Melhor fixação da suspensão usando jaqueta de rato em experimentos de acupuntura em ratos

Resumo

Aqui, apresentamos um método aprimorado de fixação da suspensão usando uma jaqueta de rato para imobilizar efetivamente ratos durante experimentos de acupuntura. Além disso, a estrutura e aplicação desse aparelho de fixação, bem como as instruções e avaliação para sua utilização na eletroacupuntura, são elucidados.

Resumo

Na pesquisa experimental básica em acupuntura, ratos são comumente usados como animais de laboratório. No entanto, é difícil para eles manter uma postura fixa. Durante os procedimentos de eletroacupuntura, a imobilização adequada de ratos é essencial. Vários métodos de fixação de ratos são usados atualmente, incluindo fixação em anestesia, fixação em plataforma alta, fixação de ligação e fixação com revestimento de rato de fabricação própria. No entanto, esses métodos têm suas limitações, que podem afetar a eficiência e a operacionalidade do experimento até certo ponto. Este protocolo introduz um método de suspensão e fixação de ratos usando roupas de ratos. Em primeiro lugar, os ratos são vestidos com jaquetas de ratos que combinam com sua forma corporal, aproveitando sua preferência pela escuridão e escavação. A operação de agulhamento pode então ser realizada após os ratos terem usado roupas de rato. Quando suspensos, os ratos ficam relativamente parados, pois seus membros não podem se mover. Este método de fixação oferece não só benefícios econômicos e fáceis de usar, mas também garante uma fixação estável e confiável dos ratos em uma posição confortavelmente relaxada. Também minimiza efetivamente o consumo de tempo, espaço experimental e recursos de mão de obra. Além disso, esse método permite a exposição da maioria dos acupontos utilizados para acupuntura em ratos. Este artigo concentra-se principalmente na composição do dispositivo, abrangendo uma jaqueta de ratos especialmente projetada, um rack de fixação elevada e suas estruturas de conexão. Adicionalmente, um exemplo ilustrativo será apresentado para demonstrar a aplicação do método de fixação em suspensão à base de roupas de rato em procedimentos de eletroacupuntura em ratos.

Introdução

A acupuntura é uma terapia tradicional caracterizada pelo agulhamento em acupontos específicos ou outras posições para prevenir e tratar doenças. A eletroacupuntura combina agulhas filiformes com estimulação elétrica¹, o que permite um controle preciso sobre a quantidade de estimulação por meio do ajuste de parâmetros relevantes, promovendo a padronização do tratamento com acupuntura². Nos últimos anos, as pesquisas sobre os mecanismos da eletroacupuntura continuaram a se expandir e aprofundar^3,4, o que tem levado a um aumento anual de estudos enfocando os mecanismos da eletroacupuntura⁵.

Na pesquisa básica em eletroacupuntura, os ratos são os animais mais comumente usados. Durante o tratamento de eletroacupuntura, o receptor deve permanecer imóvel para garantir um procedimento suave. Ao contrário dos ensaios clínicos com seres humanos, pequenos animais usados em experimentos com animais não podem seguir comandos conscientemente durante procedimentos de eletroacupuntura de 15 a 30 minutos de duração. Isso apresenta aos pesquisadores um desafio primário de alcançar uma fixação estável e confiável. A fixação inadequada pode levar a emoções negativas, como ansiedade, depressão e medo^{em animais6}, o que não só aumenta o risco de lesões em ratos e a chance de ser mordido para o pessoal experimental, mas também afeta a estabilidade e a persuasão dos resultados da pesquisa.

Em estudos anteriores, os pesquisadores frequentemente utilizaram fixação anestésica⁷, fixação com plataforma alta⁸, fixação com ligação ^6,9 ou fixação com jaleco de rato¹⁰ antes de operações de acupuntura ou eletroacupuntura. No entanto, dados os efeitos da anestesia sobre o organismo¹¹ e a função cerebral¹², e considerando que a acupuntura é realizada em pacientes conscientes em casos clínicos, a anestesia pode impactar os resultados da pesquisa até certo ponto. Portanto, em comparação com a fixação anestésica, a fixação confortável de ratos em estado de vigília é uma opção melhor.

No entanto, no estado não anestesiado, vários métodos de fixação também possuem suas respectivas limitações, incluindo a exposição restrita do acuponto devido à cobertura do revestimento do rato em ratos 10, a necessidade de pelo menos dois indivíduos para realizar a operação¹³, o tamanho do fixador não ajustável¹⁴ ou o estado estressado de ratos em posição forçada⁶. Para resolver essas questões técnicas, projetamos uma jaqueta de rato e um rack de fixação adequado para manipulação de acupuntura na maioria das partes do corpo do rato. Isso pode ajudar os pesquisadores a realizar procedimentos de acupuntura com ratos de forma eficiente.

A justificativa para esse protocolo é a seguinte: em primeiro lugar, o capacete fechado na jaqueta do rato aproveita a inclinação natural dos ratos para a escuridão e a escavação, restringindo assim seu leque de atividades. Em segundo lugar, as cordas de ligação próximas às articulações dos membros dos ratos proporcionam contenção física à compressão, impondo certas limitações aos seus movimentos. No entanto, os ratos ainda são capazes de saltar e se mover horizontalmente, mesmo usando a jaqueta. Por fim, como os ratos não podem tocar o solo sem um ponto de força fixo quando suspensos, adicionamos um dispositivo de fixação da suspensão à jaqueta do rato, restringindo ainda mais seus movimentos e garantindo a retenção da agulha. A composição do dispositivo de fixação é mostrada na Figura 1.

Figura 1: Diagrama esquemático da jaqueta do rato e fixação da suspensão. (A) A aparência geral da jaqueta de rato em uma vista plana. (B) Visão tridimensional da jaqueta do rato. (C) Jaqueta de rato especialmente adaptada com uma incisão perto dos acupontos na cabeça e cintura traseira. (D) Ilustração de múltiplos ratos simultaneamente suspensos no rack elevado. 1: Visão geral da tela; 2: Saída do membro torácico; 3: Saída dos membros posteriores; 4: Corda de amarração; 5: Cavidade formada após sutura; 6: Incisão para exposição de acupontos cefálicos; 7: Incisão para exposição dos acupontos das costas e cintura. 8: Posição de sutura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todos os procedimentos realizados nos ratos deste estudo aderiram ao National Standard for Laboratory Animal Welfare and Ethics Review Guidelines (2018) adotado oficialmente pela República Popular da China e ao Guide for the Care and Use of Laboratory Animals da National Academies Press¹⁵. Esse protocolo é composto por três etapas principais. Em primeiro lugar, as jaquetas de ratos são feitas sob medida e montadas com base nas formas individuais do corpo de ratos com diferentes pesos. Em seguida, a manipulação da acupuntura é realizada seguindo procedimentos padrão. Por fim, os ratos são suspensos em suas jaquetas enquanto as agulhas permanecem no local para acomodar a necessidade de intervenções simultâneas entre ratos dentro do mesmo grupo.

1. Preparo pré-agulhamento

1. Produção da jaqueta de rato
   1. Pese os ratos e meça sua forma corporal antes de fazer suas jaquetas. Para verificar a adequação desse protocolo para ratos de pesos variados, selecionamos ratos pesando 220 g, 300 g, 400 g e 520 g para medidas independentes de suas dimensões corporais, englobando medidas de a a f, conforme ilustrado na Figura 2.
      OBS: A correlação entre as proporções corporais dos ratos e seus respectivos tamanhos de jaqueta também é apresentada na Figura 2. Os parâmetros pertinentes do comprimento corporal para ratos de diferentes pesos estão registrados na Tabela 1.
   2. Corte um pedaço retangular de tecido grosso e escuro para fazer uma jaqueta de rato. Use o tecido com largura desdobrada igual à circunferência medida ao redor da parte mais espessa do abdômen do rato. O comprimento do tecido é igual à distância da ponta do nariz do rato até a base da cauda (ver Figura 2).
   3. Dobre o tecido ao meio e corte o canto superior esquerdo em um ângulo de cerca de 45°-65° para formar um trapézio direito (ver Figura 3A).
   4. Costure bem os dois lados da esquerda com fio de algodão. Consulte a Figura 1B e a Figura 3B para obter orientação.
   5. Corte dois pequenos orifícios, um de cada lado do tecido, para a passagem dos membros superiores e inferiores do rato (ver Figura 3C). A distância entre os dois membros superiores determina o espaçamento entre os orifícios superiores da jaqueta do rato. A distância entre os dois membros inferiores determina o espaçamento entre os orifícios inferiores da jaqueta do rato.
   6. Use a distância longitudinal entre a axila do rato e a frente do ílio para servir como espaçamento entre os orifícios superior e inferior da jaqueta do rato. Use a circunferência da articulação do ombro para determinar a circunferência do orifício superior na jaqueta do rato. Use a circunferência da articulação do quadril para a circunferência do orifício inferior na jaqueta do rato.
   7. Ao lado de cada furo, costure uma longa tira de pano que pode ser cruzada e enrolada firmemente ao redor do corpo a partir da extremidade de abertura da jaqueta para fixar o rato.
2. Método de uso de jaqueta de rato
   1. Use luvas antes de começar a vestir o rato na jaqueta. Comece segurando a parte central e traseira da jaqueta de ratos com uma mão sobre a mesa. Com a outra mão, segure a cauda do rato de sua gaiola de alimentação e coloque-a suavemente na jaqueta.
   2. À medida que o rato avança, sua cabeça alcançará o capacete da jaqueta. Neste ponto, use as duas mãos para puxar cuidadosamente os membros superiores esquerdo e direito para fora dos orifícios da jaqueta.
   3. Pegue a corda de amarração da extremidade de abertura da jaqueta, cruze-a da esquerda para a direita e enrole-a firmemente ao redor do tronco do rato. Amarre-o firmemente no lado oposto do tronco para garantir a fixação adequada. Após a contenção dos membros superiores do rato, repita o mesmo procedimento para fixar os membros inferiores.
   4. Tome precauções para evitar ser mordido ou arranhado pelas garras do rato ao puxar seus membros para fora dos orifícios da jaqueta. Certifique-se de que a estanqueidade da corda esteja adequadamente ajustada, ou seja, não muito apertada para causar isquemia e hipóxia local do membro em ratos, e não muito solta, permitindo que o rato escape facilmente (ver Vídeo 1).
3. Rack de fixação e ganchos de ferro em forma de S
   1. O rack de fixação consiste em duas bandejas de ferro pesado (24 cm de comprimento, 12 cm de largura e 2 cm de altura) e uma coluna de ferro (60 cm de comprimento) que é firmemente soldada em cada bandeja. Fixe um bastão de ferro sólido (145 cm de comprimento) na mesma altura nas duas colunas de ferro usando uma estrutura de conexão de parafuso que pode ser ajustada e mantida a uma altura fixa (ver Figura 4A).
   2. Para conectar o rato que usa a jaqueta ao bastão de ferro, use os ganchos em forma de S (11 cm de diâmetro). Enrole uma extremidade do gancho ao redor da alça na jaqueta enquanto a outra extremidade está pendurada no bastão de ferro. Use dois ganchos em forma de S para prender o rato no palito. Consulte a Figura 1D e a Figura 4B para obter a estrutura geral.

Figura 2: Diagrama correspondente da forma do corpo do rato e do tamanho da jaqueta do rato correspondente. No diagrama, o parâmetro a representa a distância transversal na parte posterior da articulação entre os membros superiores e o tronco do rato. Este valor é utilizado como medida do espaçamento entre os orifícios penetrantes para os membros superiores da jaqueta de ratos. Da mesma forma, o parâmetro b representa a distância transversal no dorso onde os membros inferiores bilaterais do rato se conectam com o tronco. Essa medida determina o espaçamento dos orifícios penetrantes para os membros inferiores da jaqueta do rato. O parâmetro c significa a circunferência da parte mais espessa do abdômen do rato, que pode ser utilizada como medida da largura do tecido da jaqueta do rato. O parâmetro d representa a distância da axila do rato à frente de seu ílio, determinando a distância longitudinal entre os orifícios superior e inferior da jaqueta. O parâmetro e corresponde à distância longitudinal da ponta do nariz do rato até a base da cauda, servindo como medida do comprimento do pano da jaqueta do rato. O parâmetro f denota a circunferência da articulação que conecta o membro superior e o tronco do rato, servindo como a circunferência do orifício por onde passam os membros superiores. O parâmetro g representa a circunferência da articulação que conecta os membros inferiores e o tronco do rato, determinando a circunferência do orifício por onde passam os membros inferiores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Peso Corporal (g)	Parâmetros da forma do corpo (cm)
	um	b	c	d	e	f	g
220	6.0	7.0	15.0	8.0	19.0	5.0	7.0
300	7.0	7.5	17.0	10.0	21.0	6.0	8.0
400	8.0	8.5	19.0	11.5	23.0	6.5	9.0
520	8.0	10.0	20.0	12.5	26.0	7.0	9.5

Tabela 1. Os resultados da mensuração dos parâmetros de forma corporal de ratos com diferentes pesos corporais.

Figura 3: Diagrama representando a aparência física e o uso da jaqueta de rato. (A) Vista exterior plana do casaco de rato. O formato da jaqueta do rato se assemelha a um trapézio em ângulo direito, com aberturas separadas nos lados esquerdo e direito para os membros superiores e inferiores do rato passarem. (B) Vista exterior desdobrada da jaqueta de rato. O fechamento do capacete cria uma cavidade semi-fechada, que serve como um componente crucial para atrair ratos a entrar. (C) Vista lateral de um rato vestido com a jaqueta. Uma vez que os membros do rato passam pelas aberturas da roupa, as alças são cruzadas sobre a superfície ventral do tronco e fixadas firmemente nas costas com tensão apropriada. Isso garante que o rato seja relativamente imobilizado. (D) Vista abdominal de um rato vestido com a jaqueta do rato. A superfície ventral da camisa expõe a pele abdominal do rato, permitindo o acesso conveniente para acupuntura em pontos ventrais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Vestindo a jaqueta de rato. Este vídeo mostra um processo típico de vestir o rato na jaqueta. Clique aqui para baixar este vídeo.

Figura 4: Diagrama descrevendo a aparência física e o uso do rack de fixação elevado. (A) Rack de fixação elevado. Este rack consiste principalmente de duas colunas verticais de ferro (60 cm de comprimento) soldadas a cada bandeja, juntamente com uma longa vareta de ferro horizontal (145 cm de comprimento) colocada paralelamente ao solo. Os parafusos são usados para fixar o bastão horizontal na mesma altura que as colunas verticais. (B) Suspensão de rato no rack de fixação. Os ratos que usam as jaquetas de ratos são fixados firmemente ao rack de fixação usando dois ganchos em forma de S por rato. (C) Tratamento simultâneo com eletroacupuntura em múltiplos ratos. Para evitar qualquer interferência potencial resultante do movimento da cauda, foi necessário manter um espaçamento adequado entre os ratos, equivalente ao comprimento da cauda do rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Procedimento de eletroacupuntura

1. Preparação de rotina
   1. Coloque o rack de fixação em uma área de trabalho ou solo horizontal.
   2. Antes do procedimento de agulhamento, remova os pelos ao redor dos acupontos usando um barbeador elétrico para garantir a exposição completa. Quando o acuponto a ser puncionado estiver localizado no abdômen do rato, como Guanyuan (CV4, cerca de 25 mm abaixo do umbigo), encurte a largura da roupa do rato adequadamente para expor os acupontos abdominais.
   3. Localize o acuponto a partir da lacuna na linha média do abdómen que não está coberta pelo revestimento do rato (ver Figura 3D) e, em seguida, injete a agulha.
   4. Quando os acupontos a serem puncionados estiverem na cabeça do rato, como Baihui (GV20, localizado no meio do osso parietal), faça uma pequena incisão na posição correspondente na cabeça para expor totalmente a pele ao redor do GV20 (ver Figura 1C).
   5. Ao acupunturar acupontos nos membros de ratos, como Neiguan (CP6, na face interna do membro torácico, entre as suturas radial e ulnar a cerca de 3 mm de distância da articulação do punho) no membro superior ou Zusanli (ST36, na face póstero-lateral da articulação do joelho, cerca de 2 mm abaixo da cabeça da fíbula) no membro inferior, Devido à óbvia exposição dos acupontos, use uma mão para auxiliar na fixação do membro, enquanto a outra pode realizar diretamente a operação de acupuntura.
   6. Quando o acuponto está localizado no dorso ou na cintura de um rato, como Shenshu (BL23, abaixo da 2ª vértebra lombar, a 6 mm de distância da linha média das costas), corte uma abertura de aproximadamente 2 cm de largura no centro da jaqueta do rato para expor completamente a pele do local correspondente (ver Figura 1C).
   7. Vista o rato na jaqueta. Depois de desinfetar a pele local dos acupontos com compressas de álcool, inicie o procedimento de acupuntura.
2. Técnica de agulhamento: Localize o acuponto com precisão. Inserir uma agulha de acupuntura descartável estéril (0,16 mm x 7 mm) no acuponto do rato na profundidade apropriada.
3. Operação de eletroacupuntura
   1. Enrole o fio do eletrodo ao redor da haste de ferro horizontal. Esta etapa reduz o risco de queda da agulha devido à força gravitacional que atua sobre o clipe de eletroacupuntura. Em seguida, prenda a extremidade do fio do eletrodo firmemente na alça da agulha.
   2. Ligue a alimentação e selecione os parâmetros de frequência, corrente e tempo apropriados. Neste experimento, os parâmetros foram ajustados para 2 Hz, 1 mA e 15 min. Uma vez ajustados os parâmetros, inicie o processo de tratamento com eletroacupuntura (Veja o Vídeo 2 e o Vídeo 3).
   3. Eletroacupuntura simultânea em ratos: Durante o tratamento, suspenda os ratos do mesmo grupo juntos no bastão de ferro usando os ganchos em forma de S e deixe-os passar por intervenção de eletroacupuntura simultaneamente.
   4. NOTA: O bastão de ferro não só deve ser resistente, mas também longo o suficiente para tratar um grupo de ratos ao mesmo tempo. Neste experimento, garantindo espaçamento adequado e sem interferência entre os ratos, 3-4 ratos podem ser tratados simultaneamente (ver Figura 4C).
4. Observação das respostas do rato durante o tratamento com eletroacupuntura: Avaliar a adequação deste método de fixação para eletroacupuntura em ratos com base nos seguintes fatores, como o número de pessoal necessário para completar a operação, o tempo necessário para fixar um rato, a resposta dos ratos durante o tratamento com eletroacupuntura, o número de agulhas caídas durante o procedimento e quaisquer mortes acidentais que possam ocorrer durante a operação.
5. Remoção das agulhas
   1. Uma vez completado o tempo pré-estabelecido, o aparelho de eletroacupuntura será desligado automaticamente. Remova o pequeno clipe que está conectado ao cabo da agulha e remova cuidadosamente a agulha de acupuntura abaixo da pele do rato, concluindo assim o processo de tratamento com eletroacupuntura.
   2. Solte as alças, levante a cobertura da cabeça da jaqueta do rato e posicione o rato acima da gaiola. O rato estará então livre para se soltar da jaqueta e entrar na gaiola de forma independente (veja o Vídeo 4).

Vídeo 2. Agulhamento de acupontos na região lombar. Este vídeo demonstra o procedimento abrangente e coerente que engloba o uso do rato na jaqueta, a inserção de agulhas de acupuntura em acupontos na cintura e a subsequente conexão de um aparelho de eletroacupuntura. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3. Agulhamento de acupontos no abdome e membro inferior. Este vídeo demonstra o procedimento abrangente e coerente que engloba o uso do rato na jaqueta, a inserção de agulhas de acupuntura em acupontos localizados no abdome e no membro inferior e a subsequente conexão de um aparelho de eletroacupuntura. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 4. Removendo a jaqueta do rato. Este vídeo mostra a prática habitual de remover a jaqueta do rato. Clique aqui para baixar este vídeo.

Resultados

Neste experimento, um total de 12 ratos foram selecionados para o tratamento com eletroacupuntura, e suas reações sob o método de fixação foram observadas (como mostra a Tabela 2). Entre os 12 ratos, apenas 1 apresentou intensa luta durante o período de retenção da agulha de eletroacupuntura de 15 min. Como resultado de seus movimentos vigorosos, a agulha saiu no meio do caminho, representando 8,33% do total de ratos. Esse resultado sugere que o método de fixação utilizado geralmente demonstra...

Discussão

A eletroacupuntura tem demonstrado bons efeitos terapêuticos em várias doenças, como comprometimento cognitivo 16,17^, lesão miocárdica¹⁸ e dor inflamatória¹⁹. Para entender seu mecanismo de ação, experimentos com animais principalmente usando ratos foram realizados. A fixação dos animais durante os procedimentos é fundamental para resultados precisos. Embora muitos estudos tenham administrado eletroacupun...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% alcohol	Shandong Lircon medical technology co., ltd	2002-0059	Disinfection
acupuncture needles	Beijing Luo ya shan chuan medical equipment co., Ltd.		needling
Adult Sprague-Dawley (SD) rats	Liaoning Changsheng biotechnology co., Ltd.	SCXK 2020-0001	The recipient  subjected to fixation
an elevated fixation rack	Taizhou shiai instruments and equipments for scientific and teaching research  Co., ltd	/	Fix rats
Hans electronic acupuncture apparatus	Beijing Huayun Ante Science and Technology Co. Ltd.	HANS-200A	electroacupuncture
Medical cotton ball	Jiangsu Misawa Medical Supplies Co., Ltd.	20172142357	Disinfection
Pet electric clipper	Fenghua Xikou Lubao Knives & Scissors Electrical Appliance Factory	/	Shave the hair of rats
Tweezers	Qingdao Schultz Biotechnology Co., ltd		Pinch cotton balls