sinistro (LA) posizionando un'ansa di sutura attorno all'apertura atrioventricolare. Allo stesso modo, sono stati eseguiti anche interventi microchirurgici che mirano alla legatura atriale destra (RAL)^17,18. Allo stesso modo, alcuni ricercatori prendono di mira l'appendice atriale sinistra (LAA) utilizzando micro clip per ridurre il volume del LA^19,20. In alcuni studi, un filo di nylon chirurgico viene applicato al nodo atrioventricolare ^19,21. Uno degli interventi utilizzati è il LAL, che può imitare l'HLHS ma è anche il modello più difficile da eseguire, con rese di campione molto ridotte a causa delle operazioni microchirurgiche estremamente fini richieste. Nel nostro laboratorio, la LAL viene eseguita in ovo tra gli stadi 20 e 21 di Hamburger-Hamilton (HH), prima che l'atrio comune sia completamente settato 6,14,22,23. Una sutura chirurgica viene posizionata intorno al LA, che altera i flussi di flusso sanguigno intracardiaco. Nei modelli LAL di HLHS, si osserva un aumento della rigidità della parete ventricolare, angoli alterati della miofibra e una diminuzione delle dimensioni della cavità ventricolare sinistra^14,24.

In questo video articolo, viene fornito un protocollo e un approccio dettagliati per in ovo LAL. In breve, gli embrioni aviari fecondati sono stati incubati per la microchirurgia, il guscio dell'uovo è stato aperto e le membrane esterne e interne sono state ripulite. L'embrione è stato poi ruotato lentamente in modo che il LA fosse accessibile. Una sutura chirurgica in nylon 10-0 è stata legata alla gemma atriale e l'embrione è stato riportato al suo orientamento originale, completando la procedura LAL²⁵. I ventricoli LAL e normali vengono confrontati per la compattazione tissutale e il volume del ventricolo tramite tomografia a coerenza ottica e istologia di base.

Una pipeline di modelli LAL eseguita con successo, come descritto qui, contribuirà agli studi di base incentrati sullo sviluppo embrionale delle componenti cardiovascolari. Questo modello può essere utilizzato anche insieme a manipolazioni genetiche e modalità di imaging avanzate. Allo stesso modo, il modello LAL acuto è una fonte stabile di cellule vascolari malate per esperimenti di coltura tissutale.

Protocollo

Le uova di Livorno bianco fertile sono ottenute da fornitori di fiducia e incubate secondo linee guida approvate dall'università. Gli embrioni di pulcino, stadi da 18 (giorno 3) a 24 (giorno 4) (gli stadi presentati in questo articolo) non sono considerati animali vertebrati vivi dalla direttiva dell'Unione Europea (UE) 2010/63/UE e dalle linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) negli Stati Uniti. Gli embrioni di pulcino sono considerati "animali vivi" dopo il 19° giorno di incubazione secondo le leggi statunitensi, ma non per l'UE. Ogni uovo è etichettato con la data di inizio della schiusa ed è programmato per schiudersi entro e non oltre il 10^° giorno di incubazione. Dopo la schiusa delle uova, i pulcini vengono rimossi dall'incubatrice. Il protocollo viene eseguito in due stazioni operative da banco (Stazione 1 e Stazione 2), concentrandosi su fasi specializzate di generazione del modello.

1. Preparazione prima della microchirurgia

1. Ottenere ovuli fecondati da un centro di sviluppo di vaccini con un grado specifico privo di agenti patogeni (SPF) o tramite un'azienda agricola di fornitori commerciali di fiducia da un fragile corriere di consegna in contenitori di polistirolo secco. Prima dell'incubazione, pulisci delicatamente il guscio d'uovo con salviette prive di lanugine imbevute di etanolo al 70% per rimuovere la contaminazione.
2. Criteri di inclusione/esclusione degli embrioni
   1. Non incubare uova che si sono incrinate o danneggiate durante il trasporto.
   2. Se si nota sanguinamento durante la procedura LAL o dopo la reincubazione, non utilizzare l'embrione.
   3. Non utilizzare embrioni che si sviluppano nella posizione del lato sinistro rivolto verso l'alto, poiché il flusso sanguigno emodinamico può differire dall'orientamento normale.
   4. Embrioni di Dıscard che si sviluppano con difetti congeniti sia nelle procedure pre che post-chirurgiche.
   5. Includi gli embrioni che raggiungono lo stadio di sviluppo mirato nella loro posizione originale, imitando l'HLHS come modello LAL.
3. Incubare le uova fecondate di gallina livornese (Gallus gallus domesticus L .), a punta smussata, fino allo stadio desiderato, tipicamente a HH20-21¹⁵ (37,5 °C, 60% di umidità, 3,5 giorni) (Figura 1).
   NOTA: È importante mantenere le uova a temperatura e umidità costanti per aumentare la resa. A seconda del modello di incubatrice, l'aggiunta di una pentola piena di acqua distillata manterrà stabile l'umidità. Gli autori hanno sviluppato e raccomandato i progetti di un sistema di controllo della temperatura e dell'umidità aggiuntivo/ausiliario che si adatterebbe alla maggior parte delle incubatrici. L'elettronica, l'hardware e i dettagli del codice di questa unità di sensore/controllo costruita internamente sono forniti in un repository di dati²⁶. L'agitazione continua e delicata (rotazione) delle uova durante l'incubazione può consentire un posizionamento ottimale dell'embrione e quindi portare a una maggiore percentuale di embrioni "utilizzabili". L'agitazione può funzionare anche con incubatrici con questa capacità e aumentare ulteriormente la produttività.
4. Prima di iniziare la procedura, preparare il numero di nodi richiesto legando un nodo sciolto a rovescio in una sutura 10-0 lunga 1,5 cm. Assicurarsi che il nodo non sia stretto e che sia abbastanza grande da adattarsi facilmente agli atri durante l'operazione (Figura 2).
   NOTA: Annodare i nodi in anticipo e conservarli in una soluzione sterile per pulcini prima dell'uso. L'operazione di annodatura richiede l'uso di due mani per azionare le pinzette in modo sincrono. Poiché si tratta di una fase critica del protocollo, è possibile creare un modello dell'atrio con lo stucco per esercitarsi in questo passaggio (Figura 3). Ciò migliorerà le competenze di microchirurgia tridimensionale necessarie per eseguire il passaggio 3.2.3 nella Stazione 2 (Figura 4).

2. Operazioni alla stazione 1 (Figura 4A)

1. Aprite una finestra dall'estremità smussata dell'uovo e rimuovete sia la membrana esterna che quella interna¹⁵ (Figura 5A-D).
2. Aprire il guscio d'uovo rompendo delicatamente con l'estremità posteriore delle pinzette, con le dita libere che sostengono saldamente l'uovo per ridurre la propagazione indesiderata delle crepe.
3. Poiché la LAL è una procedura lunga, conserva la temperatura e l'umidità dell'embrione, poiché la frequenza cardiaca dipende dalla temperatura. Pertanto, assicurarsi che la finestra della shell iniziale sia creata il più piccola possibile, quanto basta per eseguire le operazioni.
   NOTA: Durante l'operazione non vengono utilizzati sistemi di controllo dell'umidità o della temperatura, ma questi sistemi, se disponibili, ne trarrebbero vantaggio dalla resa. Se possibile, il sistema di condizionamento dell'aria nel laboratorio viene spento e la procedura viene eseguita alla massima temperatura ambiente (RT) possibile. Si raccomanda inoltre l'ottimizzazione della frequenza cardiaca embrionale, che può essere controllata dalla temperatura, durante l'operazione. Alcuni laboratori mantengono la frequenza cardiaca a frequenze leggermente inferiori a 120 bpm tramite il controllo della temperatura durante il funzionamento LAL. Pertanto, il controllo dell'umidità impiegato intorno alla zona chirurgica aumenterebbe ulteriormente la resa. Le finestre a guscio d'uovo sono create il più piccole possibile, abbastanza grandi da consentire l'accesso chirurgico. Questo vale anche per la spessa membrana esterna, che è tipicamente più piccola del guscio dell'uovo solo nella misura della circonferenza dell'embrione. Questi assicurano il mantenimento della temperatura e dell'umidità dell'embrione. Durante l'apertura di una finestra dall'estremità smussata dell'uovo, i piccoli frammenti di guscio vengono puliti in modo che questi pezzi non danneggino l'integrità vascolare vitellina o portino ad artefatti indesiderati. Inoltre, altri laboratori utilizzano forbici micro-seghettate curve per realizzare finestre. Inoltre, è possibile utilizzare due larghezze di nastro adesivo per stabilizzare il guscio d'uovo per controllare le screpolature.
4. Rimuovere solo la membrana vitellina necessaria utilizzando delle microforbici (Video supplementare 1).
5. Il normale sviluppo embrionale è rivolto verso l'alto. Una volta che l'embrione è libero dalla membrana vitellina, posizionare la pinzetta con le punte chiuse sotto il segmento dorsale dell'embrione e capovolgere delicatamente l'embrione per esporre il lato sinistro (cioè la configurazione con il lato sinistro rivolto verso l'alto) (Figura 6A,B; Video supplementare 2).
6. Assicurarsi che la gemma atriale sinistra sia ora esposta ma ancora coperta da un complesso sistema di membrane, tipicamente costituito da un doppio strato del pericardio.
7. Rimuovere le membrane, comprese quelle sottili, immediatamente intorno alla gemma atriale. Questa è un'altra fase critica; Eseguire la rimozione della membrana dalle membrane grossolane e passare a quelle fini intorno alla gemma atriale sinistra. Riservare le pinzette più fini per la rimozione della membrana sottile (Video supplementare 3).
8. Durante il processo di rimozione della membrana, orientare l'embrione in posizione con il lato sinistro rivolto verso l'alto, in modo che l'operazione di posizionamento del nodo al punto 3.2 possa essere eseguita senza ulteriori riposizionamenti. Per ottenere ciò, sollevare l'embrione utilizzando le membrane nel passaggio 2.6 e appenderlo al guscio dell'uovo, assicurandosi che il lato sinistro sia rivolto verso l'alto.
   NOTA: Alcuni embrioni possono essere localizzati vicino alla periferia del guscio d'uovo e possono essere difficili da operare. Tuttavia, questi embrioni saranno molto probabilmente orientati verso l'alto e mostreranno un comportamento normale, e potranno essere inclusi nello studio. In questi casi, se necessario, l'atrio oscurato può essere reso più accessibile pulendo delicatamente la membrana pericardica con una pinzetta fine #4 e rimuovendo il guscio d'uovo nella direzione inversa (verso l'apertura del guscio). Questi embrioni possono anche essere sollevati utilizzando parti delle membrane extraembrionali e fissati nella posizione desiderata attaccando un'estremità della membrana (l'estremità della pinzetta) al guscio dell'uovo, sfruttando la sua naturale viscosità. Inoltre, lo spazio tra la testa e la regione del midollo spinale dell'embrione può essere ampliato con l'aiuto di una pinzetta per rivelare l'atrio oscurato.

3. Operazioni alla stazione 2 (Figura 4B)

1. Sotto lo stereomicroscopio, posizionare il nodo pre-preparato del punto 1.4 vicino all'embrione in una posizione accessibile (Figura 6B). La gemma atriale è ora pronta per essere legata (Video supplementare 4).
2. Recuperate il nodo aperto pre-preparato e orientatelo sopra la gemma atriale sinistra. Affinché LAL funzioni, posiziona l'uovo con un orientamento tridimensionale inclinato in modo univoco.
   1. Orientare correttamente il nodo per eseguire il processo di serraggio senza danneggiare gli embrioni.
   2. Pulire le membrane sottili in modo ottimale nel passaggio 2.7 per ridurre l'effetto di un cuore che batte.
   3. Stringete la sutura (Figura 6C). Per questo passaggio, esercitarsi con lo stucco è molto utile. Per gli embrioni fittizi, stringi il nodo quel tanto che basta per tenere il nodo.
3. Successivamente, utilizzare le microforbici per tagliare le estremità in eccesso della sutura il più vicino possibile al bocciolo (Video supplementare 5).
4. Fare molta attenzione che le estremità appena tagliate della sutura legata non siano in grado di perforare i vasi vicini durante la rotazione o a causa del battito cardiaco.
5. Usando le pinzette, rimuovere i pezzi di sutura in eccesso tagliati al punto 3.3.
6. Infine, utilizzando una pinzetta chiusa, riportare l'embrione nella sua posizione originale, come nel passaggio 2.5 (Video supplementare 6).
7. Dopo aver completato il processo LAL, coprire l'uovo con un doppio strato di parafilm e incubarlo nuovamente. Una chiusura ermetica e sterile delle uova è fondamentale per la sopravvivenza, soprattutto dopo le 24 ore di incubazione. Se si desidera anche l'accesso visivo, utilizzare la cera di paraffina con vetrini.
   NOTA: Poiché si studia il primo periodo embrionale, le uova vengono in genere incubate per 24-48 ore fino a raggiungere circa HH25 o HH27. Tuttavia, non c'è limite e le fasi successive possono essere studiate, come tentato da altri ricercatori. Per velocità operative elevate, si consiglia una squadra di almeno due persone. Una persona dovrebbe essere addestrata ed è responsabile dell'apertura delle uova, della pulizia iniziale della membrana, della rotazione e della pulizia della membrana intorno alla gemma atriale sinistra. L'altra persona è responsabile solo della preparazione iniziale del nodo, del posizionamento del nodo e del serraggio. La rotazione finale dell'embrione può essere eseguita dalla Persona 1. L'intervento chirurgico per un singolo embrione dura circa 4-5 minuti.
8. Prima/dopo le operazioni chirurgiche, pulire le superfici da banco e gli strumenti con etanolo. Assicurarsi di applicare una soluzione fresca di inanellamento per pulcini (NaCl, KCl, CaCl₂ e NaHCO₃)^16,27 sugli strumenti metallici a contatto con i tessuti embrionali.

Risultati

Tecniche avanzate di imaging risolte nel tempo possono essere impiegate per osservare i cambiamenti strutturali e morfologici dovuti all'intervento LAL¹⁰. Inoltre, i campioni di LAL sono anche suscettibili di metodi molecolari e biologici^19,28. Nella Tabella 1 sono riportati gli studi di esempio che hanno utilizzato i risultati del modello LAL. In questo contesto, l'intervento di LAL è stato eseguito in embrioni di pulcin...

Discussione

Nell'HLHS, il flusso sanguigno è alterato a causa di difetti strutturali, che portano a una morfologia anomala sul lato sinistro ^4,6. Il presente modello fornisce un sistema sperimentale pratico per comprendere meglio la progressione dell'HLHS e può anche imitare la sua patogenesi⁸. Tuttavia, stabilire un modello animale HLHS completamente equivalente dal punto di vista clinico è un compito impegnativo. Oltre al modello LAL aviario qui ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo