Disección y clasificación del desarrollo ovárico en insectos hembra de tipo silvestre

Resumen

El protocolo demuestra un método de disección simple y fácil, adecuado para insectos hembra migratorios de tipo silvestre capturados con trampas de reflectores. Esta técnica puede aclarar significativamente la misma especie comparando ambos tejidos reproductivos, es decir, el saco de apareamiento y el desarrollo ovárico de insectos hembra de tipo salvaje.

Resumen

Las plagas de insectos migratorios plantean serios desafíos para la producción y la seguridad alimentaria en todo el mundo. Las plagas migratorias pueden ser monitoreadas y capturadas usando trampas de reflectores. Una de las técnicas más importantes para la predicción de plagas migratorias es la identificación de las especies migratorias. Sin embargo, en la mayoría de los casos, es difícil obtener la información solo por la apariencia. Por lo tanto, el uso de los conocimientos adquiridos mediante el análisis sistemático del sistema reproductor femenino puede ayudar a comprender la morfología anatómica combinada del saco de apareamiento ovárico y la clasificación del desarrollo ovárico de los insectos migratorios de tipo silvestre capturados con trampas de reflectores. Para demostrar la aplicabilidad de este método, se evaluó directamente el estado de desarrollo ovárico y las etapas de desarrollo del grano de huevo en Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura y Spodoptera exigua para la anatomía ovárica, y se estudiaron los sacos de apareamiento ovárico en Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae y Spodoptera exigua, para explorar sus relaciones. Este trabajo muestra el método de disección específico para predecir insectos migratorios de tipo silvestre, comparando el sistema reproductivo único de diferentes insectos migratorios. Luego, ambos tejidos, es decir, el ovario y los sacos de apareamiento, se investigaron más a fondo. Este método ayuda a predecir la dinámica y el desarrollo estructural de los sistemas reproductivos en insectos migratorios hembra de tipo silvestre.

Introducción

La migración de insectos juega un papel vital en la dinámica poblacional de la distribución mundial de insectos como Helicoverpa armigera - el gusano de la cápsula del algodón, Mythimna separada - el gusano cogollero oriental, Spodoptera litura - la oruga de la malanga, Spodoptera exigua - el gusano cogollero de la remolacha, que han sido reportados como plagas graves en China 1,2,3,4 . Las largas distancias de viaje, los movimientos estacionales, la alta fecundidad de las plagas migratorias y los factores ecológicos han traído grandes dificultades en la predicción, pronóstico y control de estas plagas⁵. El monitoreo de la migración de plagas es necesario para revelar la adaptabilidad y los cambios de comportamiento que facilitan la aparición de plagas migratorias de acuerdo con los cambios o ciclos climáticos⁶. Para mantener su crecimiento, reproducción y supervivencia, los insectos han adquirido adaptabilidad secuencial durante la evolución; Esta serie de vida adaptativa ha generado muchos cambios en el sistema reproductivo, como la estrategia migratoria que conduce al control del desarrollo ovárico en el largo proceso migratorio.

El desarrollo ovárico es común en las plagas migratorias, lo que afecta el crecimiento de su población⁷. Por lo tanto, el desarrollo ovárico ha sido un tema candente en la investigación de plagas migratorias durante mucho tiempo. Una serie de estudios han dado lugar a varios indicadores de desarrollo ovárico y estrategias de clasificación. Hasta ahora, se han utilizado varios métodos para analizar el desarrollo de los ovarios, por ejemplo, Loxostege sticticalis, el desarrollo del ovario de la polilla de la pradera, que incluye la etapa inicial de emplumado, el período de desove temprano, el período de desove y el final de la oviposición⁸. Algunos investigadores dividen los niveles ováricos en función del desarrollo del color de la yema en plagas migratorias de lepidópteros, como S. exigua - el gusano cogollero de la remolacha, Pseudaletia unipuncta - el gusano cogollero verdadero, y Cnaphalocrocis medinalis - la plegadora de hojas de arroz, etc.9,10,11,12. En estudios previos, los niveles de desarrollo ovárico de plagas, como el gusano del algodón y la carraca de la hoja de arroz, se dividieron en cinco etapas: etapa de depósito de yema, etapa de madurez del grano de huevo, espera madura para el nacimiento, período de ovogénesis máxima y etapa final de desove^13,14. El desarrollo ovárico del barrenador europeo del maíz se dividió en seis etapas de desarrollo: etapa de deposición de la yema, maduración del huevo, disposición previa a los huevos, etapa de desove pico y etapa de desove final¹⁵.

Además, los insectos del mismo género tienen diferentes etapas de desarrollo, como los niveles de desarrollo ovárico de Spodoptera frugiperda , el gusano cogollero, que se dividen en cuatro niveles: etapa de deposición de la yema, espera madura para el parto, pico de ovipositividad y etapa final de desove¹⁶. Por otro lado, el desarrollo ovárico en Spodoptera exigua - la polilla de la remolacha - tiene cinco niveles: transparente, vitelogénesis, maduración de huevos, liberación de huevos y niveles de puesta tardía^{de huevos 17}.

Los estudios anteriores solo pueden clasificar el desarrollo de niveles de desarrollo ovárico único a múltiples utilizando la madurez del color de la yema, la oviposición y el desarrollo de los huevos, pero la clasificación no se puede hacer en función de la anatomía del sistema reproductivo. El desarrollo de un ovario basado en la anatomía de la morfogénesis es un área menos estudiada. Aquí, el método de disección fue diseñado para predecir hembras migratorias en la población utilizando dos tipos de tejido ovárico, para elaborar su dinámica reproductiva basada en la morfogénesis anatómica de -etapa de desarrollo ovárico y saco de apareamiento- proporcionando evidencia directa para distinguir a las hembras migratorias de tipo silvestre.

Algunos estudios han encontrado que las especies migratorias de insectos Noctuidae fueron capturadas con frecuencia por reflectores¹⁸. El ovario de la mayoría de las especies migratorias de insectos Noctuidae se encuentra en las primeras etapas de desarrollo durante la etapa inicial de la migración y el nivel ovárico aumenta con el progreso migratorio. En este estudio se describe el método de disección para grados de desarrollo ovárico, para estudiar los dos tejidos reproductivos de diferentes plagas de la población femenina, captados por luz de búsqueda. Este método no solo avanza en la investigación para comprender la dinámica migratoria, sino que también facilita la clasificación de insectos, el estudio de la fisiología de los insectos, la predicción de plagas y el pronóstico de especies de plagas femeninas.

Protocolo

NOTA: Preste atención a las medidas de seguridad antes de atrapar insectos migratorios de tipo silvestre, se sugiere usar equipo de seguridad (guantes, camisas de manga larga y gafas). Además, apague la trampa cuando no esté en uso para evitar otros peligros de seguridad y sobrecalentar la luz. Es importante seguir los protocolos de seguridad antes de la disección, como el uso de guantes, gafas y bata de laboratorio para evitar la exposición a fluidos corporales y productos químicos.

1. Captura de insectos migratorios

1. Comience este protocolo atrapando insectos con la lámpara del reflector. En este protocolo, la fuente del insecto de prueba es el distrito de Jiyang, ciudad de Jinan, provincia de Shandong, China (36.977088° N, 116.982747° E).
2. Utilice el cuerpo principal de la lámpara del reflector, que está hecho de acero no oxidado, la caja, que es un cuerpo rectangular, y el faro halógeno tipo GT75, con una potencia de 1000 W. Coloque el faro en el medio como fuente de luz.
3. Coloque un canal de recolección de insectos en forma de embudo en el interior y en la parte inferior de la luz, coloque una caja para la recolección de insectos con un diámetro de 5 cm, seguida de una bolsa de red de recolección de insectos de 60 pedidos (0,5 m x 0,5 m), que se usa para recolectar insectos atrapados por la luz. La proyección conocida de la luz está a unos 500 m sobre el suelo.
4. Este protocolo hace énfasis en la dinámica migratoria de las hembras silvestres y el desarrollo de los ovarios; por lo tanto, recolectar diferentes especies de insectos (aquí la recolección se realizó de abril a agosto, durante 2021 a 2022). Evite recolectar insectos de tamaño pequeño y heridos, seleccione plagas grandes de tamaño similar para este experimento.

2. Preparación de insectos

1. Transfiera todos los insectos recolectados de la bolsa de red (0,5 m) a la jaula de red (30 cm x 30 cm) y luego proporcione una placa de Petri que contenga una solución esterilizada de agua con miel al 10% (la alimentación es opcional). Colocar la jaula a 27 ± 2 °C, 65% ± 12% de humedad relativa y mantener en oscuridad durante 8-12 h.
2. Seleccione hembras de tipo salvaje que hayan volado dentro de la jaula el mismo día, transfiéralas con cuidado a los tubos de viales individuales y cierre cada tubo con una tapa de algodón. Evite la manipulación directa, que podría dañar o lesionar a la plaga debido a una presión excesiva.
   NOTA: Todas las hembras de tipo salvaje fueron capturadas durante la noche y la disección se realizó durante el día. Por lo tanto, cada experimento se realizó en un día.

3. Preparación para el método de parálisis de insectos (Figura 1)

1. Coloque la plaga hembra seleccionada individualmente en un tubo de vial para moscas en el medio y anestesiar a la hembra con gas CO₂ sosteniendo la aguja de la pistola de cerbatana para causar una parálisis leve. Para confirmar si la plaga está paralizada o no, empuje suavemente o toque la plaga con un cepillo suave. La falta de respuesta a los estímulos blandos y la inmovilidad indican una parálisis exitosa.
   NOTA: La baja temperatura (-20 °C) también se puede utilizar como una técnica alternativa para paralizar insectos.

4. Disección de insectos

1. Coloque la hembra recién paralizada en la placa de Petri de disección que contiene etanol absoluto (10 ml). Para evitar la influencia de los pelos de escamas y el polvo de las alas durante la disección, infiltre el insecto vivo o paralizado con alcohol absoluto y enjuague con agua limpia.
2. Separe las alas dorsales de la unión del cuerpo del tórax y el abdomen, utilizando dos pares de fórceps.
3. Transfiera el abdomen a una nueva placa de Petri desechable, que contenga una cantidad adecuada de agua (2-5 mm de profundidad), y pegue suavemente el exoesqueleto abdominal a lo largo de la línea ventral dorsal desde la boca puntiaguda hasta la cola, utilizando pinzas de disección. Repita los mismos pasos en el otro lado y luego póngalo en agua limpia para dispersar los tejidos intactos.
4. Retire con cuidado los tejidos grasos de la epidermis con fórceps y tire y suelte suavemente los ovarios.
5. Use pinzas de disección para eliminar suavemente las partículas de grasa y otros órganos alrededor de los ovarios. Generalmente, los ovarios de la plaga se pliegan principalmente hacia adentro a ambos lados del abdomen, intentan operar en un ambiente líquido mientras despliegan los ovarios, y lentamente despegan el saco de apareamiento desde el medio y recogen las partículas de grasa adheridas a las trompas ováricas.
6. Sujete suavemente el ovario y el saco de acoplamiento desde el extremo posterior vertical y despliéguelo con cuidado hacia abajo. Para evitar daños durante el desdoblado, transfiera el ovario a una placa de Petri nueva o limpia que contenga agua. Sostenga la punta del ovario y despliegue el ovario hacia adentro; Realice este paso con cuidado para evitar daños en los ovarios.

5. Análisis de datos para la anatomía de los tejidos ováricos

1. En este paso se evalúa el desarrollo de los huevos de cada insecto, siguiendo el color y el tamaño de los huevos, para juzgar su madurez. Luego, juzgue el grado ovárico de acuerdo con el desarrollo del óvulo.
   NOTA: La división de varios niveles de desarrollo ovárico se divide principalmente, ya sea antes de la puesta de huevos o el desarrollo de huevos con el nivel de precipitación de la yema. El desarrollo del grano de huevo de los insectos se divide en etapas para mayor claridad, como la etapa de ocurrencia de la yema, la etapa de madurez de la yema y la etapa de muerte de la yema. La madurez del grano de huevo depende de la plenitud, el color y el tamaño del huevo para juzgar su madurez.
2. Después de la disección, asegúrese de separar los tejidos de los sacos de apareamiento de las hembras de los ovarios intactos y observe la morfología para distinguir la especie, ya que la anatomía de la mayoría de los sacos de apareamiento varía de una especie a otra. Por lo tanto, use sacos de apareamiento para distinguir entre especies.
3. En este paso, evalúe la anatomía ovárica y analice la clasificación del desarrollo ovárico. Divida los tejidos ováricos en cinco grados (grado 1 a grado 5).
   1. Busque los siguientes cambios y estructura para organizar el tejido: primer grado (1) es una etapa temprana de desarrollo (lechoso transparente), abdomen lleno, cuerpo blando, graso, esponjoso, de color claro, difícil de pelar. El segundo grado (2) es la etapa de depósito de la yema y el grado de los ovarios por separado si es necesario después de observar el canal ovárico más largo y grueso. El tercer grado (3) tiene menos cuerpos grasos y solo unos pocos gránulos adheridos al ovario. El cuarto grado (4) parece menos elástico y fácil de romper, y algunos huevos pueden estar presentes en el medio de la trompa uterina. El quinto grado (5) es fácil de identificar con menos o ningún cuerpo graso, ovarios atróficos y frágiles.
4. Captura imágenes con una cámara digital según las necesidades experimentales.

Resultados

Desarrollo de los huevos
El protocolo anterior se aplicó para analizar el desarrollo de los óvulos en el ovario. Para este propósito, en primer lugar, los huevos se clasificaron generalmente en cuatro etapas para distinguir la etapa temprana y madura del desarrollo del huevo entre todas las especies, por ejemplo, el gusano cogollero, el gusano cogollero, la oruga del taro y la polilla de la remolacha. Aquí, se observó la etapa temprana de emplumado (etapa transparente de color blanco lechoso).

Discusión

Los métodos de análisis ovárico se utilizan de forma rutinaria en la protección de las plantas, para dilucidar el movimiento del vuelo y la población de insectos para pronosticar 19,20,21 y para profundizar en las variaciones fisiológicas de los insectos. Se ha observado que la migración única y la rápida capacidad de dispersión de las plagas agrícolas comunes, como el gusano cogollero, el gusano cogollero, la oruga d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Canon ( China ) co., LTD	EOS 800D
Dropper	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Ethanol absolute (99.7%)	Shanghai Hushi Laboratory Equipmentco., LTD
Forceps	Vetus Tools co., LTD	ST-14
GT75 type halogen headlamp (1000 W)	Shanghai Yadeng Industry co., LTD
Helicoverpa armigera, Mythimna separate, Spodoptera litura, Spodoptera exigua	Jiyang district, Jinan city, Shandong province, China
Measuring cylinder, beaker, flask	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Net bag	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		0.5 m
Net cages	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		30 cm x 30 cm
Petri dishes	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		60 mm diameter