La ligature auriculaire gauche chez l’embryon aviaire comme modèle de modification de la charge hémodynamique au cours du développement vasculaire précoce

Résumé

Nous présentons ici un protocole visuel détaillé pour l’exécution du modèle de ligature auriculaire gauche (LAL) dans l’embryon aviaire. Le modèle LAL modifie le flux intracardiaque, ce qui modifie la charge de contrainte de cisaillement de la paroi, imitant le syndrome hypoplasique du cœur gauche. Une approche pour surmonter les défis de ce modèle difficile de microchirurgie est présentée.

Résumé

En raison de sa configuration ventriculaire mature à quatre chambres, de sa facilité de culture, de son accès à l’imagerie et de son efficacité, l’embryon aviaire est un modèle animal vertébré privilégié pour étudier le développement cardiovasculaire. Les études visant à comprendre le développement normal et le pronostic des malformations cardiaques congénitales adoptent largement ce modèle. Des techniques chirurgicales microscopiques sont introduites pour modifier les schémas de charge mécanique normaux à un moment embryonnaire spécifique et suivre la cascade moléculaire et génétique en aval. Les interventions mécaniques les plus courantes sont la ligature de la veine vitelline gauche, la pose de bandes conotruncales et la ligature auriculaire gauche (LAL), modulant la pression vasculaire intra-muros et la contrainte de cisaillement de la paroi due au flux sanguin. La LAL, en particulier si elle est réalisée in ovo, est l’intervention la plus difficile, avec des rendements d’échantillons très faibles en raison des opérations microchirurgicales séquentielles extrêmement fines. Malgré son risque élevé, l’in ovo LAL est très précieux scientifiquement car il imite la pathogenèse du syndrome hypoplasique du cœur gauche (HLHS). Le SHLH est une cardiopathie congénitale complexe cliniquement pertinente observée chez les nouveau-nés humains. Un protocole détaillé pour la LAL in ovo est documenté dans cet article. Brièvement, les embryons aviaires fécondés ont été incubés à 37,5 °C et à 60 % d’humidité constante, généralement jusqu’à ce qu’ils atteignent les stades 20 à 21 de Hamburger-Hamilton (HH). Les coquilles d’œufs ont été ouvertes et les membranes externe et interne ont été retirées. L’embryon a été doucement tourné pour exposer le bulbe auriculaire gauche de l’oreillette commune. Des micro-nœuds pré-assemblés à partir de sutures en nylon 10-0 ont été délicatement positionnés et attachés autour du bourgeon auriculaire gauche. Finalement, l’embryon a été remis dans sa position d’origine et la LAL a été complétée. Les ventricules normaux et instrumentés par LAL ont montré des différences statistiquement significatives dans le compactage des tissus. Un pipeline efficace de génération de modèles LAL contribuerait à des études axées sur les manipulations mécaniques et génétiques synchronisées au cours du développement embryonnaire des composants cardiovasculaires. De même, ce modèle fournira une source de cellules perturbées pour la recherche sur la culture tissulaire et la biologie vasculaire.

Introduction

Les cardiopathies congénitales (CHD) sont des troubles structurels qui surviennent en raison d’un développement embryonnaire anormal¹. En plus des conditions génétiques, la pathogenèse est influencée par une altération de la charge mécanique ^2,3. Le syndrome hypoplasique du cœur gauche (HLHS), une cardiopathie congénitale, se traduit par un ventricule ou une aorte sous-développés à la naissance⁴ avec un taux de mortalité élevé ^5,6. Malgré les progrès récents dans sa prise en charge clinique, la dynamique de croissance et de développement vasculaire du HLHS n’est toujours pas claire⁷. Au cours du développement embryonnaire normal, l’endocarde et le myocarde du ventricule gauche (VG) proviennent de progéniteurs cardiaques au fur et à mesure que la formation embryonnaire précoce du tube cardiaque progresse. La présence progressive d’une trabéculation myocardique, de couches d’épaississement et d’une prolifération des cardiomyocytes est rapportée². Dans le cas du SHHS, une altération du remodelage trabéculaire et un aplatissement du ventricule gauche sont observés, ce qui contribue davantage à l’hypoplasie myocardique due à une migration anormale des cardiomyocytes 2,8,9,10

Parmi les organismes modèles largement utilisés pour étudier le développement du cœur et comprendre les conditions hémodynamiques 11, l’embryon aviaire est préféré en raison de son cœur mature à quatre chambres et de sa facilité de culture^11,12,13,14. D’autre part, l’accès avancé à l’imagerie des embryons de poisson-zèbre et des souris transgéniques/knock-out offre des avantages distincts^11,12. Diverses interventions mécaniques ont été testées pour l’embryon aviaire qui modifient la pression intra-muros et la contrainte de cisaillement de la paroi dans le développement des composants cardiovasculaires. Ces modèles comprennent la ligature vitelline gauche, la ligature conotruncale¹⁵ et la ligature auriculaire gauche (LAL)^11,12,16. Le phénotype résultant de l’altération de la charge mécanique peut être observé environ 24 à 48 h après l’intervention chirurgicale dans les études axées sur le pronostic précoce^11,13. L’intervention LAL est une technique populaire pour rétrécir le volume fonctionnel de l’oreillette gauche (LA) en plaçant une boucle de suture autour de l’ouverture auriculo-ventriculaire. De même, des interventions microchirurgicales ont également été réalisées pour cibler la ligature auriculaire droite (RAL)^17,18. De même, certains chercheurs ciblent l’appendice auriculaire gauche (LAA) à l’aide de micro-clips pour réduire le volume du LA^19,20. Dans certaines études, un fil de nylon chirurgical est appliqué sur le nœud auriculo-ventriculaire^19,21. L’une des interventions utilisées est le LAL, qui peut imiter le HLHS mais qui est aussi le modèle le plus difficile à réaliser, avec des rendements d’échantillons très faibles en raison des opérations microchirurgicales extrêmement fines requises. Dans notre laboratoire, la LAL est réalisée in ovo entre les stades 20 et 21 de Hamburger-Hamilton (HH), avant que l’oreillette commune ne soit complètement cloisonnée 6,14,22,23. Une suture chirurgicale est placée autour de l’AL, ce qui modifie les flux sanguins intracardiaques. Dans les modèles LAL de HLHS, on observe une augmentation de la rigidité de la paroi ventriculaire, une modification des angles des myofibres et une diminution de la taille de la cavité VG^14,24.

Dans cet article vidéo, un protocole et une approche détaillés pour la LAL in ovo sont fournis. Brièvement, les embryons aviaires fécondés ont été incubés pour la microchirurgie, la coquille de l’œuf a été ouverte et les membranes externe et interne ont été dégagées. L’embryon a ensuite été lentement tourné afin que le LA soit accessible. Une suture chirurgicale en nylon 10-0 a été attachée au bourgeon auriculaire et l’embryon a été ramené à son orientation initiale, complétant ainsi la procédure LAL²⁵. Les ventricules LAL et normaux sont comparés pour la compaction tissulaire et le volume du ventricule par tomographie par cohérence optique et histologie de base.

Un pipeline de modèles LAL exécuté avec succès, tel que décrit ici, contribuera à des études fondamentales axées sur le développement embryonnaire des composants cardiovasculaires. Ce modèle peut également être utilisé avec des manipulations génétiques et des modalités d’imagerie avancées. De même, le modèle LAL aiguë est une source stable de cellules vasculaires malades pour les expériences de culture tissulaire.

Protocole

Les œufs blancs fertiles de Livourne sont obtenus auprès de fournisseurs de confiance et incubés selon les directives approuvées par l’université. Les embryons de poussins des stades 18 (jour 3) à 24 (jour 4) (les stades présentés dans cet article) ne sont pas considérés comme des animaux vertébrés vivants par la directive 2010/63/UE de l’Union européenne (UE) et les lignes directrices de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aux États-Unis. Les embryons de poussins sont considérés comme des « animaux vivants » après le 19e jour d’incubation selon les lois américaines, mais pas pour l’UE. Chaque œuf est étiqueté avec la date de début de l’éclosion et l’éclosion est prévue au plus tard le 10e^jour d’incubation. Après l’éclosion des œufs, les poussins sont retirés de l’incubateur. Le protocole est exécuté dans deux stations d’exploitation de paillasse (Station 1 et Station 2), en se concentrant sur des étapes spécialisées de génération de modèles.

1. Préparation avant la microchirurgie

1. Procurez-vous des ovules fécondés soit auprès d’un centre de développement de vaccins avec un grade SPF (Specific Pathogen-Free), soit par l’intermédiaire d’une ferme de fournisseurs commerciaux de confiance par un coursier fragile dans des conteneurs secs en polystyrène. Avant l’incubation, nettoyez délicatement la coquille d’œuf avec des lingettes non pelucheuses imbibées d’éthanol à 70 % pour éliminer toute contamination.
2. Critères d’inclusion/exclusion des embryons
   1. N’incubez pas les œufs qui ont été fissurés ou endommagés pendant le transport.
   2. Si des saignements sont constatés pendant la procédure LAL ou après la réincubation, n’utilisez pas l’embryon.
   3. N’utilisez pas d’embryons se développant en position côté gauche, car le flux sanguin hémodynamique peut différer de l’orientation normale.
   4. Embryons de Dıscard se développant avec des malformations congénitales lors d’interventions pré et post-chirurgicales.
   5. Inclure les embryons qui atteignent le stade ciblé de développement à leur emplacement d’origine, en imitant HLHS comme modèle LAL.
3. Incuber les œufs fécondés de Leghorn (Gallus gallus domesticus L.), extrémité émoussée, jusqu’au stade désiré, généralement à HH20-21¹⁵ (37,5 °C, 60 % d’humidité, 3,5 jours) (figure 1).
   REMARQUE : Il est important de garder les œufs à une température et une humidité constantes pour augmenter le rendement. Selon le modèle d’incubateur, l’ajout d’une casserole remplie d’eau distillée permettra de maintenir une humidité stable. Les plans d’un système de contrôle de la température et de l’humidité supplémentaire/auxiliaire qui conviendrait à la plupart des incubateurs sont élaborés par les auteurs et recommandés. L’électronique, le matériel et les détails du code de cette unité de capteur/contrôle construite en interne sont fournis dans un référentiel de données²⁶. Une légère agitation continue (rotation) des œufs pendant l’incubation peut permettre un positionnement optimal de l’embryon et ainsi conduire à un pourcentage plus élevé d’embryons « opérables ». L’agitation peut également fonctionner avec des incubateurs de cette capacité et augmenter encore la productivité.
4. Avant de commencer la procédure, préparez le nombre de nœuds requis en faisant un nœud plat lâche dans une suture 10-0 de 1,5 cm de long. Assurez-vous que le nœud n’est pas serré et qu’il est suffisamment grand pour s’adapter facilement aux oreillettes pendant l’opération (Figure 2).
   REMARQUE : Attachez les nœuds à l’avance et conservez-les dans une solution stérile de sonnerie de poussin avant utilisation. L’opération de nouage nécessite l’utilisation des deux mains pour actionner la pince à épiler de manière synchrone. Comme il s’agit d’une étape critique du protocole, un modèle de l’oreillette peut être fabriqué à partir de mastic pour pratiquer cette étape (Figure 3). Cela permettra d’améliorer les compétences en microchirurgie tridimensionnelle nécessaires pour effectuer l’étape 3.2.3 à la station 2 (Figure 4).

2. Opérations à la station 1 (figure 4A)

1. Ouvrez une fenêtre à partir de l’extrémité émoussée de l’œuf et retirez les membranes externe et interne¹⁵ (figure 5A-D).
2. Ouvrez la coquille de l’œuf en la fendant doucement avec l’extrémité arrière de la pince à épiler, avec les doigts libres soutenant fermement l’œuf pour réduire la propagation indésirable des fissures.
3. Étant donné que la LAL est une procédure longue, conservez la température et l’humidité de l’embryon, car la fréquence cardiaque dépend de la température. Ainsi, assurez-vous que la fenêtre shell initiale est créée aussi petite que possible, juste assez pour exécuter les opérations.
   REMARQUE : Aucun système de contrôle de l’humidité ou de la température n’est utilisé pendant l’exploitation, mais ces systèmes, s’ils sont disponibles, seraient bénéfiques pour le rendement. Si possible, le système de climatisation du laboratoire est arrêté et la procédure est effectuée à la température ambiante (RT) la plus élevée possible. L’optimisation de la fréquence cardiaque embryonnaire, qui peut être contrôlée par la température, pendant l’opération est également recommandée. Certains laboratoires maintiennent la fréquence cardiaque à des fréquences légèrement inférieures à 120 bpm via le contrôle de la température pendant l’opération LAL. En tant que tel, le contrôle de l’humidité utilisé autour de la zone chirurgicale augmenterait encore le rendement. Les fenêtres en coquille d’œuf sont créées aussi petites que possible, juste assez grandes pour permettre l’accès chirurgical. Cela s’applique également à la membrane externe épaisse, qui n’est généralement plus petite que la coquille de l’œuf que dans la mesure de la circonférence de l’embryon. Ceux-ci assurent le maintien de la température et de l’humidité de l’embryon. Lors de l’ouverture d’une fenêtre à partir de l’extrémité émoussée de l’œuf, les petits fragments de coquille sont nettoyés afin que ces morceaux n’endommagent pas l’intégrité vasculaire vitelline ou n’entraînent pas d’artefacts indésirables. De plus, d’autres laboratoires utilisent des ciseaux micro-dentelés incurvés pour fabriquer des fenêtres. De plus, deux largeurs de ruban adhésif peuvent être utilisées pour stabiliser la coquille d’œuf afin de contrôler la fissuration.
4. Retirez uniquement la membrane vitelline nécessaire à l’aide de micro-ciseaux (vidéo supplémentaire 1).
5. Le développement embryonnaire normal se fait à l’endroit. Une fois que l’embryon est libéré de la membrane vitelline, placez la pince à épiler à pointes fermées sous le segment dorsal de l’embryon et retournez doucement l’embryon pour exposer le côté gauche (c.-à-d. la configuration côté gauche vers le haut) (Figure 6A,B ; Vidéo supplémentaire 2).
6. Assurez-vous que le bourgeon auriculaire gauche est maintenant exposé mais toujours recouvert d’un système membranaire complexe, généralement constitué d’une double couche de péricarde.
7. Retirez les membranes, y compris les plus fines, immédiatement autour du bourgeon auriculaire. Il s’agit d’une autre étape cruciale ; Effectuez l’élimination de la membrane des membranes grossières et progressez vers les membranes fines autour du bourgeon auriculaire gauche. Réserver la pince à épiler la plus fine pour retirer la fine membrane (vidéo supplémentaire 3).
8. Pendant le processus d’ablation de la membrane, orientez l’embryon dans une position à l’endroit gauche, de sorte que l’opération de pose du nœud à l’étape 3.2 puisse être effectuée sans autre repositionnement. Pour ce faire, soulevez l’embryon à l’aide des membranes de l’étape 2.6 et suspendez-le à la coquille de l’œuf, en veillant à ce que le côté gauche soit orienté vers le haut.
   REMARQUE : Certains embryons peuvent être situés près de la périphérie de la coquille d’œuf et peuvent être difficiles à utiliser. Néanmoins, ces embryons seront très probablement orientés à l’endroit et afficheront un comportement normal, et pourront être inclus dans l’étude. Dans ces cas, si nécessaire, l’oreillette obscurcie peut être rendue plus accessible en nettoyant doucement la membrane péricardique avec une pince à épiler fine #4 et en retirant la coquille d’œuf dans le sens inverse (vers l’ouverture de la coquille). Ces embryons peuvent également être soulevés à l’aide de parties des membranes extraembryonnaires et fixés à la position souhaitée en attachant une extrémité de la membrane (l’extrémité de la pince à épiler) à la coquille de l’œuf, en utilisant son adhérence naturelle. De plus, l’espace entre la tête et la moelle épinière de l’embryon peut être élargi à l’aide d’une pince à épiler pour révéler l’oreillette obscurcie.

3. Opérations à la station 2 (figure 4B)

1. Sous le stéréomicroscope, placez le nœud préparé à l’avance de l’étape 1.4 près de l’embryon à un endroit accessible (Figure 6B). Le bourgeon auriculaire est maintenant prêt à être attaché (vidéo supplémentaire 4).
2. Récupérez le nœud ouvert préparé à l’avance et orientez-le sur le bourgeon auriculaire gauche. Pour que le LAL fonctionne, placez l’œuf dans une orientation tridimensionnelle inclinée de manière unique.
   1. Orienter correctement le nœud pour exécuter le processus de serrage sans endommager les embryons.
   2. Éliminez les membranes fines de manière optimale à l’étape 2.7 pour réduire l’effet d’un cœur qui bat.
   3. Serrez la suture (Figure 6C). Pour cette étape, s’entraîner avec le mastic est très utile. Pour les embryons fictifs, serrez le nœud juste assez pour maintenir le nœud.
3. Ensuite, utilisez les micro-ciseaux pour couper les extrémités excédentaires de la suture le plus près possible du bourgeon (vidéo supplémentaire 5).
4. Faites très attention à ce que les extrémités nouvellement coupées de la suture attachée ne soient pas en mesure de perforer les vaisseaux voisins pendant la rotation ou en raison des battements cardiaques.
5. À l’aide de la pince à épiler, retirez les morceaux de suture en excès coupés à l’étape 3.3.
6. Enfin, à l’aide d’une pince à épiler fermée, remettez l’embryon dans sa position initiale, comme à l’étape 2.5 (vidéo supplémentaire 6).
7. Après avoir terminé le processus LAL, recouvrez l’œuf d’une double couche de parafilm et incubez-le à nouveau. Une fermeture hermétique et stérile des œufs est primordiale pour la survie, en particulier après 24 heures d’incubation. Si vous souhaitez également un accès visuel, utilisez de la cire de paraffine avec des lames de verre.
   REMARQUE : Comme la période embryonnaire précoce est étudiée, les œufs sont généralement incubés pendant 24 à 48 h jusqu’à ce qu’ils atteignent environ HH25 ou HH27. Cependant, il n’y a pas de limite, et les stades ultérieurs peuvent être étudiés, comme le tentent d’autres chercheurs. Pour des vitesses de fonctionnement rapides, il est recommandé d’avoir au moins deux personnes en équipe. Une personne doit être formée et est responsable de l’ouverture de l’œuf, du nettoyage initial de la membrane, de la rotation et du nettoyage de la membrane autour du bourgeon auriculaire gauche. L’autre personne n’est responsable que de la préparation initiale du nœud, de la mise en place du nœud et du serrage. La rotation finale de l’embryon peut être effectuée par la personne 1. L’opération chirurgicale d’un seul embryon dure environ 4 à 5 minutes.
8. Avant et après les interventions chirurgicales, nettoyez les surfaces de paillasse et les instruments avec de l’éthanol. Assurez-vous d’appliquer une solution fraîche de sonnerie de poussin (NaCl, KCl, CaCl₂ et NaHCO₃)^16,27 sur les instruments métalliques en contact avec les tissus embryonnaires.

Résultats

Des techniques avancées d’imagerie résolue en temps peuvent être utilisées pour observer les changements structurels et morphologiques dus à l’intervention LAL¹⁰. De plus, les échantillons de LAL se prêtent également à des méthodes moléculaires et biologiques^19,28. Le tableau 1 présente des exemples d’études qui ont utilisé les résultats du modèle LAL. Dans ce contexte, l’intervention LAL a été r?...

Discussion

Dans le HLHS, le flux sanguin est altéré en raison de défauts structurels, conduisant à une morphologie anormale du côté gauche ^4,6. Le présent modèle fournit un système expérimental pratique pour mieux comprendre la progression du HLHS et peut même imiter sa pathogenèse⁸. Cependant, l’établissement d’un modèle animal HLHS entièrement équivalent sur le plan clinique est une tâche difficile. En plus du modèle LAL aviai...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo