Dissection et classification du développement ovarien chez les insectes femelles de type sauvage

Résumé

Le protocole démontre une méthode de dissection simple et facile, adaptée aux insectes femelles migrateurs de type sauvage capturés avec des pièges à projecteurs. Cette technique permet d’éclaircir de manière significative la même espèce en comparant les deux tissus reproducteurs, à savoir le sac d’accouplement et le développement ovarien d’insectes femelles de type sauvage.

Résumé

Les insectes migrateurs nuisibles posent de sérieux défis à la production alimentaire et à la sécurité dans le monde entier. Les ravageurs migrateurs peuvent être surveillés et capturés à l’aide de pièges à projecteurs. L’une des techniques les plus importantes pour la prévision des ravageurs migrateurs consiste à identifier les espèces migratrices. Cependant, dans la plupart des cas, il est difficile d’obtenir l’information simplement par l’apparence. Par conséquent, l’utilisation des connaissances acquises par l’analyse systématique de l’appareil reproducteur femelle peut aider à comprendre la morphologie anatomique combinée du sac d’accouplement ovarien et de la classification du développement ovarien des insectes migrateurs de type sauvage capturés avec des pièges à projecteurs. Pour démontrer l’applicabilité de cette méthode, l’état de développement ovarien et les stades de développement des grains d’œuf ont été directement évalués chez Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura et Spodoptera exigua pour l’anatomie ovarienne, et les sacs d’accouplement ovariens ont été étudiés chez Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae et Spodoptera exigua, pour explorer leurs relations. Ce travail montre la méthode de dissection spécifique pour prédire les insectes migrateurs de type sauvage, en comparant le système reproducteur unique de différents insectes migrateurs. Ensuite, les deux tissus, à savoir l’ovaire et les sacs d’accouplement, ont été étudiés plus en détail. Cette méthode permet de prédire la dynamique et le développement structurel des systèmes reproducteurs chez les insectes migrateurs femelles de type sauvage.

Introduction

La migration des insectes joue un rôle essentiel dans la dynamique des populations de la distribution mondiale des insectes comme Helicoverpa armigera - le ver de la capsule du cotonnier, Mythimna separate - la chenille légionnaire orientale, Spodoptera litura - la chenille du taro, Spodoptera exigua - la chenille légionnaire de la betterave, qui ont été signalés comme des ravageurs graves en Chine 1,2,3,4 . Les longues distances parcourues, les déplacements saisonniers, la forte fécondité des ravageurs migrateurs et les facteurs écologiques ont rendu très difficiles la prévision, la prévision et la lutte contre ces ravageurs⁵. La surveillance de la migration des ravageurs est nécessaire pour révéler l’adaptabilité et les changements de comportement qui facilitent les ravageurs migrateurs en fonction des changements climatiques ou des cycles⁶. Pour soutenir leur croissance, leur reproduction et leur survie, les insectes ont acquis une adaptabilité séquentielle au cours de l’évolution ; Cette série de vie adaptative a généré de nombreux changements dans le système reproducteur, tels que la stratégie migratoire conduisant au contrôle du développement ovarien dans le long processus migratoire.

Le développement ovarien est fréquent chez les ravageurs migrateurs, ce qui affecte la croissance de leur population⁷. Par conséquent, le développement ovarien est un sujet brûlant de la recherche sur les ravageurs migrateurs depuis longtemps. Une série d’études a conduit à plusieurs indicateurs de développement ovarien et à des stratégies de classification. Jusqu’à présent, plusieurs méthodes ont été utilisées pour analyser le développement des ovaires, par exemple, Loxostege sticticalis - le développement de l’ovaire de la teigne des prés - qui comprend le stade initial de plumage, le début de la période de frai, la période de frai et la fin de la ponte⁸. Certains chercheurs divisent les niveaux ovariens sur la base du développement de la couleur du vitellus chez les lépidoptères migrateurs, tels que S. exigua - la chenille légionnaire de la betterave, Pseudaletia unipuncta - la vraie chenille légionnaire, et Cnaphalocrocis medinalis - la plieuse des feuilles de riz, etc.9,10,11,12. Dans des études antérieures, les niveaux de développement ovarien des ravageurs, tels que le ver de la capsule du coton et la tordeuse du riz, ont été divisés en cinq stades : le stade de ponte du vitellus, le stade de maturité du grain d’œuf, l’attente de naissance mature, la période d’ovogenèse maximale et le stade de frai final^13,14. Le développement ovarien de la pyrale du maïs a été divisé en six stades de développement : le stade de ponte du vitellus, le stade de maturation des œufs, l’élimination des œufs avant les œufs, le stade de frai maximal et le stade de frai^{final 15}.

De plus, les insectes d’un même genre ont différents stades de développement, tels que les niveaux de développement ovarien de Spodoptera frugiperda - la chenille légionnaire d’automne - se répartissent en quatre niveaux : le stade de ponte vitellin, l’attente mature de la livraison, le pic de ovi-positivité et le stade de frai final¹⁶. D’autre part, le développement ovarien chez Spodoptera exigua - la teigne de la betterave - comporte cinq niveaux : transparent, vitellogenèse, maturation des œufs, libération des œufs et ponte tardive¹⁷.

Les études antérieures ne peuvent classer le développement d’un seul à plusieurs niveaux de développement ovarien qu’en utilisant la maturité de la couleur du vitellus, de la ponte et du développement des œufs, mais la classification ne peut pas être effectuée sur la base de l’anatomie du système reproducteur. Le développement d’un ovaire basé sur l’anatomie de la morphogenèse est un domaine moins étudié. Ici, la méthode de dissection a été conçue pour prédire les femelles migratrices dans la population à l’aide de deux types de tissus ovariens, afin d’élaborer leur dynamique de reproduction en fonction de la morphogenèse anatomique du stade de développement ovarien et du sac nuptial, fournissant des preuves directes pour distinguer les femelles migratrices de type sauvage.

Certaines études ont montré que les espèces migratrices d’insectes Noctuidae étaient fréquemment capturées par les projecteurs¹⁸. L’ovaire de la plupart des espèces migratrices d’insectes Noctuidae est aux premiers stades de développement au cours de la phase initiale de migration et le niveau ovarien augmente avec les progrès migratoires. Dans cette étude, la méthode de dissection pour les grades de développement ovarien est décrite, afin d’étudier les deux tissus reproducteurs de différents ravageurs de la population femelle, capturés par la lumière de recherche. Cette méthode permet non seulement de faire progresser la recherche pour comprendre la dynamique migratoire, mais aussi de faciliter la classification des insectes, l’étude de la physiologie des insectes, la prédiction des ravageurs et la prévision des espèces de ravageurs femelles.

Protocole

REMARQUE : Faites attention aux mesures de sécurité avant de piéger des insectes migrateurs de type sauvage, il est suggéré de porter un équipement de sécurité (gants, chemises à manches longues et lunettes de protection). Éteignez également le piège lorsqu’il n’est pas utilisé pour éviter d’autres risques pour la sécurité et la surchauffe de la lumière. Il est important de suivre les protocoles de sécurité avant la dissection, tels que le port de gants, de lunettes de protection et de blouse de laboratoire pour éviter l’exposition aux fluides corporels et aux produits chimiques.

1. Piégeage des insectes migrateurs

1. Commencez ce protocole en piégeant les insectes à l’aide de la lampe de projecteur. Dans ce protocole, la source de l’insecte d’essai est le district de Jiyang, ville de Jinan, province du Shandong, Chine (36,977088° N, 116,982747° E).
2. Utilisez le corps principal de la lampe de projecteur, qui est en acier non rouillé, le boîtier, qui est un corps rectangulaire, et le phare halogène de type GT75, d’une puissance de 1000 W. Placez la lampe frontale au milieu comme source de lumière.
3. Placez un canal de collecte d’insectes en forme d’entonnoir à l’intérieur et au bas de la lumière, placez une boîte de collecte d’insectes d’un diamètre de 5 cm, suivie d’un sac de filet de collecte d’insectes de 60 ordres (0,5 m x 0,5 m), qui sert à collecter les insectes piégés par la lumière. La projection connue de la lumière est d’environ 500 m au-dessus du sol.
4. Ce protocole met l’accent sur la dynamique migratoire des femelles de type sauvage et le développement des ovaires ; par conséquent, collecter différentes espèces d’insectes (ici la collecte s’est faite d’avril à août, de 2021 à 2022). Évitez de ramasser des insectes de petite taille et blessés, sélectionnez de gros parasites de taille similaire pour cette expérience.

2. Préparation des insectes

1. Transférez tous les insectes collectés du sac en filet (0,5 m) à la cage en filet (30 cm x 30 cm), puis fournissez une boîte de Pétri contenant une solution stérilisée contenant 10 % d’eau de miel (l’alimentation est facultative). Placez la cage à 27 ± 2 °C, 65 % ± 12 % d’humidité relative et maintenez-la dans l’obscurité pendant 8 à 12 h.
2. Sélectionnez les femelles de type sauvage qui ont volé à l’intérieur de la cage le même jour, transférez-les soigneusement dans les tubes individuels du flacon et fermez chaque tube avec un couvercle en coton. Évitez la manipulation directe, qui pourrait endommager ou blesser le ravageur en raison d’une pression excessive.
   REMARQUE : Toutes les femelles de type sauvage ont été capturées la nuit et la dissection a été effectuée le jour. Ainsi, chaque expérience a été réalisée en une journée.

3. Préparation à la méthode de paralysie des insectes (Figure 1)

1. Placez la femelle sélectionnée individuellement dans un tube de fiole à mouches au milieu et anesthésiez la femelle avec du gaz CO₂ en tenant l’aiguille de la sarbacane pour provoquer une légère paralysie. Pour confirmer si le ravageur est paralysé ou non, poussez-le doucement ou touchez-le à l’aide d’une brosse douce. Aucune réponse aux stimuli mous et à l’immobilité n’indique une paralysie réussie.
   REMARQUE : La basse température (-20 °C) peut également être utilisée comme technique alternative pour paralyser les insectes.

4. Dissection d’insectes

1. Placer la femelle fraîchement paralysée dans la boîte de Pétri contenant de l’éthanol absolu (10 ml). Pour éviter l’influence des poils d’écailles et de la poudre d’ailes lors de la dissection, infiltrez l’insecte vivant ou paralysé avec de l’alcool absolu et rincez à l’eau claire.
2. Séparez les ailes dorsales de la jonction du corps de la poitrine et de l’abdomen, à l’aide de deux paires de pinces.
3. Transférez l’abdomen dans une nouvelle boîte de Pétri jetable, contenant une quantité appropriée d’eau (2 à 5 mm de profondeur), et décollez doucement l’exosquelette abdominal le long de la ligne dorsale ventrale, de la bouche pointue à la queue, à l’aide d’une pince à disséquer. Répétez les mêmes étapes de l’autre côté, puis mettez-le dans de l’eau propre pour disperser les tissus intacts.
4. Décollez soigneusement les tissus adipeux de l’épiderme à l’aide d’une pince, puis tirez et relâchez doucement les ovaires.
5. Utilisez une pince à dissection pour retirer délicatement les particules de graisse et d’autres organes autour des ovaires. Généralement, les ovaires du ravageur sont principalement repliés vers l’intérieur des deux côtés de l’abdomen, essaient d’opérer dans un environnement liquide tout en dépliant les ovaires, et décollent lentement le sac d’accouplement du milieu et choisissent les particules de graisse attachées aux trompes ovariennes.
6. Tenez doucement l’ovaire et le sac d’accouplement à partir de l’extrémité postérieure verticale et dépliez-les soigneusement vers le bas. Pour éviter tout dommage lors du dépliage, transférez l’ovaire dans une boîte de Pétri neuve ou propre contenant de l’eau. Tenez l’extrémité de l’ovaire et dépliez l’ovaire vers l’intérieur ; Effectuez soigneusement cette étape pour éviter d’endommager les ovarioles.

5. Analyser les données pour l’anatomie des tissus ovariens

1. À ce stade, évaluez le développement des œufs pour chaque insecte, en fonction de la couleur et de la taille des œufs, pour juger de sa maturité. Ensuite, jugez le grade ovarien en fonction du développement de l’ovule.
   REMARQUE : La division des différents niveaux de développement ovarien est principalement divisée, soit avant la ponte, soit avant le développement des œufs avec le niveau de précipitation du vitellus. Le développement des grains d’œufs d’insectes est divisé en étapes pour plus de clarté, telles que le stade d’apparition du jaune, le stade de maturité du jaune et le stade de la mort du vitellus. La maturité du grain d’œuf dépend de la plénitude, de la couleur et de la taille de l’œuf pour juger de sa maturité.
2. Après la dissection, assurez-vous de séparer les tissus des sacs d’accouplement femelles des ovaires intacts et observez la morphologie pour distinguer l’espèce, car l’anatomie de la plupart des sacs d’accouplement varie d’une espèce à l’autre. Par conséquent, utilisez des sacs d’accouplement pour distinguer les espèces.
3. À cette étape, évaluez l’anatomie ovarienne et analysez le classement du développement ovarien. Divisez les tissus ovariens en cinq grades (grade 1 à grade 5).
   1. Recherchez les changements et la structure suivants pour organiser les tissus : le premier grade (1) est un stade précoce de développement (transparent laiteux), abdomen plein, mou, corps gras moelleux, couleur claire, difficile à peler. Le deuxième grade (2) est l’étape de dépôt du vitellus et de classer les ovaires séparément si nécessaire après avoir observé le canal ovarien plus long et plus épais. Le troisième grade (3) a moins de corps adipeux et seulement quelques granules attachés à l’ovaire. La quatrième année (4) semble moins élastique et facile à casser, et certains œufs peuvent être présents au milieu de la trompe utérine. Le cinquième grade (5) est facile à identifier avec moins ou pas de corps adipeux, des ovaires atrophiques et fragiles.
4. Capturez des images à l’aide d’un appareil photo numérique selon les besoins expérimentaux.

Résultats

Développement des oeufs
Le protocole ci-dessus a été appliqué pour analyser le développement des ovules dans l’ovaire. À cette fin, tout d’abord, les œufs ont été classés en quatre stades afin de distinguer les stades précoces et matures du développement des œufs parmi toutes les espèces, par exemple le ver de la capsule, la chenille légionnaire, la chenille du taro et la teigne de la betterave. Ici, le stade précoce du plumage (stade transparent blanc laiteux) a été observé.

Discussion

Les méthodes d’analyse ovarienne sont couramment utilisées dans la protection des plantes, pour élucider le mouvement du vol et de la population d’insectes afin de prévoir 19,20,21 et pour élaborer sur les variations physiologiques chez les insectes. Il a été remarqué que la migration unique et la capacité de dispersion rapide des ravageurs agricoles courants, tels que le ver de la capsule, la chenille légionnaire,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Canon ( China ) co., LTD	EOS 800D
Dropper	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Ethanol absolute (99.7%)	Shanghai Hushi Laboratory Equipmentco., LTD
Forceps	Vetus Tools co., LTD	ST-14
GT75 type halogen headlamp (1000 W)	Shanghai Yadeng Industry co., LTD
Helicoverpa armigera, Mythimna separate, Spodoptera litura, Spodoptera exigua	Jiyang district, Jinan city, Shandong province, China
Measuring cylinder, beaker, flask	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Net bag	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		0.5 m
Net cages	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		30 cm x 30 cm
Petri dishes	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		60 mm diameter