Modelado celular mediante la estrategia de Arquímedes magnético

Resumen

Este protocolo describe un método de modelado de celdas de alto rendimiento sin tinta, sin etiquetas, independiente del sustrato y basado en el efecto de Arquímedes magnético.

Resumen

El patrón celular, que permite un control preciso del posicionamiento celular, presenta una ventaja única en el estudio del comportamiento celular. En este protocolo, se introduce una estrategia de modelado celular basada en el efecto Magnético-Arquímedes (Mag-Arch). Este enfoque permite un control preciso de la distribución celular sin el uso de materiales de tinta o partículas de etiquetado. Mediante la introducción de un reactivo paramagnético para mejorar la susceptibilidad magnética del medio de cultivo celular, las células son repelidas por los imanes y se organizan en un patrón complementario a los conjuntos de imanes colocados debajo del sustrato microfluídico.

En este artículo, se proporcionan procedimientos detallados para el modelado de celdas utilizando la estrategia basada en Mag-Arch. Se ofrecen métodos para modelar tipos de células individuales, así como múltiples tipos de células para experimentos de cocultivo. Además, se proporcionan instrucciones completas para la fabricación de dispositivos microfluídicos que contienen canales para el modelado celular. Lograr esta característica utilizando métodos paralelos es un desafío, pero se puede hacer de una manera simplificada y rentable. El empleo de patrones celulares basados en Mag-Arch equipa a los investigadores con una poderosa herramienta para la investigación in vitro .

Introducción

El modelado celular se está convirtiendo en una tecnología intuitiva y potente para estudios in vitro ¹. Al manipular las posiciones celulares en las placas de cultivo, proporciona soluciones para una variedad de experimentos, incluida la migración celular², el cocultivo multicelular biomimético³, el ensamblaje de organoides⁴, los estudios de biomateriales⁵ y más. En la mayoría de las situaciones, se prefiere un método sin tinta ni etiquetas para el modelado de celdas porque ofrece facilidad de operación y alta viabilidad de celdas para investigaciones posteriores.

El efecto Mag-Arch es un fenómeno físico en el que los objetos diamagnéticos en líquidos paramagnéticos tienden a moverse hacia regiones^{con campos} magnéticos débiles. Las células vivas son diamagnéticas por naturaleza, mientras que los medios de cultivo celular pueden hacerse paramagnéticos mediante la adición de elementos paramagnéticos solubles, como la gadopentetato dimeglumina (Gd-DTPA), comúnmente utilizada por vía intravenosa en imágenes de resonancia magnética nuclear como agente de contraste⁷. En consecuencia, se espera que las células sean repelidas por el medio paramagnético circundante y se muevan hacia regiones donde los campos magnéticos^{son más} débiles. Se puede generar fácilmente un campo magnético estampado utilizando un conjunto de imanes de neodimio. Idealmente, los patrones celulares se ensamblan en oposición a los patrones magnéticos. Técnicamente, esto se define como un método sin marcaje porque el único reactivo adicional, Gd-DTPA, permanece en el entorno extracelular y no se une a las células. Por lo tanto, las posibles influencias en el cultivo celular posterior pueden evitarse fácilmente sustituyendo el medio de cultivo. En comparación con otros métodos 1,3,9,10^, la estrategia basada en Mag-Arch no requiere componentes de biotinta ni la aplicación de partículas específicas para etiquetar positivamente las células. Además, se ha demostrado que funciona en múltiples sustratos para la adhesión celular y es capaz de crear patrones celulares de alto rendimiento⁴.

Este artículo presenta un protocolo detallado para el patrón de celdas utilizando el método basado en Mag-Arch, que cubre todo, desde la fabricación del dispositivo hasta el ajuste del patrón de celdas. Además de los patrones que hemos demostrado, los usuarios pueden crear fácilmente varios patrones celulares utilizando imanes y una solución Gd-DTPA. Además, también se proporcionan protocolos para ensamblar patrones complejos de cocultivo y manipular células en chips microfluídicos cerrados.

Protocolo

1. Montaje de los juegos de imanes

1. Ensamble los juegos de imanes para patrones de tiras.
   1. Elija imanes rectangulares planos, como se muestra en la Figura 1A. Las dimensiones de los imanes rectangulares utilizados para esta demostración son de 1,5 mm × 10 mm × 35 mm (espesor × altura × longitud) (ver Tabla de materiales). El grosor de los imanes determina los espacios entre las franjas celulares.
   2. Corte placas de silicona de 2 mm de grosor (consulte la tabla de materiales) en rectángulos de 2 mm × 8 mm × 30 mm. Asegúrese de que las dos últimas dimensiones de estas placas de silicona sean ligeramente más pequeñas que las de los imanes rectangulares mencionados anteriormente para optimizar el montaje. El grosor de las placas de silicona determina el ancho de las franjas celulares.
   3. Ensamble los imanes rectangulares y las placas de silicona capa por capa, como se ilustra en la Figura 1A. Cada juego de imanes consta de 4 imanes y 3 placas de silicona. Asegúrese de que los polos de cada imán adyacente estén opuestos para que los conjuntos de imanes puedan alinearse automáticamente debido a la fuerza de atracción intrínseca.
   4. Esterilice los imanes antes de usarlos.
      NOTA: Se recomienda lavar los juegos de imanes con agua pura y luego sumergirlos en etanol al 75% durante 10 min. Las dimensiones totales de estos juegos de imanes son de 12 mm × 10 mm × 35 mm, diseñados para adaptarse a placas de cultivo celular estándar de 6 pocillos.
2. Ensamble los juegos de imanes para patrones de matriz de puntos
   1. Elija imanes cilíndricos en miniatura, como se muestra en la Figura 1B. Las dimensiones de los imanes cilíndricos utilizados para esta demostración son Φ1,5 mm × 10 mm (diámetro × altura), magnetizados en la dirección axial.
   2. Ensamble los imanes cilíndricos como se indica en la Figura 1B. Asegúrese de que cada juego de imanes conste de 36 imanes cilíndricos dispuestos en una cuadrícula de 6 × 6. Además, asegúrese de que los polos de cada imán adyacente estén opuestos para permitir que los conjuntos de imanes se alineen automáticamente debido a la fuerza de atracción intrínseca.
   3. Esterilice los imanes antes de su uso, siguiendo el mismo procedimiento que en el paso 1.1.4. Las dimensiones totales de estos juegos de imanes son de 9 mm × 10 mm × 9 mm, diseñados para adaptarse a placas de cultivo celular estándar de 6 pocillos.

2. Patrón de celdas en portaobjetos de vidrio

1. Prepare el dispositivo de cultivo celular.
   1. Utiliza placas de silicona de 2 mm de grosor para crear moldes de silicona. Emplea una perforadora para crear un agujero rectangular de 1 cm × 1 cm en la placa. Recorta la placa de silicona alrededor del orificio para crear un molde redondo (diámetro = 25 mm) con el orificio en el centro, como se muestra en la Figura 1C.
   2. Limpie a fondo los moldes de silicona con un limpiador ultrasónico. Esterilice los moldes lavándolos con agua pura durante 10 minutos, luego reemplace el agua con etanol al 75% durante otros 10 minutos. Finalmente, seque los moldes en una caja esterilizadora a 65 °C durante 60 min.
   3. Coloque el molde de silicona esterilizado en un portaobjetos redondo de celda de vidrio de Φ25 mm y presiónelo suavemente para que la silicona se adhiera al vidrio, como se muestra en la Figura 1C. El dispositivo de cultivo celular resultante tendrá una parte inferior de vidrio y una cavidad de cultivo de 200 μL. Las dimensiones del dispositivo son Φ25 mm × 2,15 mm, lo que lo hace adecuado para placas de cultivo celular estándar de 6 pocillos.
      NOTA: El dispositivo de cultivo celular descrito anteriormente se puede reemplazar con otras placas de Petri con la parte inferior más delgada que 0,5 mm, como las placas confocal.
   4. Coloque los juegos de imanes en una placa de 6 pocillos. Se recomiendan pinzas no magnéticas para facilitar la operación.
      NOTA: Todos los pasos posteriores deben realizarse en condiciones estériles a partir de este momento hasta la observación de los patrones celulares.
   5. Coloque el dispositivo de cultivo celular en la parte superior del conjunto de imanes en el pocillo de la placa de 6 pocillos. Asegúrese de que el dispositivo de cultivo celular esté colocado horizontalmente y que la parte inferior esté en estrecho contacto con el conjunto de imanes.
2. Preparar el medio de cultivo celular que contiene Gd-DTPA
   1. Preparar la inyección de Gd-DTPA disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales), generalmente con una concentración de 500 mM. Diluir la inyección añadiendo 30 μL de inyección de Gd-DTPA a 470 μL de medio de cultivo celular completo para alcanzar una concentración objetivo de 30 mM.
      NOTA: Dependiendo de las regulaciones locales y la disponibilidad, otros agentes de contraste a base de gadolinio (GBCA) con la misma concentración objetivo pueden producir resultados similares¹¹.
3. Cree los patrones de celda.
   1. Recolecta células para crear patrones. En esta demostración, se utilizaron células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs, ver Tabla de Materiales) para el modelado (Figura 2). Centrifugar las células durante 5 min a 200 x g (a temperatura ambiente) para recogerlas de la suspensión y resuspenderlas en el medio que contiene Gd-DTPA. Cuente la densidad de celdas.
   2. Ajuste la densidad celular a aproximadamente ~ 2 × 10⁵ células/ml con medio que contenga Gd-DTPA. Mezcle suavemente la suspensión celular y agregue 200 μL a la cavidad de cada molde de cultivo celular para crear una superficie líquida llena de borde.
   3. Transfiera con cuidado la placa a una incubadora de cultivo celular e incube durante 3-6 h hasta que las células se adhieran bien al sustrato. Evite cerrar la puerta de la incubadora para evitar interferencias con el ensamblaje de los patrones celulares. Para las células con bajas tasas de adhesión, el tratamiento nocturno con GBCA es generalmente seguro¹².
   4. El patrón celular se considera completo cuando las células se adhieren al fondo de la cavidad del dispositivo de cultivo celular. Reemplace el medio que contiene Gd-DTPA por un medio de cultivo completo.
   5. Retire el dispositivo de cultivo celular del juego de imanes. Se puede observar el patrón celular inmediatamente o transferir el dispositivo a una nueva placa de cultivo para su posterior cultivo.

3. Patrón de co-cultivo por imán lateral: fabricación de la plantilla móvil

NOTA: El siguiente procedimiento se presenta para aprovechar el patrón de celdas basado en Mag-Arch y explorar la posibilidad de más aplicaciones.

1. Prepare el dispositivo para el patrón de celda de rayas siguiendo los pasos 1 y 2. Sin embargo, reduzca la densidad celular a 1 × 10⁵ células/ml y reemplace las placas de silicona que separan los imanes por otras más delgadas, haciendo que cada patrón de células de rayas sea más delgado.
   NOTA: Esto proporciona un área suficiente para colocar varias celdas en patrones de rayas. Como referencia, sugerimos usar placas de silicona de 1 mm en lugar de 2 mm para separar los imanes.
2. Modele el primer tipo de celdas como se ilustra en los pasos 2.2-2.3. Este paso también requiere de 3 a 6 h para la fijación de la célula.
   NOTA: Para distinguir los diferentes tipos de células en el sistema de cocultivo, los usuarios pueden etiquetar las células con colorantes fluorescentes como DiI, DiD o rastreadores celulares (CMTPX, CMFDA, CMAC, etc.) antes de crear patrones. Por ejemplo, para la tinción de DiI y DiD, agregue 1 μL de la solución madre (10 mM) (ver Tabla de Materiales) por 1 mL de medio libre de FBS y mezcle bien para obtener una solución de trabajo. Reemplace el medio de cultivo con la solución de trabajo para cubrir las células adheridas. Después de incubar durante 30 minutos y lavar con PBS tres veces, proceda con la recolección de células.
3. Después de modelar el primer tipo de células, mueva el dispositivo de cultivo celular 1 mm desde los imanes de abajo hacia la derecha, como se ilustra en la Figura 3Aii.
4. Lave suavemente los portaobjetos de vidrio con 200 μL de PBS dos veces. Evite dejar que los portaobjetos se sequen.
5. Modele el segundo tipo de celdas de la misma manera que se ilustra en los pasos 2.2-2.3.
6. Mueva el dispositivo de cultivo celular 1 mm de los imanes de abajo hacia la derecha, como se ilustra en la Figura 3Aiii, y vuelva a lavar los portaobjetos de vidrio con 200 μL de PBS. Modele el tercer tipo de celdas de la misma manera que se ilustra en los pasos 2.2-2.3.
7. Después de modelar todos los tipos de células, lave suavemente los portaobjetos de vidrio con 200 μL de PBS dos veces y reemplácelos con medio de cultivo celular completo.
8. Retire el dispositivo de cultivo celular del juego de imanes. A continuación, se puede observar el patrón celular o transferir el dispositivo a una nueva placa de cultivo para su posterior cultivo.

4. Patrón de cocultivo mediante el ajuste de la concentración de Gd-DTPA

NOTA: Los GBCA no afectan significativamente la adhesión celular o el crecimiento posterior a concentraciones de trabajo (≤75 mM). Además, los patrones celulares están influenciados por la concentración de Gd-DTPA: concentraciones más altas dan como resultado patrones celulares más pequeños/delgados. Por lo tanto, es posible crear sistemas de cocultivo simplemente ajustando la concentración de Gd-DTPA. En este ejemplo se muestra la creación de patrones de matrices circulares concéntricas.

1. Modele el primer tipo de celdas como se ilustra en los pasos 2.2-2.3 utilizando imanes cilíndricos en miniatura del paso 1.2. Etiquete las células con colorantes fluorescentes como DiI, DiD o rastreadores celulares (consulte el paso 3) antes de cosecharlas para distinguir los diferentes tipos de células en el sistema de cocultivo.
   NOTA: Se necesitará una concentración más alta de Gd-DTPA (50 mM en lugar de 30 mM) y una densidad celular más baja, aproximadamente 1 × 10⁵ células/mL.
2. Después de modelar el primer arreglo de células, lave suavemente los portaobjetos de vidrio con 200 μL de PBS dos veces. Evite que los portaobjetos se sequen.
3. Modele el segundo tipo de celdas siguiendo el mismo procedimiento que antes. Mantenga las correderas de vidrio relativamente inmóviles sobre los imanes para evitar que se disloquen. Se recomienda colocar una placa de silicona con un hueco que se ajuste a los juegos de imanes a la superficie inferior del portaobjetos de vidrio.
   NOTA: Aquí, se necesitará una concentración más baja de Gd-DTPA (20 mM en lugar de 30 mM) para que se espere que los patrones de la segunda célula sean más grandes que los primeros, como se ilustra en la Figura 3B.
4. Después de modelar todos los tipos de células, lave suavemente los portaobjetos de vidrio con 200 μL de PBS dos veces y reemplace el medio con un medio de cultivo celular completo.
5. Retire el dispositivo de cultivo celular del juego de imanes. A continuación, se puede observar el patrón celular o transferir el dispositivo a una nueva placa de cultivo para su posterior cultivo.

5. Patrón celular en chip microfluídico

NOTA: Se ha demostrado que el método basado en Mag-Arch funciona en cámaras estrechas cerradas en nuestro estudio anterior⁸. A continuación, se muestra un ejemplo de modelado de matrices de puntos en un canal microfluídico.

1. Fabricación del chip de microfluido
   1. Personalice moldes de politetrafluoroetileno (PTFE) de 40 mm × 75 mm × 20 mm (consulte la Tabla de materiales) que contengan una cavidad rectangular de 24 mm × 50 mm × 8 mm, como se ilustra en la Figura 4A.
   2. Aplana una placa de silicona de 0,5 mm de grosor. Corte las placas de silicona de acuerdo con la forma del canal de fluido, que tiene una cavidad rectangular de 15 mm × 20 mm × 0,5 mm con áreas de amortiguación triangulares tanto en el lado de entrada como en el de salida, como se ilustra en la Figura 4A, B.
   3. Personaliza placas de vidrio rectangulares de 40 mm × 75 mm. Limpie las placas de vidrio con plasma de aire durante 30 s.
   4. Inmediatamente después de la limpieza con plasma de aire, cubra las placas de vidrio con 0,5 ml de un tampón antiadherente disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales) y déjelas secar al aire. Lave las placas de vidrio una vez con etanol y déjelas secar al aire.
   5. Fije una placa de silicona preparada en el paso 5.1.2 de forma segura al centro de una placa de vidrio, como se ilustra en la Figura 4A.
   6. Prepare el prepolímero de polidimetilsiloxano (PDMS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Para cada chip PDMS, pesar 10 g del componente base y 1 g del agente reafirmante en un tubo de centrífuga de 50 ml.
   7. Mezcle bien los agentes con una varilla de vidrio hasta que las pequeñas burbujas se distribuyan uniformemente en el coloide. La mezcla dura de 5 a 10 minutos, dependiendo del volumen del coloide. Centrifugar el prepolímero coloidal durante 1 min a 500 x g (a temperatura ambiente) para eliminar las burbujas.
   8. Vierta lentamente ~ 10 ml del prepolímero en la cavidad para llenar el molde de PTFE.
   9. Coloque con cuidado el molde en un depósito de vacío y manténgalo horizontal para evitar que el prepolímero fluya.
   10. Elimine las burbujas de aire residuales del prepolímero con una bomba de vacío. La aspiración dura entre 120 y 180 minutos.
   11. Si es necesario, vierta más prepolímero para llenar aún más la cavidad del molde. Aspire durante otros 60 minutos.
   12. Cubra con cuidado el molde de PTFE con la placa de vidrio, con el lado de sílice hacia la cavidad, como se ilustra en la Figura 4Bi.
   13. Asegúrese de eliminar todas las burbujas. Transfiera el molde a un horno de secado a 60 °C para que el prepolímero se solidifique durante la noche.
   14. Retira el molde del horno. Después de enfriar, desmoldar la cubierta de PDMS solidificada con cuidado. Cree una entrada y una salida con una perforadora de agujas de Φ1 mm.
   15. Lave la cubierta del PDMS y las correderas de la cubierta de 24 mm × 50 mm de acuerdo con el paso 2.1.2.
       NOTA: Continúe con los siguientes pasos en condiciones estériles.
   16. Coloque una cubierta de PDMS y una corredera de cubierta para crear un chip de microfluido que contenga un canal de flujo de aproximadamente ~500 μm de altura. La parte inferior debe consistir en una diapositiva de cubierta de vidrio de ~ 0,15 mm para permitir el patrón de celdas con la estrategia basada en Mag-Arch.
2. Ensamble los adaptadores estériles disponibles en el mercado tanto en la entrada como en la salida del chip de microfluido⁸.
3. Prepare un tampón de recubrimiento de gelatina al 2% (p/v, disuelto en PBS). Esterilice el tampón esterilizándolo en autoclave.
4. Inyecte el tampón de recubrimiento de gelatina en el chip a través del adaptador de entrada con una jeringa de 1 ml. Si surgen burbujas, enjuáguelas con un tampón de recubrimiento adicional.
5. Coloque el chip en una placa de cultivo celular de 10 cm. Agregue 1 ml de PBS alrededor del fondo del plato para evitar que se seque. Transfiera la placa a una incubadora de cultivos celulares. El recubrimiento tarda 30 min.
6. Enjuague el tampón de recubrimiento con 2 ml de medio contenido de Gd (30 mM) a través de la entrada.
7. Inyecte suavemente 1 ml de suspensión celular que contenga 30 mM de Gd-DTPA con una jeringa de 1 ml.
8. Modele las celdas como se ilustra en los pasos 2.2-2.3 utilizando imanes cilíndricos en miniatura del paso 1.2.
   NOTA: Sin embargo, se recomienda colocar una placa de silicona con un hueco que se ajuste a los juegos de imanes a la superficie inferior del portaobjetos de vidrio, como se muestra en la Figura 4Ci.
9. Después de modelar, refresque suavemente el medio contenido en Gd-DTPA con 1 ml de medio completo enjuagando con una jeringa de 1 ml.
   NOTA: El proceso de modelado celular en microfluídica, de los pasos 5.7-5.9, toma aproximadamente 180 minutos, que es similar al patrón celular en portaobjetos de vidrio estándar.
10. Cuantifique los patrones bajo un microscopio. Si es necesario, conecte el chip de microfluido a un dispositivo de cultivo circulante para su posterior cultivo.
    NOTA: En nuestra experiencia, las células son capaces de crecer durante al menos 72 h cuando se apoyan en un dispositivo simple basado en microbombas, que proporciona a la microfluídica un flujo continuo de medio de cultivo fresco en una incubadora celular⁸.

Resultados

Se seleccionaron imanes rectangulares (1,5 mm × 10 mm × 35 mm) y cilíndricos (Φ1,5 m × 10 mm) para crear patrones celulares como demostración. Los usuarios tienen la flexibilidad de modificar el tamaño y la forma de los imanes o ensamblarlos de manera diferente para crear diversos patrones de celdas. En la Figura 1A, B, se ensamblaron los imanes, con los polos magnéticos representados en azul (sur) y rojo (norte) para mayor claridad. En esta configuración, los imane...

Discusión

El patrón celular basado en Mag-Arch proporciona una solución fácil de usar para la mayoría de los laboratorios biomédicos. Este método avanza en paralelo a los caracteres sin tinta, sin etiquetas, independientes del sustrato y la capacidad de crear patrones de alto rendimiento ^8,13. Para el patrón de celdas de un solo tipo, crea patrones de celdas en un solo paso. El procedimiento finaliza simplemente refrescando los medios de cultivo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2780 ovarian cancer cells	Procell	CL-0013
Cell culture medium (DMEM, high glucose)	Gibco	11995040
Cover slides	Citotest Scientific	80340-3610	For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm
DiD	MedChemExpress (MCE)	HY-D1028	For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm)
DiI	MedChemExpress (MCE)	HY-D0083	For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochannel	BC-SE-FBS07
Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA)	Beijing Beilu Pharmaceutical	H10860002
Gelatin	Sigma Aldrich	V900863
Glass cell slides	Citotest Scientific	80346-2510	Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm
Glass plates	PURESHI hardware store		For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)	Servicebio	STCC12103G-1
Neodymium-iron-boron magnets (N52)	Lalaci
Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution)	Lonza	1049286	For convenience of demolding when fabricating microfluidics
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Servicebio	G4200
Plasma cleaner	SANHOPTT	PT-2S
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	DOWSIL	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	For fabricating microfluidics
Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold	PURESHI hardware store		Customized online, for fabricating microfluidics
Silicon plate	PURESHI hardware store
Smooth Muscle Cells (SMC)	Procell	CL-0517
Ultrasonic cleaner	Sapeen	CSA-02