Трехмерное акустическое сборочное устройство для массового производства клеточных сфероидов

Резюме

Клеточные сфероиды рассматривались как одна из потенциальных моделей в области биологических приложений. В данной статье описываются протоколы для масштабируемой генерации клеточных сфероидов с использованием 3D-акустического сборочного устройства, которое обеспечивает эффективный метод надежного и быстрого изготовления однородных клеточных сфероидов.

Аннотация

Клеточные сфероиды являются перспективными трехмерными (3D) моделями, получившими широкое применение во многих областях биологии. В этом протоколе представлен метод изготовления высококачественных и высокопроизводительных клеточных сфероидов с использованием устройства 3D-акустической сборки с помощью маневренных процедур. Устройство акустической сборки состоит из трех преобразователей из титаната цирконата свинца (PZT), каждый из которых расположен в плоскости X/Y/Z квадратной камеры из полиметилметакрилата (ПММА). Эта конфигурация позволяет генерировать 3D-точечную матрицу левитирующих акустических узлов (ЛВС) при подаче трех сигналов. В результате ячейки в растворе желатина метакрилоила (GelMA) могут быть перемещены в ЛВС, образуя однородные клеточные агрегаты в трех измерениях. Затем раствор GelMA подвергается УФ-фотоотверждению и сшивается в качестве каркаса, поддерживающего рост клеточных агрегатов. Наконец, массы зрелых сфероидов получают и извлекают путем последующего растворения скаффолдов GelMA в мягких условиях. Предлагаемое новое 3D-устройство для сборки акустических клеток позволит масштабировать производство клеточных сфероидов и даже органоидов, предлагая большой потенциал технологии в биологической области.

Введение

3D-модели культивирования in vitro, которые обеспечивают больше структурных и морфологических характеристик in vivo по сравнению с обычными 2D-моделями культивирования, были признаны перспективными системами в различных биомедицинских приложениях, таких как тканевая инженерия, моделирование заболеваний и скрининг лекарств ^1,2,3. Как один из типов 3D-модели культуры, клеточные сфероиды обычно относятся к клеточной агрегации, создавая трехмерные сфероидальные структуры, характеризующиеся усиленными межклеточными и межклеточными и межклеточными матриксными взаимодействиями ^4,5,6. Таким образом, изготовление клеточных сфероидов стало мощным инструментом для проведения разнообразных биологических исследований.

Для получения сфероидов были разработаны различные методы, в том числе подвесная капля⁷, неадгезивные пластины⁸ или устройства⁹ с микролунками. В принципе, эти методы обычно облегчают сборку клеток, используя физические силы, такие как гравитационная сила, при этом сводя к минимуму взаимодействия между клетками и субстратом. Однако они часто связаны с трудоемкими процессами, имеют низкую производительность и создают проблемы для управления размером сфероида ^10,11. Важно отметить, что производство сфероидов желаемого размера и однородности в достаточном количестве имеет первостепенное значение для удовлетворения конкретных биологических задач. В отличие от вышеупомянутых методов, акустические волны, как один из видов техники, управляемой внешней силой 12,13,14, показали потенциал для массового производства клеточных сфероидов с высоким качеством и пропускной способностью, основанных на принципе усиления агрегации клеток за счет внешних сил 15,16,17,18. В отличие от электромагнитных или магнитных сил, акустические методы манипулирования клетками являются неинвазивными и не требуют меток, что позволяет формировать сфероиды с отличной биосовместимостью^19,20.

Как правило, для генерации сфероидов разрабатываются устройства, основанные на акустических волнах стоячей поверхности (ПАВ) и объемных акустических волнах (БАВ), с использованием акустических узлов (АН), создаваемых соответствующими стоячими акустическими полями 21,22,23. В частности, акустические сборочные устройства на основе БАВ, обладающие такими достоинствами, как удобство изготовления, простота эксплуатации и отличная масштабируемость, привлекли внимание изготовлением сфероидов ячеек^24,25. Недавно мы разработали легкое акустическое сборочное устройство на основе BAWs, способное генерировать сфероиды с высокой пропускной способностью²⁶. Предлагаемое устройство состоит из квадратной камеры из полиметилметакрилата (ПММА) с тремя преобразователями цирконат-титаната (ПЗТ), расположенными соответственно в плоскости X/Y/Z. Такая компоновка позволяет создавать 3D-точечную матрицу левитирующих акустических узлов (ЛВС) для сборки ячеек. По сравнению с ранее описанными устройствами на основе BAW или SAW, которые могут создавать только 1D или 2D массив ANs ^27,28,29, настоящее устройство позволяет создавать 3D точечный массив локальных сетей для быстрого образования клеточных агрегатов в растворе желатина метакрилоила (GelMA). Впоследствии клеточные агрегаты созревали в сфероиды с высокой жизнеспособностью в фотоотвержденных скаффолдах GelMA после трех дней культивирования. Наконец, большое количество сфероидов одинакового размера было легко получено из скаффолдов GelMA для последующих применений.

протокол

1. Изготовление устройства 3D акустической сборки

1. Начните с подготовки четырех листов ПММА толщиной 1 мм с помощью лазерной резки³⁰, а затем склейте их вместе, чтобы сформировать квадратную камеру с внутренней шириной 21 мм и высотой 10 мм.
2. Затем прикрепите еще один лист ПММА толщиной 1 мм к нижней части камеры, который будет служить держателем для биочернил.
3. Аккуратно прикрепите три преобразователя из цирконат-титаната (PZT) (каждый размером 20 мм в длину, 10 мм в ширину, 0,7 мм в толщину и с первичной резонансной частотой 3 МГц, см. таблицу материалов) к внешней стороне трех ортогональных стенок камеры соответственно. Убедитесь, что нижний датчик PZT находится по центру под камерой.
4. Припаяйте провода к двум токопроводящим областям каждого преобразователя PZT.
5. Наконец, закрепите устройство на полом основании, чтобы нижняя часть PZT не соприкасалась с другими столешницами.

2. Настройка акустической системы сборки

1. Начните с установки акустического устройства на столик микроскопа, что позволит наблюдать за внутренним пространством камеры с высоты птичьего полета.
2. Расположите цифровой микроскоп на стороне устройства, свободной от преобразователей PZT, что позволит наблюдать за внутренней частью камеры сбоку.
3. Независимо друг от друга подключите последовательно провода от трех преобразователей PZT к трем усилителям мощности и трем выходным каналам генераторов функций (см. таблицу материалов).
4. Запрограммируйте настройки генераторов функций для каждого преобразователя PZT, указав такие параметры, как синусоидальная форма сигнала, частота и амплитуда.
5. Для обеспечения стерилизации заполняют камеру акустического устройства 75% спиртом на 5 мин с последующей тщательной очисткой стерильным раствором PBS. Затем облучайте камеру ультрафиолетовым светом в чистом помещении в течение не менее 1 часа.

3. Культивирование клеток и процедура сбора урожая

1. Начните с культивирования клеток С3А, клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека, в колбе с клеточной культурой Т25 с использованием модифицированной среды Eagle (DMEM) компании Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицином (см. таблицу материалов).
2. Когда клетки C3A достигнут примерно 80% слияния, проводят клеточный пассаж следующим образом: сначала дважды промывают дно колбы для культивирования PBS. Затем добавьте 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу для клеточной культуры и инкубируйте при 37 °C, чтобы облегчить отслоение клеток. Остановите процесс трипсинизации, добавив 2 мл полной питательной среды.
3. Перелейте клеточный раствор в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте его при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре до получения клеточной гранулы.

4. Приготовление биочернил

1. Готовят 6%-ный (массовый) раствор GelMA, содержащий 0,5% (w/v) лития-фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат (LAP), растворяя 0,3 г GelMA и 0,025 г LAP (см. таблицу материалов) в 5 мл фосфатного буферного раствора (PBS). Оставьте смесь на водяной бане с температурой 47 °C в течение 1 часа.
2. Перед смешиванием с клетками раствор GelMA пропускают через фильтр 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) для стерилизации.
3. Ресуспендируйте клеточную гранулу, упомянутую выше (шаг 3.3), в питательной среде. Окрасьте небольшой объем клеток 0,4% раствором трипанового синего, а затем используйте чистый гемоцитометр для подсчета клеток.
4. Смешайте соответствующее количество клеток C3A, рассчитанное на основе плотности клеток, полученной выше, со стерилизованным раствором GelMA для получения биочернил с плотностью клеток 2 × 10⁶ клеток/мл.
5. Для визуализации собранных клеточных сфероидов предварительно окрасьте клетки C3A, инкубируя их клеточным трекером 2 мкМ (краситель DiO, см. таблицу материалов) при 37 °C в течение 20 мин. В дальнейшем меченые клетки трижды промывают свежей питательной средой для клеточных культур.

5. Сборка сфероидов клеток с помощью акустического устройства

1. Пипеткой более 1 мл биочернил в стерилизованную камеру. Убедитесь, что расстояние лицом к лицу между поверхностью жидкости и дном камеры кратно половине длины акустической волны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это расстояние можно контролировать, регулируя объем добавляемых биочернил. Акустическую длину волны (λ) можно оценить по формуле λ = c/f, где c — скорость звука в среде, а f — частота преобразователя PZT.
2. Включите генератор функций и усилитель мощности, чтобы инициировать срабатывание каждого преобразователя PZT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сначала индивидуально приводить в действие каждый преобразователь PZT для достижения оптимальной параллельной ячеистой диаграммы. Этого можно достичь, выполнив развертку частоты с шагом 0,001 МГц вблизи первичной резонансной частоты для каждого преобразователя PZT. После этого одновременно подайте эти оптимальные сигналы на все три преобразователя PZT, чтобы получить ожидаемый 3D-точечный ячеистый рисунок. Перед подачей каждого входного сигнала убедитесь, что клетки равномерно распределены в биочернилах путем мягкого перемешивания.
3. Сшить биочернила с помощью синего света (405 нм, 60 мВт/^см2, 30 с) для создания 3D-гидрогелевого каркаса, который инкапсулирует клеточные агрегаты, собранные акустически. После этого выключите генератор функций и усилитель мощности.
4. Аккуратно перенесите 3D-гидрогелевый каркас из камеры в чашку Петри и нарежьте его на небольшие кусочки (например, 2 мм × 2 мм × 2 мм) с помощью чистой бритвы.
5. Добавьте питательную среду для культивирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте менять питательную среду каждый день.

6. Извлечение клеточных сфероидов

1. Начните с наблюдения за образованием сфероидов в разных слоях скаффолдов с помощью инвертированного микроскопа.
2. Через 3 дня культивирования удалить питательную среду и дважды тщательно промыть гидрогелевые скаффолды PBS.
3. Инкубируют скаффолды с более чем 2 мл лизисного буфера GelMA в разведении 1:200 со средой для клеточных культур в течение 30 мин в клеточном инкубаторе. Этот этап направлен на растворение гидрогелевых каркасов.
4. Перелейте раствор из предыдущего шага в пробирку, а затем центрифугируйте его при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре до получения гранулы сфероида ячейки.
5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в свежей питательной среде для последующего применения.

7. Анализ жизнеспособности сфероида

1. Оцените жизнеспособность клеточных сфероидов либо в гидрогелевых каркасах, либо в извлеченных сфероидах с помощью набора для окрашивания живых/мертвых (см. таблицу материалов).
2. Инкубируют образцы в разные моменты времени культивирования с 1 мл раствора PBS, содержащего 1 мкл кальцеина-AM и 2 мкл йодида пропидия (PI), в течение 15 мин при 37 °C.
3. Для образцов внутри гидрогелевых каркасов промойте их непосредственно PBS дважды. Для извлеченных сфероидов центрифугу при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре до получения гранулы сфероида и дважды промывают ее перед наблюдением.
4. Осмотрите образцы с помощью флуоресцентного микроскопа и сделайте флуоресцентные изображения.
5. Рассчитайте отношение площади, окрашенной кальцеином-AM, к общей площади, окрашенной как кальцеином-AM, так и PI, используя ImageJ для определения жизнеспособности сфероида.

Результаты

В этом исследовании было разработано устройство 3D-акустической сборки для массового производства клеточных сфероидов. Акустическое устройство состояло из квадратной камеры с двумя преобразователями PZT, прикрепленными к плоскостям X и Y на внешней поверхности камеры, и одним преобразо...

Обсуждение

Эффективное и стабильное изготовление клеточных сфероидов с высокой пропускной способностью с использованием таких технологий, как устройство 3D-акустической сборки, имеет большие перспективы для развития биомедицинской инженерии и скрининга лекарств ^1,2,3

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-μm filter	Merck	SLGSM33SS	Used for GelMA solution sterilization
35 mm-cell culture dish	Corning	430165	Used for culturing cells
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Fluorescent cell observation
DiO dye	Beyotime	C1038	Dye used to stain cells
DMEM	Gibco	12430054	Cell culture media
FBS	Gibco	10099141C	Cell culture media supplement
Function generator	Rigol	DG5352	For RF signal generation
GelMA	Regenovo	none	Used to prepare bioink
GelMA lysis buffer	EFL	EFL-GM-LS-001	Used to dissolve GelMA scaffolds
Inverted microscope	Nikon	Ti-U	Cell observation
LAP	Sigma-Aldrich	900889	Used as photoinitiator
Live-Dead kit	Beyotime	C2015M	Cell vability analysis
PBS	Gibco	10010002	Used as buffer
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063	Prevent cell culture contamination
Power amplifer	Minicircuit	LCY-22+	Increase the voltage amplitude of the RF signal
PZT transducers	Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd.	PZT-41	Functional units for acoustic assembly device
T25 cell culture flask	Corning	430639	Used for culturing cells
Trypan blue	Gibco	15250061	Cell counting
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Cell dissociation enzyme