Manyetik-Arşimet Stratejisini Kullanarak Hücre Modellemesi

Özet

Bu protokol, Manyetik Arşimet etkisine dayalı mürekkepsiz, etiketsiz, substrattan bağımsız, yüksek verimli bir hücre desenleme yöntemini açıklar.

Özet

Hücre konumlandırmasının hassas kontrolüne izin veren hücre modellemesi, hücre davranışının incelenmesinde benzersiz bir avantaj sunar. Bu protokolde, Manyetik-Arşimet (Mag-Arch) etkisine dayalı bir hücre modelleme stratejisi tanıtılmaktadır. Bu yaklaşım, mürekkep malzemeleri veya etiketleme parçacıkları kullanılmadan hücre dağılımının hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar. Hücre kültürü ortamının manyetik duyarlılığını arttırmak için bir paramanyetik reaktif ekleyerek, hücreler mıknatıslar tarafından itilir ve kendilerini mikroakışkan substratın altına yerleştirilmiş mıknatıs setlerini tamamlayıcı bir desen halinde düzenler.

Bu makalede, Mag-Arch tabanlı stratejiyi kullanarak hücre modellemesi için ayrıntılı prosedürler sağlanmıştır. Tek hücreli tiplerin yanı sıra ko-kültür deneyleri için çoklu hücre tiplerini modelleme yöntemleri sunulmaktadır. Ek olarak, hücre modellemesi için kanallar içeren mikroakışkan cihazların imalatı için kapsamlı talimatlar sağlanmıştır. Paralel yöntemler kullanarak bu özelliği elde etmek zordur ancak basitleştirilmiş ve uygun maliyetli bir şekilde yapılabilir. Mag-Arch tabanlı hücre modellemesinin kullanılması, araştırmacıları in vitro araştırmalar için güçlü bir araçla donatır.

Giriş

Hücre modelleme, in vitro çalışmalar için sezgisel ve güçlü bir teknolojiye dönüşüyor¹. Kültür plakalarındaki hücre konumlarını manipüle ederek, hücre göçü², biyomimetik çok hücreli ko-kültür³, organoid montajı⁴, biyomateryal çalışmaları⁵ ve daha fazlası dahil olmak üzere çeşitli deneyler için çözümler sunar. Çoğu durumda, hücre desenleme için mürekkepsiz, etiketsiz bir yöntem tercih edilir, çünkü sonraki araştırmalar için kullanım kolaylığı ve yüksek hücre canlılığı sunar.

Mag-Arch etkisi, paramanyetik sıvılardaki diyamanyetik nesnelerin zayıf manyetik alanlara sahip bölgelere doğru hareket etme eğiliminde olduğu fiziksel bir olgudur⁶. Canlı hücreler doğal olarak diyamanyetiktir, hücre kültürü ortamı ise kontrast madde olarak nükleer manyetik rezonans görüntülemede intravenöz olarak yaygın olarak kullanılan gadopentetat dimeglumin (Gd-DTPA) gibi çözünür paramanyetik elementler eklenerek paramanyetik hale getirilebilir⁷. Sonuç olarak, hücrelerin çevredeki paramanyetik ortam tarafından itilmesi ve manyetik alanların daha zayıf olduğu bölgelere doğru hareket etmesi beklenir⁸. Desenli bir manyetik alan, bir dizi neodimyum mıknatıs kullanılarak kolayca oluşturulabilir. İdeal olarak, hücre desenleri mıknatıs desenlerine zıt olarak birleştirilir. Teknik olarak bu, etiketsiz bir yöntem olarak tanımlanır, çünkü tek ek reaktif olan Gd-DTPA, hücre dışı ortamda kalır ve hücrelere bağlanmaz. Böylece, sonraki hücre kültürü üzerindeki potansiyel etkiler, kültür ortamının değiştirilmesiyle kolayca önlenebilir. Diğer yöntemlerle ^{karşılaştırıldığında} 1,3,9,10, Mag-Arch tabanlı strateji^, hücreleri pozitif olarak etiketlemek için biyo-mürekkep bileşenleri veya belirli parçacıkların uygulanmasını gerektirmez. Ayrıca, hücre yapışması için birden fazla substrat üzerinde çalıştığı ve yüksek verimli hücre modelleme yeteneğine sahip olduğu^{gösterilmiştir 4}.

Bu makale, cihaz imalatından hücre modelinin ayarlanmasına kadar her şeyi kapsayan, Mag-Arch tabanlı yöntemi kullanarak hücre modellemesi için ayrıntılı bir protokol sunar. Gösterdiğimiz desenlere ek olarak, kullanıcılar mıknatıslar ve Gd-DTPA çözümü kullanarak kolayca çeşitli hücre desenleri oluşturabilirler. Ayrıca, karmaşık ko-kültür kalıplarının birleştirilmesi ve kapalı mikroakışkan çiplerde hücrelerin manipüle edilmesi için protokoller de sağlanmaktadır.

Protokol

1. Mıknatıs setlerinin montajı

1. Şerit desenleri için mıknatıs setlerini birleştirin.
   1. Şekil 1A'da gösterildiği gibi düz dikdörtgen mıknatıslar seçin. Bu gösteri için kullanılan dikdörtgen mıknatısların boyutları 1,5 mm × 10 mm × 35 mm'dir (kalınlık × yükseklik × uzunluk) (bkz. Mıknatısların kalınlığı, hücre şeritleri arasındaki boşlukları belirler.
   2. 2 mm kalınlığındaki silikon plakaları (Malzeme Tablosuna bakın) 2 mm × 8 mm × 30 mm dikdörtgenler halinde kesin. Montajı optimize etmek için bu silikon plakaların son iki boyutunun yukarıda belirtilen dikdörtgen mıknatıslarınkinden biraz daha küçük olduğundan emin olun. Silikon plakaların kalınlığı, hücre şeritlerinin genişliğini belirler.
   3. Dikdörtgen mıknatısları ve silikon plakaları Şekil 1A'da gösterildiği gibi katman katman birleştirin. Her bir mıknatıs seti 4 adet mıknatıs ve 3 adet silikon plakadan oluşmaktadır. Mıknatıs setlerinin içsel çekici kuvvet nedeniyle otomatik olarak hizalanabilmesi için her bir bitişik mıknatısın kutuplarının zıt olduğundan emin olun.
   4. Kullanmadan önce mıknatısları sterilize edin.
      NOT: Mıknatıs setlerinin saf su ile yıkanması ve ardından 10 dakika boyunca %75 etanole batırılması tavsiye edilir. Bu mıknatıs setlerinin genel boyutları 12 mm × 10 mm × 35 mm'dir ve standart 6 oyuklu hücre kültürü plakalarına uyacak şekilde tasarlanmıştır.
2. Nokta dizisi desenleri için mıknatıs setlerini birleştirin
   1. Şekil 1B'de gösterildiği gibi minyatür silindirik mıknatısları seçin. Bu gösteri için kullanılan silindirik mıknatısların boyutları, eksenel yönde mıknatıslanmış Φ1.5 mm × 10 mm'dir (çap × yükseklik).
   2. Silindirik mıknatısları Şekil 1B'de gösterildiği gibi birleştirin. Her mıknatıs setinin 6 × 6 ızgarada düzenlenmiş 36 silindirik mıknatıstan oluştuğundan emin olun. Ayrıca, mıknatıs setlerinin içsel çekim kuvveti nedeniyle otomatik olarak hizalanmasına izin vermek için her bir bitişik mıknatısın kutuplarının zıt olduğundan emin olun.
   3. Kullanmadan önce mıknatısları sterilize edin, adım 1.1.4'teki prosedürün aynısını izleyin. Bu mıknatıs setlerinin genel boyutları 9 mm × 10 mm × 9 mm'dir ve standart 6 oyuklu hücre kültürü plakalarına uyacak şekilde tasarlanmıştır.

2. Cam slaytlarda hücre deseni

1. Hücre kültürü cihazını hazırlayın.
   1. Silikon kalıplar oluşturmak için 2 mm kalınlığında silikon plakalar kullanın. Plakada 1 cm × 1 cm dikdörtgen delik oluşturmak için bir zımba kullanın. Şekil 25C'de gösterildiği gibi, delik merkezde olacak şekilde yuvarlak bir kalıp (çap = 1 mm) yapmak için silikon plakayı deliğin etrafında kesin.
   2. Silikon kalıpları ultrasonik bir temizleyici kullanarak iyice temizleyin. Kalıpları 10 dakika saf suyla yıkayarak sterilize edin, ardından suyu 10 dakika daha %75 etanol ile değiştirin. Son olarak, kalıpları bir sterilizatör kutusunda 65 °C'de 60 dakika kurutun.
   3. Sterilize edilmiş silikon kalıbı Φ25 mm'lik yuvarlak bir cam hücre sürgüsüne takın ve Şekil 1C'de gösterildiği gibi silikonun cama yapışması için hafifçe bastırın. Elde edilen hücre kültürü cihazı, bir cam alt tarafa ve 200 μL'lik bir kültür boşluğuna sahip olacaktır. Cihazın boyutları Φ25 mm × 2,15 mm'dir, bu da onu standart 6 oyuklu hücre kültürü plakaları için uygun hale getirir.
      NOT: Yukarıda açıklanan hücre kültürü cihazı, konfokal kaplar gibi alt kısımları 0,5 mm'den daha ince olan diğer Petri kapları ile değiştirilebilir.
   4. Mıknatıs setlerini 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Kullanım kolaylığı için manyetik olmayan cımbız önerilir.
      NOT: Sonraki tüm adımlar, bu noktadan hücre modellerinin gözlemlenmesine kadar steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
   5. Hücre kültürü cihazını, 6 oyuklu plakanın kuyusuna yerleştirilmiş mıknatısın üzerine yerleştirin. Hücre kültürü cihazının yatay olarak yerleştirildiğinden ve alt tarafının mıknatıs seti ile yakın temas halinde olduğundan emin olun.
2. Gd-DTPA içeren hücre kültürü ortamını hazırlayın
   1. Genellikle 500 mM'lik bir konsantrasyonda, ticari olarak temin edilebilen Gd-DTPA enjeksiyonunu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). 30 mM'lik bir hedef konsantrasyon elde etmek için 470 μL tam hücre kültürü ortamına 30 μL Gd-DTPA enjeksiyonu ekleyerek enjeksiyonu seyreltin.
      NOT: Yerel düzenlemelere ve bulunabilirliğe bağlı olarak, aynı hedef konsantrasyona sahip diğer gadolinyum bazlı kontrast maddeler (GBCA'lar) benzer sonuçlar verebilir¹¹.
3. Hücre desenlerini oluşturun.
   1. Desenleme için hücreleri hasat edin. Bu demonstrasyonda, modelleme için insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC'ler, bkz . Malzeme Tablosu) kullanılmıştır (Şekil 2). Hücreleri süspansiyondan toplamak için 200 x g'da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyin ve Gd-DTPA içeren ortamda yeniden süspanse edin. Hücre yoğunluğunu sayın.
   2. Gd-DTPA içeren ortam ile hücre yoğunluğunu yaklaşık ~ 2 × 10⁵ hücre / mL'ye ayarlayın. Hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın ve ağzına kadar dolu bir sıvı yüzey oluşturmak için her bir hücre kültürü kalıbının boşluğuna 200 μL ekleyin.
   3. Plakayı dikkatlice bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın ve hücreler substrata iyice yapışana kadar 3-6 saat inkübe edin. Hücre modellerinin montajına müdahale edilmesini önlemek için inkübatör kapısını çarpmaktan kaçının. Zayıf yapışma oranlarına sahip hücreler için, GBCA'larla gece tedavisi genellikle güvenlidir¹².
   4. Hücreler, hücre kültürü cihazının boşluğunun dibine yapıştığında hücre desenlemesi tamamlanmış kabul edilir. Gd-DTPA içeren ortamı tam kültür ortamıyla değiştirin.
   5. Hücre kültürü cihazını mıknatıs setinden çıkarın. Hücre modeli hemen gözlemlenebilir veya daha fazla ekim için cihaz yeni bir kültür plakasına aktarılabilir.

3. Mıknatıs yanlarına doğru ortak kültür deseni: hareketli şablonun imalatı

NOT: Mag-Arch tabanlı hücre modellemesinden yararlanmak ve daha fazla uygulama olasılığını araştırmak için aşağıdaki prosedür sunulmuştur.

1. 1. ve 2. adımları izleyerek cihazı şerit hücre deseni için hazırlayın. Bununla birlikte, hücre yoğunluğunu 1 × 10⁵ hücre/mL'ye düşürün ve mıknatısları ayıran silikon plakaları daha ince olanlarla değiştirerek her şerit hücre desenini daha ince hale getirin.
   NOT: Bu, birden çok hücreyi şerit desenlerinde yerleştirmek için yeterli alan sağlar. Referans olarak, mıknatısları ayırmak için 2 mm yerine 1 mm silikon plakalar kullanmanızı öneririz.
2. Adım 2.2-2.3'te gösterildiği gibi ilk hücre türünü modelleyin. Bu adım ayrıca hücre bağlantısı için 3-6 saat gerektirir.
   NOT: Ko-kültür sistemindeki farklı hücre tiplerini ayırt etmek için kullanıcılar, desenlemeden önce hücreleri DiI, DiD gibi floresan boyalarla veya hücre izleyicilerle (CMTPX, CMFDA, CMAC, vb.) etiketleyebilir. Örneğin, DiI ve DiD boyama için, 1 mL FBS içermeyen ortam başına 1 μL stok çözeltisi (10 mM) ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve çalışan bir çözelti elde etmek için iyice karıştırın. Yapışık hücreleri örtmek için kültür ortamını çalışma solüsyonu ile değiştirin. 30 dakika inkübe ettikten ve PBS ile üç kez yıkadıktan sonra hücre toplamaya devam edin.
3. İlk tip hücreleri modelledikten sonra, Şekil 3Aii'de gösterildiği gibi, hücre kültürü cihazını aşağıdaki mıknatıslardan 1 mm sağa doğru hareket ettirin.
4. Cam slaytları 200 μL PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Slaytların kurumasına izin vermeyin.
5. İkinci hücre türünü, 2.2-2.3 adımlarında gösterildiği gibi desenlendirin.
6. Hücre kültürü cihazını Şekil 3Aiii'de gösterildiği gibi aşağıdaki mıknatıslardan 1 mm sağa doğru hareket ettirin ve cam slaytları tekrar 200 μL PBS ile yıkayın. Üçüncü hücre türünü, 2.2-2.3 adımlarında gösterildiği gibi modelleyin.
7. Tüm hücre tiplerini modelledikten sonra, cam slaytları iki kez 200 μL PBS ile nazikçe yıkayın ve tam hücre kültürü ortamı ile değiştirin.
8. Hücre kültürü cihazını mıknatıs setinden çıkarın. Daha sonra hücre modeli gözlemlenebilir veya daha fazla ekim için cihaz yeni bir kültür plakasına aktarılabilir.

4. Gd-DTPA konsantrasyonunu ayarlayarak ko-kültür modellemesi

NOT: GBCA'lar, çalışma konsantrasyonlarında (≤75 mM) hücre yapışmasını veya müteakip büyümeyi önemli ölçüde etkilemez. Ek olarak, hücre kalıpları Gd-DTPA konsantrasyonundan etkilenir: daha yüksek konsantrasyonlar daha küçük / daha ince hücre kalıpları ile sonuçlanır. Böylece, sadece Gd-DTPA konsantrasyonunu ayarlayarak ko-kültür sistemleri oluşturmak mümkündür. Bu örnek, eşmerkezli dairesel dizilerin desenlenmesini gösterir.

1. Adım 1.2'deki minyatür silindirik mıknatısları kullanarak 2.2-2.3 adımlarında gösterildiği gibi ilk hücre tipini modelleyin. Ko-kültür sistemindeki farklı hücre tiplerini ayırt etmek için hücreleri hasat etmeden önce DiI, DiD veya hücre izleyicileri gibi floresan boyalarla etiketleyin (bkz. adım 3).
   NOT: Daha yüksek bir Gd-DTPA konsantrasyonuna (30 mM yerine 50 mM) ve daha düşük bir hücre yoğunluğuna, yaklaşık 1 × 10⁵ hücre / mL'ye ihtiyaç duyulacaktır.
2. İlk hücre dizisini modelledikten sonra, cam slaytları iki kez 200 μL PBS ile nazikçe yıkayın. Slaytların kurumasına izin vermeyin.
3. Daha önce olduğu gibi aynı yordamı izleyerek ikinci tür hücreleri modelleyin. Yerinden çıkmayı önlemek için cam kızakları mıknatıslar üzerinde nispeten hareketsiz tutun. Mıknatıs setlerini cam sürgünün alt yüzeyine oturtan içi boş bir silikon plakanın takılması önerilir.
   NOT: Burada, Şekil 3B'de gösterildiği gibi, ikinci hücre modellerinin birinciden daha büyük olması beklenmesi için daha düşük bir Gd-DTPA konsantrasyonuna (30 mM yerine 20 mM) ihtiyaç duyulacaktır.
4. Tüm hücre tiplerini modelledikten sonra, cam slaytları iki kez 200 μL PBS ile nazikçe yıkayın ve ortamı tam hücre kültürü ortamıyla değiştirin.
5. Hücre kültürü cihazını mıknatıs setinden çıkarın. Daha sonra hücre modeli gözlemlenebilir veya daha fazla ekim için cihaz yeni bir kültür plakasına aktarılabilir.

5. Mikroakışkan çipte hücre deseni

NOT: Mag-Arch tabanlı yöntemin kapalı dar odacıklarda çalıştığı bir önceki çalışmamızda^{gösterilmiştir 8}. İşte bir mikroakışkan kanalda nokta dizilerinin modellenmesine bir örnek.

1. Mikroakışkan çipinin imalatı
   1. Şekil 4A×da gösterildiği gibi, 24 mm 50 mm × 8 mm×lik dikdörtgen bir boşluk içeren 20 mm × 75 mm 4 mm Politetrafloroetilen (PTFE) kalıplarını (Malzeme Tablosuna bakın) özelleştirin.
   2. 0,5 mm kalınlığında bir silikon plakayı düzleştirin. Silikon plakaları, Şekil 4A,B'de gösterildiği gibi, hem giriş hem de çıkış taraflarında üçgen tampon alanları olan 15 mm × 20 mm × 0,5 mm dikdörtgen boşluğa sahip sıvı kanalının şekline göre kesin.
   3. 40 mm × 75 mm dikdörtgen cam plakaları özelleştirin. Cam plakaları 30 saniye boyunca hava plazması ile temizleyin.
   4. Hava plazma temizliğinden hemen sonra, cam plakaları 0,5 mL piyasada bulunan bir yapışma önleyici tamponla örtün (Malzeme Tablosuna bakın) ve havada kurumaya bırakın. Cam plakaları bir kez etanol ile yıkayın ve kurumaya bırakın.
   5. Adım 5.1.2'de hazırlanan bir silikon plakayı, Şekil 4A'da gösterildiği gibi bir cam plakanın ortasına sağlam bir şekilde takın.
   6. Polidimetilsiloksan (PDMS) prepolimerini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın (bkz. Her PDMS çipi için, 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 10 g baz bileşen ve 1 g sıkılaştırıcı madde tartın.
   7. Kolloid içinde küçük kabarcıklar eşit olarak dağılana kadar ajanları bir cam karıştırma çubuğuyla iyice karıştırın. Karıştırma, kolloid hacmine bağlı olarak 5-10 dakika sürer. Kabarcıkları gidermek için kolloid prepolimeri 500 x g'da (oda sıcaklığında) 1 dakika santrifüjleyin.
   8. PTFE kalıbını doldurmak için ~ 10 mL prepolimeri yavaşça boşluğa dökün.
   9. Kalıbı dikkatlice bir vakum haznesine yerleştirin ve prepolimerin akmasını önlemek için yatay tutun.
   10. Bir vakum pompası ile prepolimerden kalan hava kabarcıklarını çıkarın. Vakumlama 120-180 dakika sürer.
   11. Gerekirse, kalıp boşluğunu daha fazla doldurmak için daha fazla prepolimer dökün. 60 dakika daha vakumlayın.
   12. PTFE kalıbını, Şekil 4Bi'de gösterildiği gibi, silika tarafı boşluğa bakacak şekilde cam plaka ile dikkatlice kapatın.
   13. Tüm baloncukların ortadan kaldırıldığından emin olun. Prepolimerin gece boyunca katılaşması için kalıbı 60 °C'lik bir kurutma fırınına aktarın.
   14. Kalıbı fırından çıkarın. Soğuduktan sonra, katılaşmış PDMS kapağını dikkatlice kalıptan çıkarın. Φ1 mm iğne zımba ile bir giriş ve bir çıkış oluşturun.
   15. PDMS kapağını ve 24 mm × 50 mm kapak kızaklarını adım 2.1.2'ye göre yıkayın.
       NOT: Steril koşullar altında aşağıdaki adımlarla devam edin.
   16. Yaklaşık ~500 μm yüksekliğinde bir akış kanalı içeren bir mikroakışkan çipi oluşturmak için bir PDMS kapağı ve bir kapak sürgüsü takın. Alt taraf, Mag-Arch tabanlı strateji ile hücre desenini etkinleştirmek için ~0.15 mm'lik bir cam kapak sürgüsünden oluşmalıdır.
2. Piyasada bulunan steril adaptörleri mikroakışkan çipinin⁸ hem girişine hem de çıkışına monte edin.
3. % 2 (a/h, PBS içinde çözülmüş) jelatin kaplama tamponu hazırlayın. Tamponu otoklavlayarak sterilize edin.
4. Jelatin kaplama tamponunu, 1 mL'lik bir şırınga kullanarak giriş adaptörü aracılığıyla çipe enjekte edin. Kabarcıklar ortaya çıkarsa, bunları ekstra kaplama tamponu ile yıkayın.
5. Çipi 10 cm'lik bir hücre kültürü kabına yerleştirin. Kurumasını önlemek için kabın tabanına 1 mL PBS ekleyin. Çanağı bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Kaplama 30 dakika sürer.
6. Kaplama tamponunu giriş yoluyla 2 mL Gd içeren ortam (30 mM) ile yıkayın.
7. 1 mL'lik bir şırınga ile 30 mM Gd-DTPA içeren 1 mL hücre süspansiyonunu nazikçe enjekte edin.
8. Adım 1.2'deki minyatür silindirik mıknatıslar kullanılarak 2.2-2.3 adımlarında gösterildiği gibi desen hücreleri.
   NOT: Bununla birlikte, Şekil 4Ci'de gösterildiği gibi, mıknatıs setlerini cam sürgünün alt yüzeyine oturtan içi boş bir silikon plakanın takılması önerilir.
9. Desenlemeden sonra, Gd-DTPA içeren ortamı 1 mL'lik bir şırınga ile yıkayarak 1 mL tam ortamla nazikçe yenileyin.
   NOT: Mikroakışkanlarda 5.7-5.9 adımlarından hücre desenleme işlemi yaklaşık 180 dakika sürer, bu da standart cam slaytlardaki hücre desenlemeye benzer.
10. Desenleri mikroskop altında ölçün. Gerekirse, daha fazla ekim için mikroakışkan çipini bir sirkülasyon kültürü cihazına bağlayın.
    NOT: Deneyimlerimize göre, mikroakışkanlara bir hücre inkübatöründe sürekli bir taze kültür ortamı akışı sağlayan basit bir mikro pompa tabanlı cihaz tarafından desteklendiğinde hücreler en az 72 saat büyüyebilir⁸.

Sonuçlar

Dikdörtgen (1,5 mm × 10 mm × 35 mm) ve silindirik (Φ1,5 m × 10 mm) mıknatıslar seçilerek hücre desenleri oluşturuldu. Kullanıcılar, mıknatısların boyutunu ve şeklini değiştirme veya çeşitli hücre desenleri oluşturmak için bunları farklı şekilde bir araya getirme esnekliğine sahiptir. Şekil 1A,B'de mıknatıslar, netlik için manyetik kutuplar mavi (güney) ve kırmızı (kuzey) olarak gösterilecek şekilde birleştirilmiştir. Bu konfigürasyonda...

Tartışmalar

Mag-Arch tabanlı hücre modellemesi, çoğu biyomedikal laboratuvar için kullanıcı dostu bir çözüm sunar. Bu yöntem, mürekkepsiz, etiketsiz, alt tabakadan bağımsız karakterlere ve yüksek verimli desenleme yeteneğine paralel olarak ilerler ^8,13. Tek tip hücre deseni için, hücreleri tek adımlı bir şekilde desenlendirir. Prosedür sadece kültür ortamlarının yenilenmesiyle sona erer.

Önceki çalışmalar, hücreler...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2780 ovarian cancer cells	Procell	CL-0013
Cell culture medium (DMEM, high glucose)	Gibco	11995040
Cover slides	Citotest Scientific	80340-3610	For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm
DiD	MedChemExpress (MCE)	HY-D1028	For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm)
DiI	MedChemExpress (MCE)	HY-D0083	For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochannel	BC-SE-FBS07
Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA)	Beijing Beilu Pharmaceutical	H10860002
Gelatin	Sigma Aldrich	V900863
Glass cell slides	Citotest Scientific	80346-2510	Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm
Glass plates	PURESHI hardware store		For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)	Servicebio	STCC12103G-1
Neodymium-iron-boron magnets (N52)	Lalaci
Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution)	Lonza	1049286	For convenience of demolding when fabricating microfluidics
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Servicebio	G4200
Plasma cleaner	SANHOPTT	PT-2S
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	DOWSIL	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	For fabricating microfluidics
Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold	PURESHI hardware store		Customized online, for fabricating microfluidics
Silicon plate	PURESHI hardware store
Smooth Muscle Cells (SMC)	Procell	CL-0517
Ultrasonic cleaner	Sapeen	CSA-02