Dissecção e classificação do desenvolvimento ovariano em fêmeas selvagens

Resumo

O protocolo demonstra um método de dissecação simples e fácil, adequado para fêmeas de insetos migratórios selvagens capturadas com armadilhas de holofotes. Esta técnica pode esclarecer significativamente a mesma espécie comparando ambos os tecidos reprodutivos, ou seja, o saco de acasalamento e o desenvolvimento ovariano de fêmeas de insetos selvagens.

Resumo

As pragas de insetos migratórios representam sérios desafios para a produção e segurança alimentar em todo o mundo. As pragas migratórias podem ser monitoradas e capturadas por meio de armadilhas para holofotes. Uma das técnicas mais importantes para a previsão de pragas migratórias é a identificação das espécies migratórias. No entanto, na maioria dos casos, é difícil obter a informação apenas pela aparência. Portanto, o uso do conhecimento adquirido pela análise sistemática do sistema reprodutor feminino pode ajudar a entender a morfologia anatômica combinada do saco reprodutivo ovariano e a graduação do desenvolvimento ovariano de insetos migratórios selvagens capturados com armadilhas de holofotes. Para demonstrar a aplicabilidade deste método, o estado de desenvolvimento ovariano e os estágios de desenvolvimento dos grãos de ovo foram avaliados diretamente em Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura e Spodoptera exigua para a anatomia ovariana, e os sacos reprodutivos ovarianos foram estudados em Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae e Spodoptera exigua, para explorar suas relações. Este trabalho mostra o método de dissecção específico para prever insetos migratórios selvagens, comparando o sistema reprodutivo único de diferentes insetos migratórios. Em seguida, ambos os tecidos, ou seja, o ovário e os sacos de acasalamento, foram investigados mais detalhadamente. Este método ajuda a prever a dinâmica e o desenvolvimento estrutural dos sistemas reprodutivos em fêmeas de insetos migratórios selvagens.

Introdução

A migração de insetos desempenha um papel vital na dinâmica populacional da distribuição global de insetos para insetos como Helicoverpa armigera - a lagarta-do-algodoeiro, Mythimna separada - lagarta-do-cartucho oriental, Spodoptera litura - lagarta-do-taro, Spodoptera exigua - lagarta-do-cartucho da beterraba, que têm sido relatados como pragas graves na China 1,2,3,4 . As longas distâncias percorridas, os movimentos sazonais, a alta fecundidade das pragas migratórias e os fatores ecológicos têm trazido grandes dificuldades na previsão, previsão e controle dessas pragas⁵. O monitoramento da migração de pragas é necessário para revelar a adaptabilidade e as mudanças comportamentais que facilitam as pragas migratórias de acordo com as mudanças ou ciclos climáticos⁶. Para sustentar seu crescimento, reprodução e sobrevivência, os insetos adquiriram adaptabilidade sequencial durante a evolução; Essa série de vida adaptativa tem gerado muitas mudanças no sistema reprodutivo, como a estratégia migratória que leva ao controle do desenvolvimento ovariano no longo processo migratório.

O desenvolvimento ovariano é comum em pragas migratórias, o que afeta o crescimento de sua população⁷. Portanto, o desenvolvimento ovariano tem sido um tópico quente de pesquisa de pragas migratórias por um longo tempo. Uma série de estudos levou a vários indicadores de desenvolvimento ovariano e estratégias de classificação. Até o momento, vários métodos têm sido utilizados para analisar o desenvolvimento ovariano, por exemplo, Loxostege sticticalis - a traça do prado - desenvolvimento do ovário que inclui o estágio inicial de penas, o período inicial de desova, o período de desova e o final da oviposição⁸. Alguns pesquisadores dividem os níveis ovarianos com base no desenvolvimento da cor da gema em pragas migratórias de lepidópteros, como S. exigua - lagarta-do-cartucho da beterraba, Pseudaletia unipuncta - lagarta-do-cartucho verdadeira, e Cnaphalocrocis medinalis- pasta-folha do arroz, etc.9,10,11,12. Em estudos anteriores, os níveis de desenvolvimento ovariano para pragas, como a lagarta-do-algodoeiro e o rolo-do-arroz, foram divididos em cinco estágios: estádio de deposição da gema, estádio de maturação do grão do ovo, espera madura para o nascimento, período de pico da ovogênese e fase final da desova^13,14. O desenvolvimento ovariano da broca-do-milho europeu foi dividido em seis estágios de desenvolvimento: estádio de deposição da gema, maturação dos ovos, disposição pré-ovos, fase de pico de desova e estágio final de desova¹⁵.

Além disso, insetos do mesmo gênero apresentam diferentes estágios de desenvolvimento, como os níveis de desenvolvimento ovariano de Spodoptera frugiperda - lagarta-do-cartucho - que cai em quatro níveis: estágio de deposição de gema, espera madura para o parto, pico de positividade da ovipositividade e estágio final de desova¹⁶. Por outro lado, o desenvolvimento ovariano em Spodoptera exigua - a mariposa da beterraba - apresenta cinco níveis: transparente, vitelogênese, maturação dos ovos, liberação de ovos e níveis de oviposição tardia¹⁷.

Estudos anteriores só podem classificar o desenvolvimento de níveis de desenvolvimento ovariano único a múltiplo usando a maturidade de cor da gema, oviposição e desenvolvimento do ovo, mas a classificação não pode ser feita com base na anatomia do sistema reprodutivo. O desenvolvimento de um ovário baseado na anatomia da morfogênese é uma área menos estudada. Aqui, o método de dissecção foi projetado para prever fêmeas migratórias na população usando dois tipos de tecido ovariano, para elaborar sua dinâmica reprodutiva com base na morfogênese anatômica do estágio de desenvolvimento ovariano e saco de acasalamento, fornecendo evidências diretas para distinguir fêmeas migratórias selvagens.

Alguns estudos constataram que espécies de insetos Noctuidae migratórios eram frequentemente capturadas por holofotes¹⁸. O ovário da maioria das espécies de insetos Noctuidae migratórios está nos estágios iniciais de desenvolvimento durante o estágio inicial da migração e o nível ovariano aumenta com o progresso migratório. Neste estudo, descreve-se o método de dissecção para graus de desenvolvimento ovariano, para estudar os dois tecidos reprodutivos de diferentes populações femininas-praga, capturadas por luz de busca. Este método não só avança a pesquisa para entender a dinâmica migratória, mas também facilidades na classificação de insetos, estudo de fisiologia de insetos, previsão de pragas e previsão de espécies de pragas femininas.

Protocolo

NOTA: Preste atenção às medidas de segurança antes de capturar insetos migratórios selvagens, sugere-se o uso de equipamentos de segurança (luvas, camisas de manga comprida e óculos). Além disso, desligue a armadilha quando não estiver em uso para evitar outros riscos de segurança e superaquecimento da luz. É importante seguir os protocolos de segurança antes da dissecção, como o uso de luvas, óculos e jaleco para evitar a exposição a fluidos corporais e produtos químicos.

1. Captura de insetos migrantes

1. Comece este protocolo prendendo insetos usando a lâmpada do holofote. Neste protocolo, a fonte de inseto de teste é o distrito de Jiyang, cidade de Jinan, província de Shandong, China (36,977088° N, 116,982747° E).
2. Use o corpo principal da lâmpada do holofote, que é feito de aço não enferrujado, a caixa, que é um corpo retangular, e o farol halógeno tipo GT75, com potência de 1000 W. Coloque o farol no meio como fonte de luz.
3. Coloque um canal coletor de insetos em forma de funil dentro e no fundo da luz, coloque uma caixa para coleta de insetos com um diâmetro de 5 cm, seguida por um saco de rede de coleta de insetos de 60 ordens (0,5 m x 0,5 m), que é usado para coletar insetos presos pela luz. A projeção conhecida da luz está a cerca de 500 m acima do solo.
4. Este protocolo enfatiza a dinâmica migratória de fêmeas selvagens e o desenvolvimento dos ovários; portanto, colete diferentes espécies de insetos (aqui a coleta foi feita de abril a agosto, durante 2021 a 2022). Evite coletar insetos de tamanho pequeno e feridos, selecione pragas grandes de tamanho semelhante para este experimento.

2. Preparação de insetos

1. Transfira todos os insetos coletados do saco de rede (0,5 m) para a gaiola de rede (30 cm x 30 cm) e, em seguida, forneça uma placa de Petri contendo solução esterilizada de água de mel a 10% (a alimentação é opcional). Colocar a gaiola a 27 ± 2 °C, 65% ± 12% de humidade relativa, e manter no escuro durante 8-12 h.
2. Selecione fêmeas selvagens que voaram dentro da gaiola no mesmo dia, transfira-as cuidadosamente para os tubos de frascos individuais e feche cada tubo com uma tampa de algodão. Evite o manuseio direto, que pode danificar ou ferir a praga devido à pressão excessiva.
   NOTA: Todas as fêmeas selvagens foram capturadas no período noturno e a dissecção foi realizada durante o dia. Assim, cada experimento foi realizado dentro de um dia.

3. Preparação para o método de paralisação de insetos (Figura 1)

1. Coloque a praga fêmea selecionada individualmente em um tubo de frasco de mosca no meio e anestesiar a fêmea usando gás CO₂ segurando a agulha da zarabatana para causar paralisia leve. Para confirmar se a praga está paralisada ou não, cutuque suavemente ou toque na praga usando uma escova macia. Nenhuma resposta a estímulos leves e imobilidade indica uma paralisia bem-sucedida.
   NOTA: A baixa temperatura (-20 °C) também pode ser usada como uma técnica alternativa para paralisar insetos.

4. Dissecção de insetos

1. Colocar fêmea recém-paralisada na placa de Petri dissecante contendo etanol absoluto (10 mL). Para evitar a influência de pelos de escamas e pó de asas durante a dissecção, infiltre o inseto vivo ou paralisado com álcool absoluto e enxágue em água limpa.
2. Separe as asas dorsais da junção do corpo do tórax e abdômen, utilizando dois pares de pinças.
3. Transfira o abdome para uma nova placa de Petri descartável, contendo uma quantidade adequada de água (2-5 mm de profundidade), e descasque suavemente o exoesqueleto abdominal ao longo da linha ventral dorsal da boca pontiaguda até a cauda, usando pinça dissecante. Repita os mesmos passos do outro lado e, em seguida, coloque-o em água limpa para dispersar os tecidos intactos.
4. Descasque cuidadosamente os tecidos gordurosos da epiderme usando pinças e puxe e solte suavemente os ovários.
5. Use pinças dissecantes para remover suavemente partículas de gordura e outros órgãos ao redor dos ovários. Geralmente, os ovários da praga são principalmente dobrados para dentro em ambos os lados do abdômen, tente operar em um ambiente líquido enquanto desdobra os ovários, e lentamente descascar o saco de acasalamento do meio, e escolher as partículas de gordura ligadas às trompas ovarianas.
6. Segure suavemente o ovário e o saco de acasalamento da extremidade posterior vertical e desdobre-o cuidadosamente para baixo. Para evitar danos durante o desdobramento, transfira o ovário para uma placa de Petri nova ou limpa contendo água. Segure a ponta do ovário e desdobre o ovário para dentro; Execute cuidadosamente esta etapa para evitar danos aos ovaríolos.

5. Análise de dados de anatomia dos tecidos ovarianos

1. Nesta etapa avaliar o desenvolvimento dos ovos para cada inseto, seguindo a cor e o tamanho dos ovos, para julgar sua maturidade. Em seguida, julgue o grau ovariano de acordo com o desenvolvimento do óvulo.
   NOTA: A divisão dos vários níveis de desenvolvimento ovariano é dividida principalmente, seja antes da postura ou do desenvolvimento dos ovos com o nível de precipitação da gema. O desenvolvimento dos grãos de ovos dos insetos é dividido em estágios para maior clareza, tais como, estágio de ocorrência da gema, estágio de maturidade da gema e estágio de morte da gema. A maturidade do grão de ovo depende da plenitude, cor e tamanho do ovo para julgar sua maturação.
2. Após a dissecção, certifique-se de separar os tecidos dos sacos de acasalamento fêmeas dos ovários intactos e observe a morfologia para distinguir a espécie, pois a anatomia da maioria dos sacos de acasalamento varia de espécie para espécie. Portanto, use sacos de acasalamento para distinguir entre as espécies.
3. Nesta etapa, avalie a anatomia ovariana e analise a graduação do desenvolvimento ovariano. Divida os tecidos ovarianos em cinco graus (grau 1 a grau 5).
   1. Procure as seguintes alterações e estrutura para organizar o tecido: primeiro grau (1) é um estágio inicial de desenvolvimento (transparente leitoso), abdômen cheio, macio, corpo gorduroso fofo, cor clara, difícil de descascar. O segundo grau (2) é o estágio de deposição da gema e gradua os ovários separadamente, se necessário, após a observação do canal ovariano mais longo e espesso. O terceiro grau (3) tem menos corpos gordurosos e apenas alguns grânulos aderidos ao ovário. O quarto grau (4) parece menos elástico e fácil de quebrar, e alguns óvulos podem estar presentes no meio da tuba uterina. A quinta série (5) é de fácil identificação, com corpos menos ou nenhum corpo gorduroso, ovários atróficos e frágeis.
4. Capture imagens usando uma câmera digital conforme a necessidade experimental.

Resultados

Desenvolvimento dos ovos
O protocolo acima foi aplicado para analisar o desenvolvimento dos óvulos no ovário. Para este propósito, em primeiro lugar, os ovos foram classificados geralmente em quatro estágios para distinguir o estágio inicial e maduro do desenvolvimento dos ovos entre todas as espécies, por exemplo, lagarta-do-cartucho, lagarta-do-cartucho e mariposa-da-beterraba. Aqui, o estágio inicial de penas (estágio branco leitoso transparente) foi observado. A Figura...

Discussão

Métodos de análise ovariana são rotineiramente utilizados na proteção de plantas, para elucidar o movimento de voo e população de insetos para previsão 19,20,21 e para elaborar as variações fisiológicas em insetos. Tem-se notado que a migração única e a rápida capacidade de dispersão de pragas agrícolas comuns, como a lagarta-do-cartucho, a lagarta-do-cartucho, a lagarta-do-taro e a traça-da-beterraba, dificult...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Canon ( China ) co., LTD	EOS 800D
Dropper	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Ethanol absolute (99.7%)	Shanghai Hushi Laboratory Equipmentco., LTD
Forceps	Vetus Tools co., LTD	ST-14
GT75 type halogen headlamp (1000 W)	Shanghai Yadeng Industry co., LTD
Helicoverpa armigera, Mythimna separate, Spodoptera litura, Spodoptera exigua	Jiyang district, Jinan city, Shandong province, China
Measuring cylinder, beaker, flask	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Net bag	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		0.5 m
Net cages	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		30 cm x 30 cm
Petri dishes	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		60 mm diameter