Dispositivo de montaje acústico tridimensional para la fabricación en masa de esferoides celulares

Resumen

Los esferoides celulares se han considerado un modelo potencial en el campo de las aplicaciones biológicas. Este artículo describe los protocolos para la generación escalable de esferoides celulares utilizando un dispositivo de ensamblaje acústico 3D, que proporciona un método eficiente para la fabricación robusta y rápida de esferoides celulares uniformes.

Resumen

Los esferoides celulares son modelos tridimensionales (3D) prometedores que han adquirido amplias aplicaciones en muchos campos biológicos. Este protocolo presenta un método para fabricar esferoides celulares de alta calidad y alto rendimiento utilizando un dispositivo de ensamblaje acústico 3D a través de procedimientos maniobrables. El dispositivo de montaje acústico consta de tres transductores de titanato de circonato de plomo (PZT), cada uno dispuesto en el plano X/Y/Z de una cámara cuadrada de polimetacrilato de metilo (PMMA). Esta configuración permite la generación de un patrón de matriz de puntos 3D de nodos acústicos levitados (LAN) cuando se aplican tres señales. Como resultado, las células de la solución de gelatina de metacriloilo (GelMA) pueden ser conducidas a las LAN, formando agregados celulares uniformes en tres dimensiones. A continuación, la solución GelMA se fotocura con UV y se reticula para que sirva como andamio que soporta el crecimiento de los agregados celulares. Finalmente, se obtienen masas de esferoides maduros y se recuperan disolviendo posteriormente los andamios GelMA en condiciones suaves. El nuevo dispositivo de ensamblaje de células acústicas 3D propuesto permitirá la fabricación a escala de esferoides celulares, e incluso organoides, ofreciendo una tecnología de gran potencial en el campo biológico.

Introducción

Los modelos de cultivo in vitro en 3D, que proporcionan características estructurales y morfológicas más similares a las de in vivo en comparación con los modelos de cultivo 2D convencionales, han sido reconocidos como sistemas prometedores en diversas aplicaciones biomédicas, como la ingeniería de tejidos, el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos ^1,2,3. Como un tipo de modelo de cultivo 3D, los esferoides celulares suelen referirse a la agregación celular, creando estructuras esferoidales 3D caracterizadas por interacciones mejoradas célula-célula y célula-matriz ^4,5,6. Por lo tanto, la fabricación de esferoides celulares se ha convertido en una poderosa herramienta para permitir diversos estudios biológicos.

Para obtener esferoides se han desarrollado diversas técnicas, como la gota colgante⁷, las placas no adhesivas⁸ o los dispositivos de micropocillos⁹. En principio, estos métodos suelen facilitar el ensamblaje celular mediante la utilización de fuerzas físicas como la fuerza gravitacional, al tiempo que minimizan las interacciones entre las células y el sustrato. Sin embargo, a menudo implican procesos que requieren mucha mano de obra, tienen baja productividad y plantean desafíos para controlar el tamaño del esferoide^10,11. Es importante destacar que la producción de esferoides con el tamaño y la uniformidad deseados en cantidad suficiente es de suma importancia para satisfacer aplicaciones biológicas específicas. A diferencia de los métodos mencionados anteriormente, las ondas acústicas, como un tipo de técnica impulsada por fuerzas externas 12,13,14, han mostrado potencial para la fabricación masiva de esferoides celulares con alta calidad y rendimiento, basados en el principio de mejorar la agregación celular a través de fuerzas externas 15,16,17,18 . A diferencia de las fuerzas electromagnéticas o magnéticas, las técnicas de manipulación celular basadas en la acústica no son invasivas y no contienen marcadores, lo que permite la formación de esferoides con una excelente biocompatibilidad^19,20.

Comúnmente, se han desarrollado dispositivos basados en ondas acústicas de superficie estacionaria (SAW) y ondas acústicas masivas (BAW) para generar esferoides, utilizando los nodos acústicos (AN) producidos por los campos acústicos permanentes correspondientes 21,22,23. En particular, los dispositivos de ensamblaje acústico basados en BAW, con las ventajas de una fabricación conveniente, fácil operación y excelente escalabilidad, han ganado atención para la fabricación de esferoides celulares^24,25. Recientemente hemos desarrollado un dispositivo de ensamblaje acústico fácil basado en BAWs con la capacidad de generar esferoides con alto rendimiento²⁶. El dispositivo propuesto consiste en una cámara cuadrada de polimetacrilato de metilo (PMMA) con tres transductores de titanato de circonato de plomo (PZT) dispuestos respectivamente en el plano X/Y/Z. Esta disposición permite la creación de un patrón de matriz de puntos 3D de nodos acústicos levitados (LAN) para el ensamblaje de celdas de conducción. En comparación con los dispositivos basados en BAW o SAW informados anteriormente, que solo pueden crear una matriz 1D o 2D de ANs 27,28,29, el dispositivo actual permite una matriz de puntos 3D de LAN para la rápida formación de agregados celulares dentro de la solución de gelatina de metacriloilo (GelMA). Posteriormente, los agregados celulares maduraron en esferoides con alta viabilidad dentro de los andamios fotocurados GelMA después de tres días de cultivo. Por último, se obtuvo fácilmente un gran número de esferoides de tamaño uniforme a partir de los andamios GelMA para aplicaciones posteriores.

Protocolo

1. Fabricación del dispositivo de montaje acústico 3D

1. Comience preparando cuatro láminas de PMMA de 1 mm de espesor mediante corte láser³⁰, y luego proceda a pegarlas para formar una cámara cuadrada con un ancho interior de 21 mm y una altura de 10 mm.
2. A continuación, coloque otra lámina de PMMA de 1 mm de grosor en el fondo de la cámara para que sirva de soporte para la biotinta.
3. Fije cuidadosamente tres transductores de titanato de circonato de plomo (PZT) (cada uno de 20 mm de largo, 10 mm de ancho, 0,7 mm de espesor y con una frecuencia de resonancia primaria de 3 MHz, consulte la Tabla de materiales) en el exterior de las tres paredes ortogonales de la cámara, respectivamente. Asegúrese de que el transductor PZT inferior esté centrado debajo de la cámara.
4. Suelde los cables a las dos áreas conductoras de cada transductor PZT.
5. Finalmente, asegure el dispositivo en una base hueca para evitar que el PZT inferior entre en contacto con otras encimeras.

2. Configuración del sistema de montaje acústico

1. Comience montando el dispositivo acústico en una platina de microscopio, lo que permite observar desde arriba el interior de la cámara.
2. Coloque un microscopio digital en el lado del dispositivo que esté libre de transductores PZT, lo que permite la observación lateral del interior de la cámara.
3. Conecte de forma independiente los cables de los tres transductores PZT en serie a tres amplificadores de potencia y tres canales de salida de los generadores de funciones (consulte la tabla de materiales).
4. Programe los ajustes en los generadores de funciones para cada transductor PZT, especificando parámetros como la forma de onda sinusoidal, la frecuencia y la amplitud.
5. Para garantizar la esterilización, llene la cámara del dispositivo acústico con alcohol al 75% durante 5 minutos, seguido de una limpieza a fondo con una solución estéril de PBS. Posteriormente, irradiar la cámara con luz UV en un banco limpio durante un mínimo de 1 h.

3. Procedimiento de cultivo y recolección celular

1. Comience cultivando células C3A, una línea celular de carcinoma hepatocelular humano, en un matraz de cultivo celular T25 utilizando el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con un 10 % de suero fetal bovino y un 1 % de penicilina-estreptomicina (ver Tabla de materiales).
2. Cuando las células C3A alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, realice el paso celular de la siguiente manera: en primer lugar, lave el fondo del matraz de cultivo dos veces con PBS. A continuación, añadir 2 mL de tripsina-EDTA al 0,05% al matraz de cultivo celular e incubar a 37 °C para facilitar el desprendimiento celular. Detenga el proceso de tripsinización añadiendo 2 mL de medio de cultivo completo.
3. Transfiera la solución celular a un tubo de 15 ml y centrifugue a 200 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente para obtener un gránulo celular.

4. Preparación de la biotinta

1. Prepare una solución de GelMA al 6% (p/v) que contenga un 0,5% (p/v) de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP) disolviendo 0,3 g de GelMA y 0,025 g de LAP (ver Tabla de materiales) en 5 ml de solución tampón de fosfato (PBS). Deje reposar la mezcla en un baño de agua a 47 °C durante 1 h.
2. Antes de mezclar con las células, pase la solución de GelMA a través de un filtro de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales) para su esterilización.
3. Vuelva a suspender el gránulo celular mencionado anteriormente (paso 3.3) en medio de cultivo celular. Tiñir un pequeño volumen de células con una solución de azul de tripano al 0,4 % y luego usar un hemocitómetro limpio para el recuento de células.
4. Mezclar una cantidad adecuada de células C3A, calculada en base a la densidad celular obtenida anteriormente, con la solución esterilizada de GelMA para preparar la biotinta con una densidad celular de 2 × 10⁶ células/mL.
5. Para la visualización de los esferoides celulares ensamblados, tiña previamente las células C3A incubándolas con un seguidor celular de 2 μM (colorante DiO, ver Tabla de Materiales) a 37 °C durante 20 min. Posteriormente, lavar las células marcadas con medio de cultivo celular fresco tres veces antes de su uso.

5. Montaje de los esferoides celulares utilizando el dispositivo acústico

1. Pipetear más de 1 ml de biotinta en la cámara esterilizada. Asegúrese de que la distancia cara a cara entre la superficie del líquido y el fondo de la cámara sea un múltiplo entero de la mitad de la longitud de onda acústica.
   NOTA: Se puede controlar esta distancia ajustando el volumen de biotinta añadida. La longitud de onda acústica (λ) se puede estimar utilizando la fórmula λ = c/f, donde c representa la velocidad del sonido en el medio y f es la frecuencia del transductor PZT.
2. Encienda el generador de funciones y el amplificador de potencia para iniciar el accionamiento de cada transductor PZT.
   NOTA: Se recomienda accionar individualmente cada transductor PZT primero para lograr el patrón celular óptimo de línea paralela. Esto se puede lograr realizando un barrido de frecuencia con un tamaño de paso de 0,001 MHz cerca de la frecuencia de resonancia primaria para cada transductor PZT. Después, aplique simultáneamente estas señales óptimas a los tres transductores PZT para obtener el patrón celular de puntos 3D esperado. Antes de aplicar cada señal de entrada, asegúrese de que las células se dispersen uniformemente en la biotinta agitando suavemente.
3. Reticulación de la biotinta utilizando luz azul (405 nm, 60 mW/^cm2, 30 s) para crear un andamio de hidrogel 3D que encapsula los agregados celulares ensamblados acústicamente. Luego, apague el generador de funciones y el amplificador de potencia.
4. Transfiera con cuidado el andamio de hidrogel 3D de la cámara a una placa de Petri y córtelo en trozos pequeños (por ejemplo, 2 mm × 2 mm × 2 mm) con una navaja limpia.
5. Agregue medio de cultivo celular para el cultivo.
   NOTA: Recuerde cambiar el medio de cultivo todos los días.

6. Recuperación de esferoides celulares

1. Comience observando la formación de esferoides en diferentes capas de los andamios utilizando un microscopio invertido.
2. Después de 3 días de cultivo, retire el medio de cultivo y lave bien los andamios de hidrogel dos veces con PBS.
3. Incubar los andamios con más de 2 ml de tampón de lisis GelMA en una dilución de 1:200 con medio de cultivo celular durante 30 min en una incubadora celular. Este paso tiene como objetivo disolver los andamios de hidrogel.
4. Transfiera la solución del paso anterior a un tubo y luego centrifugue a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener el gránulo de esferoide celular.
5. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en un medio de cultivo fresco para aplicaciones posteriores.

7. Análisis de viabilidad de esferoides

1. Evaluar la viabilidad de los esferoides celulares dentro de los andamios de hidrogel o en los esferoides recuperados utilizando un kit de tinción vivo/muerto (ver Tabla de materiales).
2. Incubar las muestras en diferentes puntos de tiempo de cultivo con 1 ml de solución de PBS que contenga 1 μl de Calceína-AM y 2 μl de yoduro de propidio (PI) durante 15 min a 37 °C.
3. Para las muestras dentro de los andamios de hidrogel, lávelas directamente con PBS dos veces. En el caso de los esferoides recuperados, centrifugar a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente para obtener un gránulo de esferoide y lavarlo dos veces antes de la observación.
4. Observe las muestras con un microscopio de fluorescencia y capture las imágenes de fluorescencia.
5. Calcule la relación entre el área teñida con Calceína-AM y el área total teñida con Calceína-AM y PI utilizando ImageJ para determinar la viabilidad del esferoide.

Resultados

En este estudio se diseñó un dispositivo de ensamblaje acústico en 3D para la fabricación masiva de esferoides celulares. El dispositivo acústico consistía en una cámara cuadrada con dos transductores PZT conectados al plano X y al plano Y en la superficie exterior de la cámara y un transductor PZT en la parte inferior de la cámara (Figura 1A, B). Se conectaron tres canales de salida de dos generadores de funciones a tres amplificadores de potencia para generar tres...

Discusión

La fabricación eficiente y estable de esferoides celulares con alto rendimiento utilizando tecnologías como el dispositivo de ensamblaje acústico 3D es muy prometedora para el avance de la ingeniería biomédica y el cribado de fármacos ^1,2,3. Este enfoque simplifica la producción masiva de esferoides celulares a través de procedimientos sencillos.

Sin embargo, hay factores críticos a tener en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-μm filter	Merck	SLGSM33SS	Used for GelMA solution sterilization
35 mm-cell culture dish	Corning	430165	Used for culturing cells
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Fluorescent cell observation
DiO dye	Beyotime	C1038	Dye used to stain cells
DMEM	Gibco	12430054	Cell culture media
FBS	Gibco	10099141C	Cell culture media supplement
Function generator	Rigol	DG5352	For RF signal generation
GelMA	Regenovo	none	Used to prepare bioink
GelMA lysis buffer	EFL	EFL-GM-LS-001	Used to dissolve GelMA scaffolds
Inverted microscope	Nikon	Ti-U	Cell observation
LAP	Sigma-Aldrich	900889	Used as photoinitiator
Live-Dead kit	Beyotime	C2015M	Cell vability analysis
PBS	Gibco	10010002	Used as buffer
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063	Prevent cell culture contamination
Power amplifer	Minicircuit	LCY-22+	Increase the voltage amplitude of the RF signal
PZT transducers	Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd.	PZT-41	Functional units for acoustic assembly device
T25 cell culture flask	Corning	430639	Used for culturing cells
Trypan blue	Gibco	15250061	Cell counting
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Cell dissociation enzyme