Улучшенная фиксация подвески с помощью крысиной куртки в экспериментах с иглоукалыванием на крысах

Резюме

Здесь мы представляем усовершенствованный метод фиксации суспензии с использованием крысиной куртки для эффективного обездвиживания крыс во время экспериментов с иглоукалыванием. Кроме того, выясняется структура и применение этого фиксирующего аппарата, а также инструкции и оценка его использования в электроакупунктурной терапии.

Аннотация

В основных экспериментальных исследованиях иглоукалывания крысы обычно используются в качестве лабораторных животных. Однако им сложно сохранять фиксированную осанку. Во время процедур электроакупунктуры важное значение имеет правильная иммобилизация крыс. В настоящее время используются различные методы фиксации крыс, в том числе наркозная фиксация, высокоплатформенная фиксация, бинтовая фиксация и фиксация самодельной крысиной шубой. Однако эти методы имеют свои ограничения, которые могут в некоторой степени повлиять на эффективность и работоспособность эксперимента. Этот протокол вводит метод подвешивания и фиксации крыс с помощью крысиной одежды. Во-первых, крысы одеты в крысиные куртки, которые соответствуют форме их тела, пользуясь их предпочтением темноты и норы. Операцию по иглоукалыванию можно проводить после того, как крысы наденут крысиную одежду. В подвешенном состоянии крысы относительно неподвижны, так как их конечности не могут двигаться. Этот метод фиксации не только экономичен и удобен в использовании, но и обеспечивает стабильную и надежную фиксацию крыс в удобном расслабленном положении. Это также эффективно минимизирует затраты времени, экспериментального пространства и трудовых ресурсов. Кроме того, этот метод позволяет воздействовать на большинство акупунктурных точек, используемых для иглоукалывания у крыс. В этой статье основное внимание уделяется составу устройства, включающему в себя специально разработанную крысиную оболочку, приподнятую стойку фиксации и их соединительные конструкции. Кроме того, будет представлен наглядный пример, демонстрирующий применение метода фиксации суспензии на основе одежды крыс в процедурах электроакупунктуры у крыс.

Введение

Иглоукалывание - это традиционная терапия, характеризующаяся уколами в определенных акупунктурных точках или других положениях для профилактики и лечения заболеваний. Электроакупунктура сочетает в себе нитевидные иглы с электростимуляцией¹, что позволяет точно контролировать количество стимуляции путем регулировки соответствующих параметров, способствуя стандартизации лечения иглоукалыванием². В последние годы исследования механизмов электроакупунктуры продолжали расширяться и углубляться^3,4, что привело к ежегодному увеличению исследований^, посвященных механизмам электроакупунктуры⁵.

В фундаментальных исследованиях по электроакупунктуре крысы являются наиболее часто используемыми животными. Во время лечения электроакупунктурой реципиент должен оставаться неподвижным, чтобы обеспечить плавную процедуру. В отличие от клинических испытаний на людях, мелкие животные, используемые в экспериментах на животных, не могут сознательно выполнять команды во время 15-30-минутных процедур электроакупунктуры. Это ставит перед исследователями первостепенную задачу достижения стабильной и надежной фиксации. Неправильная фиксация может привести к негативным эмоциям, таким как тревога, депрессия и страх^{у животных,} что не только увеличивает риск травм для крыс и вероятность укуса для экспериментального персонала, но и влияет на стабильность и убедительность результатов исследования.

В предыдущих исследованиях исследователи часто использовали анестезию⁷, высокую платформенную фиксацию⁸, связывающую фиксацию ^6,9 или фиксацию крысиной шерсти¹⁰ перед операциями иглоукалывания или электроакупунктуры. Однако, учитывая воздействие анестезии на организм¹¹ и функции мозга¹², а также учитывая, что иглоукалывание проводится пациентам в сознании в клинических случаях, анестезия может в определенной степени повлиять на результаты исследований. Поэтому, по сравнению с наркозной фиксацией, комфортная фиксация крыс в бодрствующем состоянии является лучшим вариантом.

Однако в неанестезиологическом состоянии различные методы фиксации также имеют свои соответствующие ограничения, в том числе ограниченное воздействие на акупунктурные точки из-за покрытия крысиной шерсти крысами 10, необходимость по меньшей мере двух человек для выполнения операции¹³, нерегулируемый размер фиксатора¹⁴ или стрессовое состояние крыс в вынужденном положении⁶. Чтобы решить эти технические проблемы, мы разработали крысиную оболочку и фиксирующую стойку, подходящую для акупунктурных манипуляций в большинстве частей тела крысы. Это может помочь исследователям эффективно проводить процедуры иглоукалывания на крысах.

Обоснование этого протокола заключается в следующем: во-первых, закрытый головной убор на куртке крысы использует естественную склонность крыс к темноте и рытью нор, тем самым ограничивая диапазон их деятельности. Во-вторых, связывающие веревки возле суставов конечностей крыс обеспечивают физическое сдерживание сжатия, накладывая определенные ограничения на их движения. Тем не менее, крысы по-прежнему способны прыгать и перемещаться горизонтально, даже будучи одетыми в куртку. Наконец, поскольку крысы не могут касаться земли без фиксированной точки силы в подвешенном состоянии, мы добавили устройство фиксации подвески к куртке крысы, еще больше ограничивающее их движения и обеспечивающее удержание иглы. Состав фиксирующего устройства показан на рисунке 1.

Рисунок 1: Принципиальная схема крысиной оболочки и фиксации подвески. (А) Общий вид крысиной куртки в плоском виде. (Б) Трехмерный вид крысиной куртки. (C) Специально сшитая крысиная куртка с разрезом возле акупунктурных точек на голове и пояснице. (D) Иллюстрация нескольких крыс, одновременно подвешенных на приподнятой стойке. 1: Общий вид ткани; 2: Выходное отверстие передней конечности; 3: Выход задней конечности; 4: Веревка для обвязки; 5: Полость, образовавшаяся после наложения швов; 6: Разрез для обнажения акупунктурных точек головы; 7: Разрез для обнажения акупунктурных точек спины и поясницы. 8: Положение шва. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

протокол

Все процедуры, проведенные на крысах в этом исследовании, соответствовали Национальному стандарту благополучия лабораторных животных и руководству по этике (2018 г.), официально принятому Китайской Народной Республикой, и Руководству по уходу и использованию лабораторных животных от Национальной академии США¹⁵. Этот протокол состоит из трех основных этапов. Во-первых, крысиные куртки шьются и подгоняются на основе индивидуальных форм тела крыс с разным весом. Далее проводится акупунктурная манипуляция по стандартным процедурам. Наконец, крысы подвешены в своих куртках, в то время как иглы остаются на месте, чтобы удовлетворить потребность в одновременном вмешательстве среди крыс в одной группе.

1. Подготовка перед иглоукалыванием

1. Изготовление крысиной куртки
   1. Взвесьте крыс и измерьте форму их тела, прежде чем делать им куртки. Чтобы проверить пригодность этого протокола для крыс различной массы, выберите крыс весом 220 г, 300 г, 400 г и 520 г для независимых измерений их телесных размеров, охватывающих измерения от a до f, как показано на рисунке 2.
      Примечание: Корреляция между пропорциями тела крыс и соответствующими им размерами курток также представлена на рисунке 2. Соответствующие параметры длины тела крыс разной массы зафиксированы в таблице 1.
   2. Отрежьте прямоугольный кусок плотной темной ткани, чтобы сделать крысиную куртку. Используйте ткань с развернутой шириной, равной окружности, измеренной вокруг самой толстой части живота крысы. Длина ткани равна расстоянию от кончика носа крысы до основания ее хвоста (см. рисунок 2).
   3. Сложите ткань пополам и отрежьте верхний левый угол под углом примерно 45°-65°, чтобы получилась правая трапеция (см. рисунок 3А).
   4. Плотно сшейте две стороны слева хлопчатобумажной нитью. Обратитесь к Рисунку 1B и Рисунку 3B для получения инструкций.
   5. Вырежьте два небольших отверстия, по одному с каждой стороны ткани, чтобы через них проходили верхние и нижние конечности крысы (см. рисунок 3C). Расстояние между двумя верхними конечностями определяет расстояние между верхними отверстиями крысиной оболочки. Расстояние между двумя нижними конечностями определяет расстояние между нижними отверстиями крысиной оболочки.
   6. Используйте продольное расстояние между подмышкой крысы и передней частью подвздошной кости, чтобы служить расстоянием между верхним и нижним отверстиями крысиной оболочки. Используйте окружность плечевого сустава, чтобы определить окружность верхнего отверстия в крысиной куртке. Используйте обхват тазобедренного сустава для окружности нижнего отверстия в крысиной оболочке.
   7. Рядом с каждым отверстием пришейте длинный матерчатый ремешок, который можно скрестить и плотно обернуть вокруг тела с открывающегося конца куртки, чтобы зафиксировать крысу.
2. Способ ношения крысиной куртки
   1. Наденьте перчатки, прежде чем приступить к одеванию крысы в куртку. Начните с того, что одной рукой возьмитесь за среднюю и заднюю часть крысиной куртки на стол. Другой рукой возьмите хвост крысы из клетки для кормления и аккуратно поместите его в куртку.
   2. По мере того, как крыса движется вперед, ее голова будет доставать до головного убора куртки. В этот момент обеими руками осторожно вытащите его левую и правую верхние конечности из отверстий в куртке.
   3. Возьмите веревку для завязывания с отверстия в конце куртки, перекрещивайте ее слева направо и надежно оберните вокруг туловища крысы. Плотно завяжите его с противоположной стороны ствола, чтобы обеспечить правильную фиксацию. После фиксации верхних конечностей крысы повторите ту же процедуру, чтобы зафиксировать ее нижние конечности.
   4. Примите меры предосторожности, чтобы не быть укушенным или поцарапанным когтями крысы, когда вытаскиваешь ее конечности из отверстий в куртке. Убедитесь, что натяжение веревки отрегулировано надлежащим образом, т. е. не слишком туго, чтобы вызвать локальную ишемию конечностей и гипоксию у крыс, и не слишком свободно, чтобы крыса могла легко вырваться (см. Видео 1).
3. Стойка фиксации и S-образные железные крючки
   1. Стойка для фиксации состоит из двух тяжелых железных лотков (24 см в длину, 12 см в ширину и 2 см в высоту) и железной колонны (60 см в длину), которая прочно приварена к каждому лотку. Закрепите прочную железную палку (длиной 145 см) на одинаковой высоте на двух железных колоннах с помощью конструкции винтового соединения, которую можно регулировать и поддерживать на фиксированной высоте (см. Рисунок 4A).
   2. Для соединения крысы в куртке с железной палкой используйте S-образные крючки (диаметром 11 см). Оберните один конец крючка вокруг ремешка на куртке, а другой конец повесьте на железную палку. Используйте два S-образных крючка, чтобы закрепить крысу на палке. Пожалуйста, обратитесь к рисунку 1D и рисунку 4B для получения общей структуры.

Рисунок 2: Соответствующая диаграмма формы тела крысы и соответствующего размера крысиной куртки. На диаграмме параметр a представляет собой поперечное расстояние в задней части сустава между верхними конечностями и туловищем крысы. Эта величина используется в качестве измерения расстояния между проникающими отверстиями для верхних конечностей крысиной оболочки. Аналогично, параметр b представляет собой поперечное расстояние на спине, где двусторонние нижние конечности крысы соединяются с туловищем. Это измерение определяет расстояние между проникающими отверстиями для нижних конечностей крысиной оболочки. Параметр c обозначает окружность самой толстой части живота крысы, которая может быть использована в качестве измерения ширины ткани оболочки крысы. Параметр d представляет собой расстояние от подмышечной впадины крысы до передней части ее подвздошной кости, определяя продольное расстояние между верхним и нижним отверстиями оболочки. Параметр e соответствует продольному расстоянию от кончика носа крысы до основания ее хвоста, служащего мерой длины ткани куртки крысы. Параметр f обозначает окружность сочленения, соединяющего верхнюю конечность и туловище крысы, служащая окружностью отверстия, через которое проходят верхние конечности. Параметр g представляет собой окружность сустава, соединяющего нижние конечности и туловище крысы, определяя окружность отверстия, через которое проходят нижние конечности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Масса тела (г)	Параметры формы тела (см)
	a	b	c	d	e	f	g
220	6.0	7.0	15.0	8.0	19.0	5.0	7.0
300	7.0	7.5	17.0	10.0	21.0	6.0	8.0
400	8.0	8.5	19.0	11.5	23.0	6.5	9.0
520	8.0	10.0	20.0	12.5	26.0	7.0	9.5

Таблица 1. Приведены результаты измерений параметров формы тела крыс с различной массой тела.

Рисунок 3: Диаграмма, показывающая внешний вид и использование крысиной куртки. (A) Плоский внешний вид крысиной куртки. Форма оболочки крысы напоминает прямоугольную трапецию, с отдельными отверстиями с левой и правой сторон для прохождения верхних и нижних конечностей крысы. (B) Вид крысиной куртки в разложенном виде. Закрытие головного убора создает полузакрытую полость, которая служит важным компонентом для привлечения крыс внутрь. (C) Вид сбоку на крысу, одетую в куртку. Как только конечности крысы проходят через отверстия в одежде, ремни скрещиваются над брюшной поверхностью туловища и надежно закрепляются сзади с соответствующим натяжением. Это гарантирует, что крыса будет относительно обездвижена. (D) Вид брюшной полости крысы, одетой в крысиную куртку. Вентральная поверхность куртки обнажает кожу живота крысы, обеспечивая удобный доступ для иглоукалывания в вентральных точках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Надеваем крысиную куртку. В этом видео показан типичный процесс одевания крысы в куртку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Рисунок 4: Схема, показывающая внешний вид и использование приподнятой стойки фиксации. (A) Приподнятая стойка фиксации. Этот стеллаж состоит в основном из двух вертикальных железных колонн (60 см в длину), приваренных к каждому лотку, а также длинной горизонтальной железной палки (длиной 145 см), расположенной параллельно земле. Саморезы используются для крепления горизонтальной палки на той же высоте, что и вертикальные колонны. (B) Крысиный подвес на стойке фиксации. Крысы, одетые в крысиные куртки, надежно крепятся к стойке фиксации с помощью двух S-образных крючков на крысу. (C) Одновременное лечение электроакупунктурой у нескольких крыс. Чтобы предотвратить любые потенциальные помехи, возникающие в результате движения хвоста, необходимо было поддерживать надлежащее расстояние между крысами, эквивалентное длине хвоста крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

2. Процедура электроакупунктуры

1. Рутинная подготовка
   1. Установите стойку фиксации на горизонтальный рабочий стол или грунт.
   2. Перед процедурой иглоукалывания удалите шерсть вокруг акупунктурных точек с помощью электробритвы, чтобы обеспечить полное обнажение. Когда акупунктурная точка, подлежащая проколу, расположена на животе крысы, например, Гуаньюань (CV4, примерно на 25 мм ниже пупка), соответственно укоротите ширину одежды крысы, чтобы обнажить акупунктурные точки живота.
   3. Найдите акупунктурную точку из щели на средней линии живота, которая не закрыта крысиной оболочкой (см. рисунок 3D), а затем введите иглу.
   4. Когда акупунктурные точки, подлежащие проколу, находятся на голове крысы, такие как Байхуэй (GV20, расположенная в середине теменной кости), сделайте небольшой разрез в соответствующем месте на голове, чтобы полностью обнажить кожу вокруг GV20 (см. рис. 1C).
   5. При иглоукалывании акупунктурных точек на конечностях крыс, таких как Нэйгуань (ПК6, на внутренней стороне передней конечности, между лучевыми и локтевыми швами на расстоянии около 3 мм от лучезапястного сустава) в верхней конечности или Зусанли (ST36, на задней боковой стороне коленного сустава, примерно на 2 мм ниже головки малоберцовой кости) в нижней конечности, Из-за очевидного воздействия акупунктурных точек используйте одну руку для помощи в фиксации конечности, в то время как другая может непосредственно выполнять операцию иглоукалывания.
   6. Когда акупунктурная точка расположена на спине или талии крысы, например, Шэньшу (BL23, ниже 2-го поясничного позвонка, на расстоянии 6 мм от средней линии спины), вырежьте отверстие шириной примерно 2 см в центре оболочки крысы, чтобы полностью обнажить кожу соответствующего участка (см. рисунок 1C).
   7. Оденьте крысу в куртку. Продезинфицировав местную кожу акупунктурных точек спиртовыми тампонами, приступают к процедуре иглоукалывания.
2. Техника иглоукалывания: Точно определите местоположение акупунктурной точки. Введите стерильную одноразовую акупунктурную иглу (0,16 мм x 7 мм) в акупунктурную точку крысы на соответствующую глубину.
3. Электроакупунктура
   1. Оберните электродную проволоку вокруг горизонтального железного стержня. Этот шаг снижает риск выпадения иглы из-за гравитационной силы, действующей на зажим для электроакупунктуры. Затем надежно прикрепите конец электродной проволоки к ручке иглы.
   2. Включите питание и выберите подходящие параметры частоты, тока и времени. В этом эксперименте параметры были установлены на 2 Гц, 1 мА и 15 мин. После настройки параметров приступайте к процессу электроакупунктурного лечения (см. Видео 2 и Видео 3).
   3. Одновременная электроакупунктура на крысах: Во время лечения подвешивайте крыс в одной группе вместе на железной палке с помощью S-образных крючков и дайте им одновременно подвергнуться электроакупунктурному вмешательству.
   4. ПРИМЕЧАНИЕ: Железная палка должна быть не только прочной, но и достаточно длинной, чтобы лечить группу крыс одновременно. В этом эксперименте, обеспечивая соответствующее расстояние между крысами и отсутствие интерференции между крысами, можно лечить 3-4 крыс одновременно (см. рис. 4C).
4. Наблюдение за реакцией крыс во время лечения электроакупунктурой: Оцените пригодность этого метода фиксации для электроакупунктуры у крыс на основе следующих факторов, таких как количество персонала, необходимого для завершения операции, время, затраченное на фиксацию крысы, реакция крыс во время лечения электроакупунктурой, количество игл, брошенных во время процедуры, и любые случайные смерти, которые могут произойти во время операции.
5. Удаление игл
   1. По истечении заданного времени аппарат для электроакупунктуры автоматически отключится. Снимите небольшой зажим, который соединен с ручкой иглы, и осторожно извлеките акупунктурную иглу из-под кожи крысы, тем самым завершив процесс лечения электроакупунктурой.
   2. Ослабьте ремни, поднимите головной чехол куртки крысы и расположите крысу над клеткой. После этого крыса сможет освободиться от куртки и самостоятельно войти в клетку (см. Видео 4).

Видео 2. Иглоукалывание акупунктурных точек в поясничном отделе. В этом видео демонстрируется комплексная и последовательная процедура, включающая в себя одевание крысы в куртку, введение акупунктурных игл в акупунктурные точки на талии и последующее подключение аппарата для электроакупунктуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Видео 3. Иглоукалывание акупунктурных точек в области живота и нижних конечностей. В этом видео демонстрируется комплексная и последовательная процедура, включающая в себя одевание крысы в куртку, введение акупунктурных игл в акупунктурные точки, расположенные в брюшной полости и нижней конечности, и последующее подключение электроакупунктурного аппарата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Видео 4. Снимаем крысиную оболочку. В этом видео демонстрируется привычная практика снятия куртки с крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Результаты

В данном эксперименте для лечения электроакупунктурой было отобрано в общей сложности 12 крыс и наблюдались их реакции при методе фиксации (как показано в таблице 2). Среди 12 крыс только 1 крыса демонстрировала интенсивную борьбу в течение 15-минутного периода удержания иглы эле?...

Обсуждение

Было показано, что электроакупунктура оказывает хорошее терапевтическое воздействие при различных заболеваниях, таких как когнитивные нарушения 16,17^, повреждение миокарда¹⁸ и воспалительная боль¹⁹. Чтобы понять механизм его дей?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% alcohol	Shandong Lircon medical technology co., ltd	2002-0059	Disinfection
acupuncture needles	Beijing Luo ya shan chuan medical equipment co., Ltd.		needling
Adult Sprague-Dawley (SD) rats	Liaoning Changsheng biotechnology co., Ltd.	SCXK 2020-0001	The recipient  subjected to fixation
an elevated fixation rack	Taizhou shiai instruments and equipments for scientific and teaching research  Co., ltd	/	Fix rats
Hans electronic acupuncture apparatus	Beijing Huayun Ante Science and Technology Co. Ltd.	HANS-200A	electroacupuncture
Medical cotton ball	Jiangsu Misawa Medical Supplies Co., Ltd.	20172142357	Disinfection
Pet electric clipper	Fenghua Xikou Lubao Knives & Scissors Electrical Appliance Factory	/	Shave the hair of rats
Tweezers	Qingdao Schultz Biotechnology Co., ltd		Pinch cotton balls