Padronização de células usando a estratégia Magnetic-Archimedes

Resumo

Este protocolo descreve um método de padronização de células sem tinta, sem rótulo, independente de substrato e de alto rendimento, baseado no efeito Arquimedes Magnético.

Resumo

A padronização celular, permitindo o controle preciso do posicionamento celular, apresenta uma vantagem única no estudo do comportamento celular. Neste protocolo, uma estratégia de padronização celular baseada no efeito Magnetic-Archimedes (Mag-Arch) é introduzida. Essa abordagem permite o controle preciso da distribuição celular sem o uso de materiais de tinta ou partículas de marcação. Ao introduzir um reagente paramagnético para aumentar a suscetibilidade magnética do meio de cultura celular, as células são repelidas por ímãs e se organizam em um padrão complementar aos conjuntos magnéticos posicionados sob o substrato microfluídico.

Neste artigo, procedimentos detalhados para padronização de células usando a estratégia baseada em Mag-Arch são fornecidos. Métodos para padronizar tipos de células únicas, bem como vários tipos de células para experimentos de co-cultura são oferecidos. Além disso, instruções abrangentes para a fabricação de dispositivos microfluídicos contendo canais para padronização celular são fornecidas. Alcançar esse recurso usando métodos paralelos é desafiador, mas pode ser feito de maneira simplificada e econômica. O emprego de padrões celulares baseados em Mag-Arch equipa os pesquisadores com uma ferramenta poderosa para pesquisa in vitro .

Introdução

A padronização celular está evoluindo para uma tecnologia intuitiva e poderosa para estudos in vitro ¹. Ao manipular posições celulares em placas de cultura, fornece soluções para uma variedade de experimentos, incluindo migração celular², cocultura multicelular biomimética³, montagem de organoides⁴, estudos de biomateriais⁵ e muito mais. Na maioria das situações, um método sem tinta e sem rótulo é preferido para padronização celular porque oferece facilidade de operação e alta viabilidade celular para investigações subsequentes.

O efeito Mag-Arch é um fenômeno físico em que objetos diamagnéticos em líquidos paramagnéticos tendem a se mover em direção a regiões com campos magnéticos fracos⁶. As células vivas são naturalmente diamagnéticas, enquanto os meios de cultura celular podem ser tornados paramagnéticos pela adição de elementos paramagnéticos solúveis, como o gadopentetato dimeglumina (Gd-DTPA), comumente usado por via intravenosa em ressonância magnética nuclear como agente de contraste⁷. Consequentemente, espera-se que as células sejam repelidas pelo meio paramagnético circundante e se movam em direção a regiões onde os campos magnéticos são mais fracos⁸. Um campo magnético padronizado pode ser facilmente gerado usando um conjunto de ímãs de neodímio. Idealmente, os padrões celulares são montados em oposição aos padrões de ímãs. Tecnicamente, isso é definido como um método livre de marcação porque o único reagente adicional, Gd-DTPA, permanece no ambiente extracelular e não se liga às células. Assim, possíveis influências sobre a cultura celular subsequente podem ser facilmente evitadas substituindo o meio de cultura. Comparada a outros métodos 1,3,9,10^, a estratégia baseada em Mag-Arch não requer componentes de biotinta ou a aplicação de partículas específicas para marcar positivamente as células. Além disso, tem sido demonstrado que trabalha em múltiplos substratos para adesão celular e é capaz de padronização celular de alto^rendimento4.

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para padronização celular usando o método baseado em Mag-Arch, cobrindo tudo, desde a fabricação do dispositivo até o ajuste do padrão celular. Além dos padrões que demonstramos, os usuários podem facilmente criar vários padrões de células usando ímãs e solução Gd-DTPA. Além disso, protocolos para montagem de padrões complexos de co-cultura e manipulação de células em chips microfluídicos fechados também são fornecidos.

Protocolo

1. Montagem dos conjuntos magnéticos

1. Monte os conjuntos de ímãs para padrões de tiras.
   1. Escolha ímãs retangulares planos, conforme ilustrado na Figura 1A. As dimensões dos ímãs retangulares usados para esta demonstração são 1,5 mm × 10 mm × 35 mm (espessura × altura × comprimento) (ver Tabela de Materiais). A espessura dos ímãs determina as lacunas entre as listras celulares.
   2. Corte placas de silicone de 2 mm de espessura (ver Tabela de Materiais) em retângulos de 2 mm × 8 mm × 30 mm. Certifique-se de que as duas últimas dimensões dessas placas de silicone sejam ligeiramente menores do que as dos ímãs retangulares mencionados acima para otimizar a montagem. A espessura das placas de silicone determina a largura das listras celulares.
   3. Monte os ímãs retangulares e as placas de silicone camada por camada, conforme ilustrado na Figura 1A. Cada conjunto magnético é composto por 4 ímãs e 3 placas de silicone. Certifique-se de que os polos de cada ímã adjacente sejam opostos para que os conjuntos magnéticos possam se alinhar automaticamente devido à força atrativa intrínseca.
   4. Esterilize os ímãs antes de usar.
      NOTA: Recomenda-se lavar os conjuntos magnéticos com água pura e, em seguida, mergulhá-los em etanol 75% por 10 min. As dimensões gerais desses conjuntos magnéticos são de 12 mm × 10 mm × 35 mm, projetados para se ajustarem às placas de cultura de células padrão de 6 poços.
2. Monte os conjuntos magnéticos para padrões de matriz de pontos
   1. Escolha ímãs cilíndricos em miniatura, como mostra a Figura 1B. As dimensões dos ímãs cilíndricos utilizados para esta demonstração são Φ1,5 mm × 10 mm (diâmetro × altura), magnetizados no sentido axial.
   2. Monte os ímãs cilíndricos conforme indicado na Figura 1B. Certifique-se de que cada conjunto de ímãs consiste em 36 ímãs cilíndricos dispostos em uma grade de 6 × 6. Além disso, certifique-se de que os polos de cada ímã adjacente sejam opostos para permitir que os conjuntos magnéticos se alinhem automaticamente devido à força atrativa intrínseca.
   3. Esterilizar os ímanes antes da utilização, seguindo o mesmo procedimento do passo 1.1.4. As dimensões gerais desses conjuntos magnéticos são de 9 mm × 10 mm × 9 mm, projetados para se ajustarem às placas de cultura de células padrão de 6 poços.

2. Padronização de células em lâminas de vidro

1. Prepare o dispositivo de cultura celular.
   1. Use placas de silicone de 2 mm de espessura para criar moldes de silicone. Utilize um perfurador para criar um orifício retangular de 1 cm × 1 cm na placa. Aparar a placa de silicone ao redor do orifício para criar um molde redondo (diâmetro = 25 mm) com o orifício no centro, conforme ilustrado na Figura 1C.
   2. Limpe completamente os moldes de silicone usando um limpador ultrassônico. Esterilizar os moldes lavando-os com água pura por 10 min, seguido de substituir a água por etanol 75% por mais 10 min. Por fim, seque os moldes em caixa esterilizadora a 65 °C por 60 min.
   3. Fixe o molde de silicone esterilizado a uma lâmina de célula de vidro redonda de Φ25 mm e pressione-o suavemente para que o silicone adera ao vidro, como mostra a Figura 1C. O dispositivo de cultura celular resultante terá uma parte inferior de vidro e uma cavidade de cultura de 200 μL. As dimensões do dispositivo são Φ25 mm × 2,15 mm, tornando-o adequado para placas de cultura de células padrão de 6 poços.
      NOTA: O dispositivo de cultura celular descrito acima pode ser substituído por outras placas de Petri com a parte inferior mais fina do que 0,5 mm, como placas confocais.
   4. Coloque os conjuntos magnéticos em uma placa de 6 poços. Pinças não magnéticas são recomendadas para facilitar a operação.
      NOTA: Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas em condições estéreis a partir deste ponto até a observação dos padrões celulares.
   5. Posicione o dispositivo de cultura celular em cima do ímã fixado no poço da placa de 6 poços. Certifique-se de que o dispositivo de cultura de células seja colocado horizontalmente e que a parte inferior esteja em contato próximo com o conjunto magnético.
2. Preparar o meio de cultura celular contendo Gd-DTPA
   1. Preparar a injeção de Gd-DTPA disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais), geralmente com uma concentração de 500 mM. Diluir a injeção adicionando 30 μL de injeção de Gd-DTPA a 470 μL de meio de cultura celular completo para atingir uma concentração-alvo de 30 mM.
      NOTA: Dependendo das regulamentações locais e da disponibilidade, outros agentes de contraste à base de gadolínio (GBCAs) com a mesma concentração-alvo podem produzir resultados semelhantes¹¹.
3. Crie os padrões de célula.
   1. Células de colheita para padronização. Nesta demonstração, células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs, ver Tabela de Materiais) foram usadas para padronização (Figura 2). Centrifugar as células por 5 min a 200 x g (à temperatura ambiente) para recolhê-las da suspensão e ressuspendê-las no meio contendo Gd-DTPA. Conte a densidade celular.
   2. Ajustar a densidade celular para aproximadamente ~2 × 10⁵ células/mL com meio contendo Gd-DTPA. Misture suavemente a suspensão celular e adicione 200 μL à cavidade de cada molde de cultura celular para criar uma superfície líquida cheia de borda.
   3. Transfira cuidadosamente a placa para uma incubadora de cultura celular e incube por 3-6 h até que as células aderam bem ao substrato. Evite bater a porta da incubadora para evitar interferência na montagem dos padrões celulares. Para células com baixas taxas de adesão, o tratamento noturno com GBCAs é geralmente seguro¹².
   4. A padronização celular é considerada completa quando as células aderem ao fundo da cavidade do dispositivo de cultura celular. Substitua o meio contendo Gd-DTPA por meio de cultura completo.
   5. Remova o dispositivo de cultura de células do conjunto magnético. Pode-se observar o padrão celular imediatamente ou transferir o dispositivo para uma nova placa de cultura para posterior cultivo.

3. Padronização de co-cultura por ímã lateralmente: fabricação do molde móvel

NOTA: O procedimento a seguir é apresentado para aproveitar o padrão de célula baseado em Mag-Arch e explorar a possibilidade de mais aplicativos.

1. Prepare o dispositivo para padronização de células de faixa seguindo as etapas 1 e 2. No entanto, reduza a densidade celular para 1 × 10⁵ células/mL e substitua as placas de silicone que separam os ímãs por outras mais finas, tornando cada padrão de célula de listra mais fino.
   Observação : isso fornece área suficiente para colocar várias células em padrões de listra. Como referência, sugerimos o uso de placas de silicone de 1 mm em vez de 2 mm para separar os ímãs.
2. Padronize o primeiro tipo de células, conforme ilustrado nas etapas 2.2-2.3. Esta etapa também requer 3-6 h para a conexão celular.
   NOTA: Para distinguir diferentes tipos de células no sistema de co-cultura, os usuários podem rotular as células com corantes fluorescentes, como DiI, DiD ou rastreadores de células (CMTPX, CMFDA, CMAC, etc.) antes da padronização. Por exemplo, para a coloração de DiI e DiD, adicionar 1 μL da solução-mãe (10 mM) (ver Tabela de Materiais) por 1 mL de meio livre de FBS e misturar bem para obter uma solução funcional. Substitua o meio de cultura pela solução de trabalho para cobrir as células aderentes. Após incubar por 30 min e lavar com PBS três vezes, prosseguir com a colheita celular.
3. Após padronizar o primeiro tipo de células, mova o dispositivo de cultura celular 1 mm dos ímãs abaixo para a direita, conforme ilustrado na Figura 3Aii.
4. Lave suavemente as lâminas de vidro com 200 μL de PBS duas vezes. Evite deixar as lâminas secarem.
5. Padronize o segundo tipo de células da mesma maneira ilustrada nas etapas 2.2-2.3.
6. Mova o dispositivo de cultura celular 1 mm dos ímãs abaixo para a direita, conforme ilustrado na Figura 3Aiii, e lave novamente as lâminas de vidro com 200 μL de PBS. Modele o terceiro tipo de células da mesma maneira ilustrada nas etapas 2.2-2.3.
7. Depois de padronizar todos os tipos de células, lave suavemente as lâminas de vidro com 200 μL de PBS duas vezes e substitua por meio de cultura celular completo.
8. Remova o dispositivo de cultura de células do conjunto magnético. Pode-se então observar o padrão celular ou transferir o dispositivo para uma nova placa de cultura para posterior cultivo.

4. Padronização da co-cultura ajustando a concentração de Gd-DTPA

NOTA: Os GBCAs não afetam significativamente a adesão celular ou o crescimento subsequente em concentrações de trabalho (≤75 mM). Além disso, os padrões celulares são influenciados pela concentração de Gd-DTPA: concentrações mais altas resultam em padrões celulares menores/mais finos. Assim, é possível criar sistemas de co-cultura simplesmente ajustando a concentração de Gd-DTPA. Este exemplo demonstra a padronização de matrizes circulares concêntricas.

1. Padronize o primeiro tipo de células, conforme ilustrado nas etapas 2.2-2.3, usando ímãs cilíndricos em miniatura da etapa 1.2. Rotule as células com corantes fluorescentes, como DiI, DiD ou rastreadores de células (ver etapa 3) antes de colhê-las para distinguir diferentes tipos de células no sistema de co-cultura.
   NOTA: Será necessária uma maior concentração de Gd-DTPA (50 mM em vez de 30 mM) e uma menor densidade celular, aproximadamente 1 × 10⁵ células/mL.
2. Depois de padronizar a primeira matriz celular, lave suavemente as lâminas de vidro com 200 μL de PBS duas vezes. Evite deixar as lâminas secarem.
3. Padronize o segundo tipo de células seguindo o mesmo procedimento anterior. Mantenha as lâminas de vidro relativamente imóveis sobre os ímãs para evitar deslocamento. Recomenda-se a fixação de uma placa de silicone com um orifício que se encaixe nos conjuntos magnéticos na superfície inferior da lâmina de vidro.
   NOTA: Aqui, será necessária uma concentração menor de Gd-DTPA (20 mM em vez de 30 mM) para que se espere que os padrões da segunda célula sejam maiores do que a primeira, como ilustrado na Figura 3B.
4. Após padronizar todos os tipos de células, lave suavemente as lâminas de vidro com 200 μL de PBS duas vezes e substitua o meio por meio de cultura celular completo.
5. Remova o dispositivo de cultura de células do conjunto magnético. Pode-se então observar o padrão celular ou transferir o dispositivo para uma nova placa de cultura para posterior cultivo.

5. Padronização celular em chip microfluídico

NOTA: O método baseado em Mag-Arch demonstrou funcionar em câmaras estreitas fechadas em nosso estudo anterior⁸. Aqui está um exemplo de padronização de matrizes de pontos em um canal microfluídico.

1. Fabricação do chip de microfluido
   1. Personalize moldes de politetrafluoretileno (PTFE) de 40 mm × 75 mm × 20 mm (ver Tabela de Materiais) contendo uma cavidade retangular de 24 mm × 50 mm × 8 mm, conforme ilustrado na Figura 4A.
   2. Achate uma placa de silicone de 0,5 mm de espessura. Cortar as placas de silicone de acordo com a forma do canal de fluido, que possui cavidade retangular de 15 mm × 20 mm × 0,5 mm com áreas de tampão triangulares nos lados de entrada e saída, conforme ilustrado na Figura 4A,B.
   3. Personalize placas de vidro retangulares de 40 mm × 75 mm. Limpe as placas de vidro com plasma de ar por 30 s.
   4. Imediatamente após a limpeza com plasma de ar, cubra as placas de vidro com 0,5 ml de um tampão antiaderência disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) e deixe-as secar ao ar. Lave as placas de vidro uma vez com etanol e deixe-as secar ao ar.
   5. Fixar firmemente uma placa de silicone preparada no passo 5.1.2 ao meio de uma placa de vidro, conforme ilustrado na figura 4A.
   6. Preparar o pré-polímero de polidimetilsiloxano (PDMS) de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Para cada chip PDMS, pesar 10 g do constituinte base e 1 g do agente refirmante em um tubo centrífugo de 50 mL.
   7. Misture bem os agentes com uma haste agitadora de vidro até que pequenas bolhas estejam uniformemente distribuídas no coloide. A mistura leva de 5 a 10 minutos, dependendo do volume do coloide. Centrifugar o pré-polímero coloide por 1 min a 500 x g (à temperatura ambiente) para eliminar bolhas.
   8. Despeje lentamente ~10 mL do pré-polímero na cavidade para preencher o molde de PTFE.
   9. Coloque cuidadosamente o molde em um reservatório de vácuo e mantenha-o horizontal para evitar que o pré-polímero flua.
   10. Remova as bolhas de ar residuais do pré-polímero com uma bomba de vácuo. A aspiração leva de 120 a 180 minutos.
   11. Se necessário, despeje mais pré-polímero para preencher ainda mais a cavidade do molde. Vácuo por mais 60 min.
   12. Cubra cuidadosamente o molde de PTFE com a placa de vidro, com o lado da sílica voltado para a cavidade, conforme ilustrado na Figura 4Bi.
   13. Certifique-se de que todas as bolhas sejam eliminadas. Transfira o molde para uma estufa de secagem a 60 °C para que o pré-polímero solidifique durante a noite.
   14. Retire a forma do forno. Após o resfriamento, desmarque a cobertura do PDMS solidificado cuidadosamente. Crie uma entrada e uma saída com um puncionador de agulha de Φ1 mm.
   15. Lavar a tampa PDMS e as corrediças de 24 mm × 50 mm de acordo com o passo 2.1.2.
       NOTA: Prossiga com as seguintes etapas em condições estéreis.
   16. Conecte uma tampa PDMS e uma lâmina de tampa para criar um chip de microfluido contendo um canal de fluxo de aproximadamente ~500 μm de altura. O lado inferior deve consistir em uma tampa de vidro de ~0,15 mm para permitir a padronização de células com a estratégia baseada em Mag-Arch.
2. Monte adaptadores estéreis disponíveis comercialmente na entrada e na saída do chip de microfluido⁸.
3. Prepare um tampão de revestimento de gelatina a 2% (p/v, dissolvido em PBS). Esterilizar o tampão por autoclavagem.
4. Injete o tampão de revestimento de gelatina no chip através do adaptador de entrada usando uma seringa de 1 mL. Se surgirem bolhas, limpe-as com um tampão de revestimento extra.
5. Coloque o chip em uma placa de cultura celular de 10 cm. Adicione 1 mL de PBS ao redor do fundo do prato para evitar a secagem. Transfira a placa para uma incubadora de cultura celular. O revestimento leva 30 min.
6. Limpe o tampão de revestimento com 2 mL de meio contido em Gd (30 mM) através da entrada.
7. Injetar suavemente 1 ml de suspensão celular contendo 30 mM Gd-DTPA com uma seringa de 1 ml.
8. Células padrão como ilustrado nas etapas 2.2-2.3 usando ímãs cilíndricos em miniatura da etapa 1.2.
   NOTA: No entanto, recomenda-se a fixação de uma placa de silicone com um orifício que se encaixe nos conjuntos magnéticos à superfície inferior da lâmina de vidro, como mostrado na Figura 4Ci.
9. Após a padronização, refrescar suavemente o meio contido em Gd-DTPA com 1 mL de meio completo lavando com uma seringa de 1 mL.
   NOTA: O processo de padronização celular em microfluídica, das etapas 5.7-5.9, leva cerca de 180 min, o que é semelhante ao padrão de células em lâminas de vidro padrão.
10. Quantifique os padrões ao microscópio. Se necessário, conecte o chip de microfluido a um dispositivo de cultura circulante para cultivo posterior.
    NOTA: Em nossa experiência, as células são capazes de crescer por pelo menos 72 h quando suportadas por um simples dispositivo baseado em microbomba, que fornece à microfluídica um fluxo contínuo de meio de cultura fresco em uma incubadora de células⁸.

Resultados

Ímãs retangulares (1,5 mm × 10 mm × 35 mm) e cilíndricos (Φ1,5 m × 10 mm) foram selecionados para criar padrões celulares como demonstração. Os usuários têm a flexibilidade de modificar o tamanho e a forma dos ímãs ou montá-los de forma diferente para criar diversos padrões de células. Na Figura 1A,B, os ímãs foram montados, com os polos magnéticos representados em azul (sul) e vermelho (norte) para maior clareza. Nessa configuração, os ímãs se atraem...

Discussão

A padronização celular baseada em Mag-Arch fornece uma solução fácil de usar para a maioria dos laboratórios biomédicos. Esse método avança paralelamente aos caracteres sem tinta, sem rótulo, sem substrato e com a capacidade de padronização de alto rendimento ^8,13. Para padronização de células monotipo, ele padroniza células de uma maneira de uma etapa. O procedimento termina simplesmente refrescando os meios de cultura.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2780 ovarian cancer cells	Procell	CL-0013
Cell culture medium (DMEM, high glucose)	Gibco	11995040
Cover slides	Citotest Scientific	80340-3610	For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm
DiD	MedChemExpress (MCE)	HY-D1028	For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm)
DiI	MedChemExpress (MCE)	HY-D0083	For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochannel	BC-SE-FBS07
Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA)	Beijing Beilu Pharmaceutical	H10860002
Gelatin	Sigma Aldrich	V900863
Glass cell slides	Citotest Scientific	80346-2510	Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm
Glass plates	PURESHI hardware store		For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)	Servicebio	STCC12103G-1
Neodymium-iron-boron magnets (N52)	Lalaci
Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution)	Lonza	1049286	For convenience of demolding when fabricating microfluidics
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Servicebio	G4200
Plasma cleaner	SANHOPTT	PT-2S
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	DOWSIL	SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	For fabricating microfluidics
Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold	PURESHI hardware store		Customized online, for fabricating microfluidics
Silicon plate	PURESHI hardware store
Smooth Muscle Cells (SMC)	Procell	CL-0517
Ultrasonic cleaner	Sapeen	CSA-02