Mejora de la fijación de la suspensión con chaqueta de rata en experimentos de acupuntura con ratas

Resumen

Aquí, presentamos un método mejorado de fijación de la suspensión utilizando una chaqueta de rata para inmovilizar eficazmente a las ratas durante los experimentos de acupuntura. Además, se dilucida la estructura y aplicación de este aparato de fijación, así como las instrucciones y evaluación para su utilización en la terapia de electroacupuntura.

Resumen

En la investigación experimental básica de acupuntura, las ratas se utilizan comúnmente como animales de laboratorio. Sin embargo, es difícil para ellos mantener una postura fija. Durante los procedimientos de electroacupuntura, la inmovilización adecuada de las ratas es esencial. Actualmente se utilizan varios métodos de fijación de ratas, incluida la fijación con anestesia, la fijación con plataforma alta, la fijación con ataduras y la fijación con un abrigo de rata hecho por uno mismo. Sin embargo, estos métodos tienen sus limitaciones, que pueden afectar la eficiencia y operatividad del experimento hasta cierto punto. Este protocolo introduce un método para suspender y fijar ratas utilizando ropa de rata. En primer lugar, las ratas se visten con chaquetas de rata que coinciden con la forma de su cuerpo, aprovechando su preferencia por la oscuridad y las madrigueras. La operación de punción se puede llevar a cabo después de que las ratas se hayan puesto ropa de rata. Cuando están suspendidas, las ratas están relativamente quietas, ya que sus extremidades no pueden moverse. Este método de fijación no solo ofrece beneficios económicos y fáciles de usar, sino que también garantiza una fijación estable y confiable de las ratas en una posición cómoda y relajada. También minimiza eficazmente el consumo de tiempo, el espacio experimental y los recursos de mano de obra. Además, este método permite la exposición de la mayoría de los puntos de acupuntura utilizados para la acupuntura en ratas. Este artículo se concentra principalmente en la composición del dispositivo, que abarca una chaqueta de rata especialmente diseñada, un bastidor de fijación elevado y sus estructuras de conexión. Además, se presentará un ejemplo ilustrativo para demostrar la aplicación del método de fijación de suspensión basado en ropa de rata en procedimientos de electroacupuntura de ratas.

Introducción

La acupuntura es una terapia tradicional que se caracteriza por la punción en puntos de acupuntura específicos u otras posiciones para prevenir y tratar enfermedades. La electroacupuntura combina agujas filiformes con estimulación eléctrica¹, lo que permite un control preciso sobre la cantidad de estimulación mediante el ajuste de los parámetros relevantes, promoviendo la estandarización del tratamiento de acupuntura². En los últimos años, las investigaciones sobre los mecanismos de la electroacupuntura han continuado ampliándose y profundizándose^3,4, lo que ha llevado a un aumento anual de los estudios centrados en los mecanismos de la electroacupuntura⁵.

En la investigación básica sobre electroacupuntura, las ratas son los animales más utilizados. Durante el tratamiento de electroacupuntura, el receptor debe permanecer quieto para garantizar un procedimiento sin problemas. A diferencia de los ensayos clínicos con sujetos humanos, los animales pequeños utilizados en experimentos con animales no pueden seguir órdenes conscientemente durante procedimientos de electroacupuntura de 15 a 30 minutos de duración. Esto presenta a los investigadores el desafío principal de lograr una fijación estable y confiable. La fijación inadecuada puede conducir a emociones negativas como ansiedad, depresión y miedo en animales⁶, lo que no solo aumenta el riesgo de lesiones para las ratas y la posibilidad de ser mordido para el personal experimental, sino que también afecta la estabilidad y la persuasión de los resultados de la investigación.

En estudios previos, los investigadores a menudo han utilizado la fijación de anestesia⁷, la fijación de plataforma alta⁸, la fijación de unión ^6,9 o la fijación de capa de rata¹⁰ antes de las operaciones de acupuntura o electroacupuntura. Sin embargo, dados los efectos de la anestesia sobre el cuerpo¹¹ y la función cerebral¹², y considerando que la acupuntura se realiza en pacientes conscientes en casos clínicos, la anestesia puede afectar los resultados de la investigación hasta cierto punto. Por lo tanto, en comparación con la fijación con anestesia, la fijación cómoda de ratas en estado despierto es una mejor opción.

Sin embargo, en el estado no anestesiado, varios métodos de fijación también poseen sus respectivas limitaciones, incluyendo la exposición restringida al punto de acupuntura debido a la cobertura del pelaje de rata en ratas 10, la necesidad de al menos dos individuos para realizar la operación¹³, el tamaño del fijador no ajustable¹⁴ o el estado de estrés de las ratas en una posición forzada⁶. Para abordar estos problemas técnicos, diseñamos una chaqueta de rata y un estante de fijación adecuado para la manipulación de acupuntura en la mayoría de las partes del cuerpo de la rata. Esto puede ayudar a los investigadores a llevar a cabo procedimientos de acupuntura con ratas de manera eficiente.

La justificación de este protocolo es la siguiente: en primer lugar, el casco cerrado de la chaqueta de la rata aprovecha la inclinación natural de las ratas por la oscuridad y la madriguera, restringiendo así su rango de actividades. En segundo lugar, las cuerdas de sujeción cerca de las articulaciones de las extremidades de las ratas proporcionan una restricción de compresión física, imponiendo ciertas limitaciones a sus movimientos. Sin embargo, las ratas aún pueden saltar y moverse horizontalmente incluso mientras usan la chaqueta. Por último, dado que las ratas no pueden tocar el suelo sin un punto de fuerza fijo cuando están suspendidas, añadimos un dispositivo de fijación de la suspensión a la chaqueta de la rata, restringiendo aún más sus movimientos y asegurando la retención de la aguja. La composición del dispositivo de fijación se muestra en la Figura 1.

Figura 1: Diagrama esquemático de la chaqueta de rata y la fijación de la suspensión. (A) La apariencia general de la chaqueta de rata en una vista plana. (B) Vista tridimensional de la chaqueta de rata. (C) Chaqueta de rata especialmente hecha a medida con una incisión cerca de los puntos de acupuntura en la cabeza y la cintura trasera. (D) Ilustración de varias ratas suspendidas simultáneamente en el estante elevado. 1: Vista general de la tela; 2: Salida de las extremidades anteriores; 3: Salida de las extremidades posteriores; 4: Cuerda de amarre; 5: Cavidad formada después de la sutura; 6: Incisión para exponer los puntos de acupuntura de la cabeza; 7: Incisión para exponer los puntos de acupuntura de espalda y cintura. 8: Posición de sutura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en las ratas en este estudio se adhirieron a la Norma Nacional para el Bienestar de los Animales de Laboratorio y las Pautas de Revisión Ética (2018) adoptadas oficialmente por la República Popular China y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de las Academias Nacionales Press¹⁵. Este protocolo se compone de tres pasos principales. En primer lugar, las chaquetas para ratas se confeccionan y ajustan en función de las formas corporales individuales de las ratas con diferentes pesos. A continuación, la manipulación de la acupuntura se lleva a cabo siguiendo los procedimientos estándar. Por último, las ratas están suspendidas en sus chaquetas mientras las agujas permanecen en su lugar para adaptarse a la necesidad de intervenciones simultáneas entre ratas dentro del mismo grupo.

1. Preparación previa a la punción

1. Producción de la chaqueta de rata
   1. Pesa a las ratas y mide la forma de su cuerpo antes de hacer sus chaquetas. Para verificar la idoneidad de este protocolo para ratas de diferentes pesos, seleccione ratas que pesen 220 g, 300 g, 400 g y 520 g para mediciones independientes de sus dimensiones corporales, que abarquen medidas de a a f, como se muestra en la Figura 2.
      NOTA: La correlación entre las proporciones corporales de las ratas y sus correspondientes tamaños de chaqueta también se presenta en la Figura 2. Los parámetros pertinentes de longitud corporal para ratas de diferentes pesos se registran en la Tabla 1.
   2. Corta un pedazo rectangular de tela gruesa y oscura para hacer una chaqueta de rata. Usa la tela con un ancho desplegado igual a la circunferencia medida alrededor de la parte más gruesa del abdomen de la rata. La longitud de la tela es igual a la distancia desde la punta de la nariz de la rata hasta la base de su cola (ver Figura 2).
   3. Dobla la tela por la mitad y corta la esquina superior izquierda en un ángulo de aproximadamente 45°-65° para formar un trapecio derecho (ver Figura 3A).
   4. Cose bien los dos lados de la izquierda con hilo de algodón. Consulte la Figura 1B y la Figura 3B para obtener orientación.
   5. Corta dos agujeros pequeños, uno a cada lado de la tela, para que pasen las extremidades superiores e inferiores de la rata (véase la figura 3C). La distancia entre las dos extremidades superiores determina el espacio entre los agujeros superiores de la chaqueta de rata. La distancia entre las dos extremidades inferiores determina el espacio entre los orificios inferiores de la chaqueta de rata.
   6. Usa la distancia longitudinal entre la axila de la rata y la parte delantera del ilion para que sirva como espacio entre los orificios superior e inferior de la chaqueta de la rata. Usa la circunferencia de la articulación del hombro para determinar la circunferencia del orificio superior de la chaqueta de rata. Usa la circunferencia de la articulación de la cadera para la circunferencia del orificio inferior de la chaqueta de rata.
   7. Al lado de cada agujero, cose una correa de tela larga que se pueda cruzar y envolver firmemente alrededor del cuerpo desde el extremo de apertura de la chaqueta para fijar la rata.
2. Método de uso de la chaqueta de rata
   1. Usa guantes antes de proceder a vestir a la rata con la chaqueta. Comienza sosteniendo la parte central y trasera de la chaqueta de rata con una mano sobre la mesa. Con la otra mano, sostén la cola de la rata de su jaula de alimentación y colócala suavemente en la chaqueta.
   2. A medida que la rata avanza, su cabeza alcanzará el casco de la chaqueta. En este punto, usa ambas manos para sacar con cuidado las extremidades superiores izquierda y derecha de los agujeros de la chaqueta.
   3. Toma la cuerda de atar del extremo de la abertura de la chaqueta, crúzala de izquierda a derecha y envuélvela firmemente alrededor del tronco de la rata. Átalo firmemente en el lado opuesto del tronco para asegurar una fijación adecuada. Después de sujetar las extremidades superiores de la rata, repita el mismo procedimiento para fijar sus extremidades inferiores.
   4. Toma precauciones para evitar que te muerdan o arañen las garras de la rata cuando saques sus extremidades de los agujeros de la chaqueta. Asegúrese de que la tensión de la cuerda esté bien ajustada, es decir, no demasiado apretada para causar isquemia local de las extremidades e hipoxia en ratas, y no demasiado floja, permitiendo que la rata escape fácilmente (ver Video 1).
3. Rejilla de fijación y ganchos de hierro en forma de S
   1. La rejilla de fijación consta de dos bandejas de hierro pesado (24 cm de largo, 12 cm de ancho y 2 cm de alto) y una columna de hierro (60 cm de largo) que está firmemente soldada en cada bandeja. Fije un palo de hierro sólido (145 cm de longitud) a la misma altura en las dos columnas de hierro utilizando una estructura de conexión por tornillo que se pueda ajustar y mantener a una altura fija (ver Figura 4A).
   2. Para conectar la rata que lleva la chaqueta al palo de hierro, utilice los ganchos en forma de S (11 cm de diámetro). Envuelve un extremo del gancho alrededor de la correa de la chaqueta mientras el otro extremo está colgado en el palo de hierro. Usa dos ganchos en forma de S para asegurar a la rata en el palo. Consulte la Figura 1D y la Figura 4B para conocer la estructura general.

Figura 2: Diagrama correspondiente de la forma del cuerpo de la rata y el tamaño de la chaqueta de la rata coincidente. En el diagrama, el parámetro a representa la distancia transversal en la parte posterior de la articulación entre las extremidades superiores y el tronco de la rata. Este valor se utiliza como medida de espaciamiento entre los orificios de penetración para las extremidades superiores de la chaqueta de rata. Del mismo modo, el parámetro b representa la distancia transversal en la espalda donde las extremidades inferiores bilaterales de la rata se conectan con el tronco. Esta medida determina el espaciado de los orificios de penetración para las extremidades inferiores de la chaqueta de rata. El parámetro c significa la circunferencia de la parte más gruesa del abdomen de la rata, que se puede utilizar como medida de ancho para la tela de la chaqueta de la rata. El parámetro d representa la distancia desde la axila de la rata hasta la parte delantera de su ilion, determinando la distancia longitudinal entre los orificios superior e inferior de la chaqueta. El parámetro e corresponde a la distancia longitudinal desde la punta de la nariz de la rata hasta la base de su cola, sirviendo como medida de longitud para la tela de la chaqueta de la rata. El parámetro f denota la circunferencia de la articulación que conecta la extremidad superior y el tronco de la rata, sirviendo como la circunferencia del orificio por el que pasan las extremidades superiores. El parámetro g representa la circunferencia de la articulación que conecta las extremidades inferiores y el tronco de la rata, determinando la circunferencia del orificio por el que pasan las extremidades inferiores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Peso corporal (g)	Parámetros de la forma del cuerpo (cm)
	un	b	c	d	e	f	g
220	6.0	7.0	15.0	8.0	19.0	5.0	7.0
300	7.0	7.5	17.0	10.0	21.0	6.0	8.0
400	8.0	8.5	19.0	11.5	23.0	6.5	9.0
520	8.0	10.0	20.0	12.5	26.0	7.0	9.5

Tabla 1. Los resultados de la medición de los parámetros de forma corporal de ratas con diferentes pesos corporales.

Figura 3: Diagrama que muestra la apariencia física y el uso de la chaqueta de rata. (A) Vista exterior del plano de la chaqueta de rata. La forma de la chaqueta de la rata se asemeja a un trapecio en ángulo recto, con aberturas separadas en los lados izquierdo y derecho para que pasen las extremidades superiores e inferiores de la rata. (B) Vista exterior desplegada de la chaqueta de rata. El cierre del arnés crea una cavidad semicerrada, que sirve como un componente crucial para atraer a las ratas a entrar. (C) Vista lateral de una rata vestida con la chaqueta. Una vez que las extremidades de la rata pasan a través de las aberturas de la ropa, las correas se cruzan sobre la superficie ventral del tronco y se sujetan firmemente en la parte posterior con la tensión adecuada. Esto asegura que la rata esté relativamente inmovilizada. (D) Vista abdominal de una rata vestida con la chaqueta de rata. La superficie ventral de la chaqueta expone la piel abdominal de la rata, lo que permite un acceso conveniente para la acupuntura en los puntos ventrales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1: Poniéndose la chaqueta de rata. Este video muestra un proceso típico de vestir a la rata con la chaqueta. Haga clic aquí para descargar este video.

Figura 4: Diagrama que muestra la apariencia física y el uso de la rejilla de fijación elevada. (A) Bastidor de fijación elevado. Esta estantería consta principalmente de dos columnas verticales de hierro (60 cm de longitud) soldadas a cada bandeja, junto con un largo palo de hierro horizontal (145 cm de longitud) colocado paralelo al suelo. Los tornillos se utilizan para asegurar el palo horizontal a la misma altura que las columnas verticales. (B) Suspensión de ratas en el bastidor de fijación. Las ratas que llevan las chaquetas para ratas se sujetan de forma segura a la rejilla de fijación mediante dos ganchos en forma de S por rata. (C) Tratamiento simultáneo de electroacupuntura en múltiples ratas. Para evitar cualquier interferencia potencial resultante del movimiento de la cola, fue necesario mantener un espacio adecuado entre las ratas, equivalente a la longitud de la cola de una rata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Procedimiento de electroacupuntura

1. Preparación rutinaria
   1. Coloque la rejilla de fijación sobre un escritorio horizontal o en el suelo.
   2. Antes del procedimiento de punción, retire el pelo alrededor de los puntos de acupuntura con una afeitadora eléctrica para garantizar una exposición completa. Cuando el punto de acupuntura a perforar se encuentra en el abdomen de la rata, como Guanyuan (CV4, unos 25 mm por debajo del ombligo), acorte el ancho de la ropa de la rata de manera adecuada para exponer los puntos de acupuntura abdominales.
   3. Localice el punto de acupuntura desde el espacio en la línea media del abdomen que no está cubierto por la chaqueta de rata (véase la figura 3D) y luego inyecte la aguja.
   4. Cuando los puntos de acupuntura que se van a perforar están en la cabeza de la rata, como el Baihui (GV20, ubicado en el centro del hueso parietal), haga una pequeña incisión en la posición correspondiente en la cabeza para exponer completamente la piel alrededor de GV20 (Ver Figura 1C).
   5. Al acupunturar puntos de acupuntura en las extremidades de ratas, como Neiguan (PC6, en la cara interna de la extremidad anterior, entre las suturas radial y cubital a unos 3 mm de distancia de la articulación de la muñeca) en la extremidad superior o Zusanli (ST36, en el lado posterolateral de la articulación de la rodilla, a unos 2 mm por debajo de la cabeza del peroné) en la extremidad inferior, Debido a la exposición obvia de los puntos de acupuntura, use una mano para ayudar a fijar la extremidad, mientras que la otra puede realizar directamente la operación de acupuntura.
   6. Cuando el punto de acupuntura se encuentra en la espalda o la cintura de una rata, como Shenshu (BL23, debajo de la 2ª vértebra lumbar, a 6 mm de distancia de la línea media de la espalda), corte una abertura de aproximadamente 2 cm de ancho en el centro de la chaqueta de la rata para exponer completamente la piel del sitio correspondiente (ver Figura 1C).
   7. Viste a la rata con la chaqueta. Después de desinfectar la piel local de los puntos de acupuntura con hisopos con alcohol, comience el procedimiento de acupuntura.
2. Técnica de punción: Localice el punto de acupuntura con precisión. Inserte una aguja de acupuntura desechable estéril (0,16 mm x 7 mm) en el punto de acupuntura de la rata a la profundidad adecuada.
3. Operación de electroacupuntura
   1. Enrolle el alambre del electrodo alrededor de la varilla de hierro horizontal. Este paso reduce el riesgo de que la aguja se caiga debido a la fuerza gravitacional que actúa sobre el clip de electroacupuntura. Luego, coloque el extremo del alambre del electrodo de forma segura en el mango de la aguja.
   2. Encienda la alimentación y seleccione los parámetros de frecuencia, corriente y tiempo adecuados. En este experimento, los parámetros se ajustaron a 2 Hz, 1 mA y 15 min. Una vez ajustados los parámetros, comience el proceso de tratamiento de electroacupuntura (Ver Video 2 y Video 3).
   3. Electroacupuntura simultánea en ratas: Durante el tratamiento, suspenda a las ratas del mismo grupo juntas en el palo de hierro utilizando los ganchos en forma de S y deje que se sometan a una intervención de electroacupuntura simultáneamente.
   4. NOTA: El palo de hierro no solo debe ser resistente, sino también lo suficientemente largo como para tratar a un grupo de ratas al mismo tiempo. En este experimento, al tiempo que se garantiza un espaciamiento adecuado y no hay interferencia entre las ratas, se pueden tratar 3-4 ratas simultáneamente (véase la Figura 4C).
4. Observación de las respuestas de las ratas durante el tratamiento de electroacupuntura: Evalúe la idoneidad de este método de fijación para la electroacupuntura en ratas en función de los siguientes factores, como el número de personal necesario para completar la operación, el tiempo necesario para reparar una rata, la respuesta de las ratas durante el tratamiento de electroacupuntura, el número de agujas que se cayeron durante el procedimiento y cualquier muerte accidental que pueda ocurrir durante la operación.
5. Extracción de las agujas
   1. Una vez que se complete el tiempo preestablecido, el aparato de electroacupuntura se apagará automáticamente. Retire el pequeño clip que está conectado al mango de la aguja y retire con cuidado la aguja de acupuntura de debajo de la piel de la rata, concluyendo así el proceso de tratamiento de electroacupuntura.
   2. Afloja las correas, levanta la cubierta de la cabeza de la chaqueta de la rata y colócala encima de la jaula. La rata será entonces libre de liberarse de la chaqueta y entrar en la jaula de forma independiente (ver Video 4).

Vídeo 2. Puntos de acupuntura con punción en la región lumbar. Este video muestra el procedimiento completo y coherente que abarca el atuendo de la rata en la chaqueta, la inserción de agujas de acupuntura en los puntos de acupuntura en la cintura y la posterior conexión de un aparato de electroacupuntura. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 3. Puntos de acupuntura con punción en el abdomen y las extremidades inferiores. Este video muestra el procedimiento completo y coherente que abarca el atuendo de la rata en la chaqueta, la inserción de agujas de acupuntura en puntos de acupuntura ubicados en el abdomen y la extremidad inferior, y la posterior conexión de un aparato de electroacupuntura. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 4. Quitarse la chaqueta de rata. Este video muestra la práctica habitual de quitarle la chaqueta a la rata. Haga clic aquí para descargar este video.

Resultados

En este experimento, se seleccionaron un total de 12 ratas para el tratamiento de electroacupuntura, y se observaron sus reacciones bajo el método de fijación (como se muestra en la Tabla 2). Entre las 12 ratas, solo 1 rata mostró una lucha intensa durante el período de retención de la aguja de electroacupuntura de 15 minutos. Como resultado de sus vigorosos movimientos, la aguja se desprendió a mitad de camino, representando el 8,33% del número total de ratas. Este resultado sugiere que el métod...

Discusión

Se ha demostrado que la electroacupuntura tiene buenos efectos terapéuticos en diversas enfermedades como el deterioro cognitivo 16,17^, la lesión miocárdica¹⁸ y el dolor inflamatorio¹⁹. Para comprender su mecanismo de acción, se han llevado a cabo experimentos con animales utilizando principalmente ratas. La fijación de los animales durante los procedimientos es crucial para obtener resultados precisos. Si bien...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% alcohol	Shandong Lircon medical technology co., ltd	2002-0059	Disinfection
acupuncture needles	Beijing Luo ya shan chuan medical equipment co., Ltd.		needling
Adult Sprague-Dawley (SD) rats	Liaoning Changsheng biotechnology co., Ltd.	SCXK 2020-0001	The recipient  subjected to fixation
an elevated fixation rack	Taizhou shiai instruments and equipments for scientific and teaching research  Co., ltd	/	Fix rats
Hans electronic acupuncture apparatus	Beijing Huayun Ante Science and Technology Co. Ltd.	HANS-200A	electroacupuncture
Medical cotton ball	Jiangsu Misawa Medical Supplies Co., Ltd.	20172142357	Disinfection
Pet electric clipper	Fenghua Xikou Lubao Knives & Scissors Electrical Appliance Factory	/	Shave the hair of rats
Tweezers	Qingdao Schultz Biotechnology Co., ltd		Pinch cotton balls