התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדי לייצור המוני של ספרואידים סלולריים

Summary

ספרואידים של תאים נחשבו למודל פוטנציאלי אחד בתחום היישומים הביולוגיים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לייצור מדרגי של ספרואידים של תאים באמצעות התקן הרכבה אקוסטית תלת-ממדית, המספק שיטה יעילה לייצור חזק ומהיר של ספרואידים אחידים של תאים.

Abstract

ספרואידים של תאים הם מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) מבטיחים שזכו ליישומים נרחבים בתחומים ביולוגיים רבים. פרוטוקול זה מציג שיטה לייצור ספרואידים תאים באיכות גבוהה ובתפוקה גבוהה באמצעות התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדית באמצעות הליכים הניתנים לתמרון. התקן ההרכבה האקוסטית מורכב משלושה מתמרי טיטנאט זירקונט עופרת (PZT), שכל אחד מהם מסודר במישור X/Y/Z של תא פולימתיל מתקרילט מרובע (PMMA). תצורה זו מאפשרת יצירת תבנית תלת-ממדית של מערך נקודות של צמתים אקוסטיים מרחפים (LAN) בעת החלת שלושה אותות. כתוצאה מכך, תאים בתמיסת ג'לטין מתקרילויל (GelMA) יכולים להיות מונעים ל- LANs, ויוצרים צברי תאים אחידים בשלושה ממדים. לאחר מכן, תמיסת GelMA עוברת פוטוקורפינג UV ומקושרת כדי לשמש כפיגום התומך בצמיחה של אגרגטים של תאים. לבסוף, המוני ספרואידים בשלים מתקבלים ונשלפים על ידי המסה לאחר מכן של פיגומי GelMA בתנאים קלים. המכשיר החדש המוצע להרכבת תאים אקוסטיים בתלת ממד יאפשר ייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים תאיים, ואפילו אורגנואידים, ויציע טכנולוגיה פוטנציאלית גדולה בתחום הביולוגי.

Introduction

מודלים תלת-ממדיים של תרביות חוץ גופיות, המספקים יותר מאפיינים מבניים ומורפולוגיים דמויי vivo בהשוואה למודלים קונבנציונליים של תרביות דו-ממדיות, הוכרו כמערכות מבטיחות ביישומים ביו-רפואיים שונים כגון הנדסת רקמות, מידול מחלות וסינון תרופות ^1,2,3. כסוג אחד של מודל תרבית תלת-ממדי, ספרואידים של תאים מתייחסים בדרך כלל לצבירת תאים, ויוצרים מבנים ספרואידים תלת-ממדיים המאופיינים באינטראקציות משופרות בין תא לתא ולמטריצה התאית ^4,5,6. לכן, ייצור ספרואידים של תאים הפך לכלי רב עוצמה המאפשר מחקרים ביולוגיים מגוונים.

טכניקות שונות, כולל טיפה תלויה⁷, לוחות לא דביקים⁸, או מכשירי מיקרווול⁹, פותחו כדי להשיג ספרואידים. באופן עקרוני, שיטות אלה בדרך כלל מקלות על הרכבת תאים על ידי ניצול כוחות פיזיקליים כגון כוח כבידה תוך מזעור אינטראקציות בין התאים למצע. עם זאת, לעתים קרובות הם כרוכים בתהליכים עתירי עבודה, בעלי פרודוקטיביות נמוכה, ומציבים אתגרים לשליטה בגודל^{הספרואיד 10,11}. חשוב לציין, ייצור ספרואידים בגודל ובאחידות הרצויים בכמות מספקת הוא בעל חשיבות עליונה כדי לספק יישומים ביולוגיים ספציפיים. בניגוד לשיטות שהוזכרו לעיל, גלים אקוסטיים, כסוג אחד של טכניקה מונעת כוח חיצוני 12,13,14, הראו פוטנציאל לייצור המוני של ספרואידים תאים באיכות ובתפוקה גבוהות, בהתבסס על העיקרון של שיפור צבירת תאים באמצעות כוחות חיצוניים 15,16,17,18. שלא כמו כוחות אלקטרומגנטיים או מגנטיים, טכניקות מניפולציה של תאים מבוססות אקוסטיקה אינן פולשניות ונטולות תוויות, ומאפשרות היווצרות ספרואידים עם תאימות ביולוגית מצוינת^19,20.

בדרך כלל, התקנים מבוססי גלים אקוסטיים של משטח עומד (SAWs) וגלים אקוסטיים בתפזורת (BAWs) פותחו כדי ליצור ספרואידים, תוך ניצול הצמתים האקוסטיים (ANs) המיוצרים על ידי שדות אקוסטיים עומדים תואמים 21,22,23. במיוחד, התקני הרכבה אקוסטית המבוססים על BAWs, עם היתרונות של ייצור נוח, הפעלה קלה ומדרגיות מעולה, זכו לתשומת לב לייצור ספרואידים תא^24,25. לאחרונה פיתחנו מכשיר הרכבה אקוסטית מבוסס BAWs עם היכולת לייצר ספרואידים עם תפוקה גבוהה²⁶. המכשיר המוצע מורכב מתא פולימתיל מתקרילט ריבועי (PMMA) עם שלושה מתמרי טיטנאט זירקונט עופרת (PZT) המסודרים בהתאמה במישור X/Y/Z. סידור זה מאפשר יצירת תבנית תלת-ממדית של מערך נקודות של צמתים אקוסטיים מורחפים (LANs) להנעת הרכבת תאים. בהשוואה להתקנים מבוססי BAW או SAWs שדווחו בעבר, אשר יכולים ליצור רק מערך 1D או 2D של ANs 27,28,29, המכשיר הנוכחי מאפשר מערך נקודות תלת-ממדי של רשתות LAN ליצירת צבירת תאים מהירה בתמיסת ג'לטין מתקרילויל (GelMA). לאחר מכן, צברי תאים הבשילו לספרואידים עם כדאיות גבוהה בתוך פיגומי GelMA פוטוריפו לאחר שלושה ימים של גידול. לבסוף, מספר רב של ספרואידים בגודל אחיד הושגו בקלות מפיגומים GelMA עבור יישומים במורד הזרם.

Protocol

1. ייצור התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדית

1. התחל על ידי הכנת ארבע יריעות PMMA בעובי 1 מ"מ באמצעות חיתוך לייזר³⁰, ולאחר מכן להמשיך להדביק אותם יחד כדי ליצור תא מרובע עם רוחב פנימי של 21 מ"מ וגובה של 10 מ"מ.
2. לאחר מכן, חברו יריעת PMMA נוספת בעובי 1 מ"מ לתחתית התא כדי לשמש כמחזיק לדיו הביולוגי.
3. הצמידו בזהירות שלושה מתמרי עופרת זירקונט טיטנאט (PZT) (כל אחד באורך 20 מ"מ, רוחב 10 מ"מ, עובי 0.7 מ"מ ובתדר תהודה ראשוני של 3 מגה-הרץ, ראו טבלת חומרים) לחלק החיצוני של שלושת הקירות האורתוגונליים של החדר, בהתאמה. ודא שמתמר PZT התחתון ממורכז מתחת לתא.
4. חוטי הלחמה לשני האזורים המוליכים של כל מתמר PZT.
5. לבסוף, אבטחו את המכשיר על בסיס חלול כדי למנוע מה-PZT התחתון לבוא במגע עם משטחי עבודה אחרים.

2. הקמת מערכת הרכבה אקוסטית

1. התחילו בהרכבת המכשיר האקוסטי על במת מיקרוסקופ, המאפשרת תצפית מלמעלה על פנים החדר.
2. מקם מיקרוסקופ דיגיטלי בצד המכשיר ללא מתמרי PZT, המאפשר תצפית צידית על פנים התא.
3. חבר באופן עצמאי את החוטים משלושת מתמרי PZT בסדרה לשלושה מגברי הספק ולשלושה ערוצי פלט של מחוללי פונקציות (ראה טבלת חומרים).
4. תכנת את ההגדרות על מחוללי הפונקציות עבור כל מתמר PZT, תוך ציון פרמטרים כגון צורת גל סינוסואידית, תדר ומשרעת.
5. כדי להבטיח עיקור, מלא את התא של המכשיר האקוסטי עם 75% אלכוהול במשך 5 דקות, ולאחר מכן ניקוי יסודי עם פתרון PBS סטרילי. לאחר מכן, להקרין את החדר עם אור UV בספסל נקי במשך מינימום של 1 שעות.

3. תרבית תאים והליך הקציר

1. התחל בגידול תאי C3A, קו תאי קרצינומה הפטוצלולרי אנושי, בבקבוק תרבית תאי T25 באמצעות מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (ראה טבלת חומרים).
2. כאשר תאי C3A מגיעים למפגש של כ-80%, בצעו מעבר תאים באופן הבא: ראשית, שטפו את תחתית בקבוק התרבית פעמיים עם PBS. לאחר מכן, הוסיפו 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לבקבוק תרבית התאים ודגרו בטמפרטורה של 37°C כדי להקל על ניתוק התא. עצור את תהליך הטריפסיניזציה על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום תרבית שלם.
3. העבר את תמיסת התא לצינור של 15 מ"ל, וצנטריפוגה אותו ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל גלולה התא.

4. הכנת הביו-דיו

1. הכינו תמיסת GelMA 6% (w/v) המכילה 0.5% (w/v) ליתיום פניל-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) על ידי המסת 0.3 גרם GelMA ו-0.025 גרם LAP (ראו טבלת חומרים) ב-5 מ"ל של תמיסת חיץ פוספט (PBS). הניחו לתערובת לשבת באמבט מים בטמפרטורה של 47°C למשך שעה אחת.
2. לפני ערבוב עם תאים, להעביר את תמיסת GelMA דרך מסנן 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) לעיקור.
3. השהה מחדש את גלולת התא שהוזכרה לעיל (שלב 3.3) בתווך תרבית התא. צבעו נפח קטן של תאים בתמיסת טריפאן כחולה של 0.4% ולאחר מכן השתמשו בהמוציטומטר נקי לספירת תאים.
4. ערבבו כמות מתאימה של תאי C3A, המחושבת על בסיס צפיפות התאים שהתקבלה לעיל, עם תמיסת GelMA מעוקרת להכנת הביודיו עם צפיפות תאים של 2 × 10⁶ תאים / מ"ל.
5. להדמיה של כדורי התאים שהורכבו, הכתימו מראש את תאי C3A על ידי דגירה שלהם עם מעקב תאים של 2 מיקרומטר (צבע DiO, ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים המסומנים בתרבית תאים טרייה שלוש פעמים לפני השימוש.

5. הרכבת כדורי התא באמצעות המכשיר האקוסטי

1. פיפטה יותר מ 1 מ"ל של bioink לתוך החדר מעוקר. ודא שהמרחק פנים אל פנים בין פני השטח הנוזליים לתחתית התא הוא כפולה שלמה של מחצית מאורך הגל האקוסטי.
   הערה: ניתן לשלוט במרחק זה על-ידי התאמת נפח הדיו הביולוגי שנוסף. ניתן להעריך את אורך הגל האקוסטי (λ) באמצעות הנוסחה λ = c/f, כאשר c מייצג את מהירות הקול בתווך, ו- f הוא התדר של מתמר PZT.
2. הפעל את מחולל הפונקציות ואת מגבר הכוח כדי להתחיל את ההפעלה של כל מתמר PZT.
   הערה: מומלץ להפעיל תחילה בנפרד כל מתמר PZT כדי להשיג את התבנית התאית האופטימלית של קו מקבילי. ניתן להשיג זאת על ידי ביצוע טאטוא תדרים בגודל צעד של 0.001 מגה-הרץ ליד תדר התהודה העיקרי עבור כל מתמר PZT. לאחר מכן, יישמו בו זמנית את האותות האופטימליים האלה על כל שלושת מתמרי PZT כדי לקבל את התבנית התאית הצפויה של נקודות תלת-ממדיות. לפני החלת כל אות קלט, ודא שהתאים מפוזרים באופן שווה בדיו הביולוגי על ידי תסיסה עדינה.
3. הצליבו את הדיו הביולוגי באמצעות אור כחול (405 ננומטר, 60 mW/cm², 30 שניות) ליצירת פיגום הידרוג'ל תלת-ממדי העוטף את אגרגטי התאים שהורכבו אקוסטית. לאחר מכן, כבה את מחולל הפונקציות ואת מגבר הכוח.
4. העבירו בזהירות את פיגום ההידרוג'ל התלת-ממדי מהחדר לצלחת פטרי וחתכו אותו לחתיכות קטנות (למשל, 2 מ"מ × 2 מ"מ × 2 מ"מ) באמצעות סכין גילוח נקי.
5. הוסף מדיום תרבית תאים לטיפוח.
   הערה: זכור לשנות את מדיום התרבות מדי יום.

6. אחזור ספרואידים של תאים

1. התחילו בהתבוננות בהיווצרות ספרואידים בשכבות שונות של הפיגומים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
2. לאחר 3 ימי תרבית, הסירו את מדיום התרבית ושטפו היטב את פיגומי ההידרוג'ל פעמיים עם PBS.
3. לדגור על הפיגומים עם יותר מ 2 מ"ל של חיץ ליזה GelMA בדילול 1: 200 עם מדיום תרבית תאים במשך 30 דקות באינקובטור התא. צעד זה נועד להמיס את פיגומי ההידרוג'ל.
4. להעביר את התמיסה מן השלב הקודם לתוך צינור ולאחר מכן צנטריפוגה אותו ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל את גלולת הספרואיד התא.
5. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה במדיום תרבית טרי ליישומים במורד הזרם.

7. ניתוח כדאיות ספרואידית

1. הערך את הכדאיות של כדורי תאים בתוך פיגומי ההידרוג'ל או בתוך הספרואידים שאוחזרו באמצעות ערכת צביעה חיה/מתה (ראה טבלת חומרים).
2. לדגור על הדגימות בנקודות זמן תרבית שונות עם 1 מ"ל של תמיסת PBS המכילה 1 μL של Calcein-AM ו 2 μL של Propidium יודיד (PI) במשך 15 דקות ב 37 ° C.
3. עבור דגימות בתוך פיגומים הידרוג'ל, לשטוף אותם ישירות עם PBS פעמיים. עבור ספרואידים שהוחזרו, צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל גלולה ספרואידית, ולשטוף אותו פעמיים לפני התצפית.
4. התבונן בדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכוד את התמונות הפלואורסצנטיות.
5. חשב את היחס בין האזור המוכתם ב- Calcein-AM לשטח הכולל המוכתם הן ב- Calcein-AM והן ב- PI באמצעות ImageJ כדי לקבוע את הכדאיות הספרואידית.

תוצאות

מחקר זה תכנן התקן הרכבה אקוסטית תלת מימדית לייצור המוני של ספרואידים תאיים. המכשיר האקוסטי כלל תא מרובע עם שני מתמרי PZT המחוברים למישור X ולמישור Y על פני השטח החיצוניים של התא ומתמר PZT אחד בתחתית התא (איור 1A,B). שלושה ערוצי פלט משני מחוללי פונקציות חוברו לשלושה מגברי ...

Discussion

ייצור יעיל ויציב של ספרואידים של תאים עם תפוקה גבוהה באמצעות טכנולוגיות כמו התקן ההרכבה האקוסטית התלת-ממדית טומן בחובו הבטחה גדולה לקידום הנדסה ביו-רפואית וסינון תרופות ^1,2,3. גישה זו מפשטת את הייצור ההמוני של ספרואידים תאים באמצעות הליכי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22-μm filter	Merck	SLGSM33SS	Used for GelMA solution sterilization
35 mm-cell culture dish	Corning	430165	Used for culturing cells
Confocal microscope	Nikon	A1RHD25	Fluorescent cell observation
DiO dye	Beyotime	C1038	Dye used to stain cells
DMEM	Gibco	12430054	Cell culture media
FBS	Gibco	10099141C	Cell culture media supplement
Function generator	Rigol	DG5352	For RF signal generation
GelMA	Regenovo	none	Used to prepare bioink
GelMA lysis buffer	EFL	EFL-GM-LS-001	Used to dissolve GelMA scaffolds
Inverted microscope	Nikon	Ti-U	Cell observation
LAP	Sigma-Aldrich	900889	Used as photoinitiator
Live-Dead kit	Beyotime	C2015M	Cell vability analysis
PBS	Gibco	10010002	Used as buffer
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070063	Prevent cell culture contamination
Power amplifer	Minicircuit	LCY-22+	Increase the voltage amplitude of the RF signal
PZT transducers	Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd.	PZT-41	Functional units for acoustic assembly device
T25 cell culture flask	Corning	430639	Used for culturing cells
Trypan blue	Gibco	15250061	Cell counting
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Cell dissociation enzyme