JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تعتبر كرويات الخلايا نموذجا محتملا في مجال التطبيقات البيولوجية. توضح هذه المقالة بروتوكولات لتوليد كرويات الخلايا بشكل متطور باستخدام جهاز تجميع صوتي 3D ، والذي يوفر طريقة فعالة للتصنيع القوي والسريع للكرويات الخلوية الموحدة.

Abstract

كرويات الخلية واعدة ثلاثية الأبعاد (3D) النماذج التي اكتسبت تطبيقات واسعة في العديد من المجالات البيولوجية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لتصنيع كرويات الخلايا عالية الجودة وعالية الإنتاجية باستخدام جهاز تجميع صوتي 3D من خلال إجراءات قابلة للمناورة. يتكون جهاز التجميع الصوتي من ثلاثة محولات طاقة تيتانات الزركونات الرصاص (PZT) ، كل منها مرتب في المستوى X / Y / Z لغرفة بولي ميثيل ميثاكريلات مربعة (PMMA). يتيح هذا التكوين إنشاء نمط صفيف نقطي 3D للعقد الصوتية المرفوعة (LANs) عند تطبيق ثلاث إشارات. نتيجة لذلك ، يمكن دفع الخلايا الموجودة في محلول الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA) إلى الشبكات المحلية ، لتشكيل مجاميع خلايا موحدة في ثلاثة أبعاد. ثم يتم معالجة محلول GelMA بالأشعة فوق البنفسجية وتشابكه ليكون بمثابة سقالة تدعم نمو مجاميع الخلايا. أخيرا ، يتم الحصول على كتل من الكرويات الناضجة واسترجاعها عن طريق إذابة سقالات GelMA لاحقا في ظل ظروف معتدلة. سيمكن جهاز تجميع الخلايا الصوتية 3D الجديد المقترح من تصنيع كرويات الخلايا ، وحتى المواد العضوية ، مما يوفر تقنية محتملة كبيرة في المجال البيولوجي.

Introduction

تم التعرف على نماذج الزراعة ثلاثية الأبعاد في المختبر ، والتي توفر المزيد من الخصائص الهيكلية والمورفولوجية الشبيهة بالجسم الحي مقارنة بنماذج الثقافة ثنائية الأبعاد التقليدية ، كأنظمة واعدة في مختلف التطبيقات الطبية الحيوية مثل هندسة الأنسجة ونمذجة الأمراض وفحص الأدوية1،2،3. كنوع واحد من نموذج الثقافة ثلاثية الأبعاد ، تشير كرويات الخلايا عادة إلى تجميع الخلايا ، مما يخلق هياكل كروية ثلاثية الأبعاد تتميز بتفاعلات خلية خلية ومصفوفة خليةمحسنة 4،5،6. لذلك ، أصبح تصنيع كرويات الخلايا أداة قوية لتمكين الدراسات البيولوجية المتنوعة.

تم تطوير تقنيات مختلفة ، بما في ذلك القطرة المعلقة7 ، أو الألواح غير اللاصقة8 ، أو أجهزة microwell9 ، للحصول على كرويات. من حيث المبدأ ، تسهل هذه الطرق عادة تجميع الخلايا من خلال استخدام القوى الفيزيائية مثل قوة الجاذبية مع تقليل التفاعلات بين الخلايا والركيزة. ومع ذلك ، فإنها غالبا ما تنطوي على عمليات كثيفة العمالة ، وذات إنتاجية منخفضة ، وتشكل تحديات للتحكم في حجم كروي10,11. الأهم من ذلك ، أن إنتاج كرويات بالحجم المطلوب والتوحيد بكمية كافية له أهمية قصوى لتلبية تطبيقات بيولوجية محددة. على عكس الطرق المذكورة أعلاه ، أظهرت الموجات الصوتية ، كنوع واحد من التقنيات التي تحركها القوة الخارجية12،13،14 ، إمكانية التصنيع الشامل للكرويات الخلوية بجودة عالية وإنتاجية عالية ، بناء على مبدأ تعزيز تجميع الخلايا من خلال القوى الخارجية15،16،17،18. على عكس القوى الكهرومغناطيسية أو المغناطيسية ، فإن تقنيات معالجة الخلايا القائمة على الصوت غير جراحية وخالية من الملصقات ، مما يتيح تكوين كروي مع توافق حيوي ممتاز19,20.

بشكل عام ، تم تطوير الموجات الصوتية السطحية الدائمة (SAWs) والأجهزة القائمة على الموجات الصوتية السائبة (BAWs) لتوليد كرويات ، باستخدام العقد الصوتية (ANs) التي تنتجها الحقول الصوتية الدائمةالمقابلة 21،22،23. على وجه الخصوص ، اكتسبت أجهزة التجميع الصوتية القائمة على BAWs ، مع مزايا التصنيع المريح والتشغيل السهل وقابلية التوسع الممتازة ، الانتباه لتصنيع كرويات الخلية24,25. لقد قمنا مؤخرا بتطوير جهاز تجميع صوتي سهل قائم على BAWs مع القدرة على توليد كرويات ذات إنتاجية عالية26. يتكون الجهاز المقترح من غرفة مربعة متعددة الميثيل ميثاكريلات (PMMA) مع ثلاثة محولات تيتانات الزركونات الرصاص (PZT) مرتبة على التوالي في المستوى X / Y / Z. يتيح هذا الترتيب إنشاء نمط صفيف نقطي 3D للعقد الصوتية المرفوعة (LANs) لتجميع خلايا القيادة. بالمقارنة مع الأجهزة المستندة إلى BAWs أو SAWs التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، والتي يمكنها فقط إنشاء مجموعة 1D أو 2D من ANs27،28،29 ، يتيح الجهاز الحالي مجموعة نقطية ثلاثية الأبعاد من شبكات LAN لتشكيل إجمالي الخلايا السريع داخل محلول الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA). بعد ذلك ، نضجت مجاميع الخلايا إلى كرويات ذات قابلية عالية للبقاء داخل سقالات GelMA المعالجة ضوئيا بعد ثلاثة أيام من الزراعة. أخيرا ، تم الحصول بسهولة على عدد كبير من الأجسام الكروية ذات الحجم الموحد من سقالات GelMA للتطبيقات النهائية.

Protocol

1. تصنيع جهاز التجميع الصوتي 3D

  1. ابدأ بإعداد أربع صفائح PMMA بسمك 1 مم من خلال القطعبالليزر 30 ، ثم تابع لصقها معا لتشكيل غرفة مربعة بعرض داخلي 21 مم وارتفاع 10 مم.
  2. بعد ذلك ، قم بتوصيل ورقة PMMA أخرى بسمك 1 مم في أسفل الغرفة لتكون بمثابة حامل للحبر الحيوي.
  3. قم بتثبيت ثلاثة محولات طاقة من تيتانات الرصاص (PZT) بعناية (يبلغ طول كل منها 20 مم ، وعرضها 10 مم ، وسمكها 0.7 مم ، وبتردد رنين أولي يبلغ 3 ميجاهرتز ، انظر جدول المواد) على السطح الخارجي للجدران المتعامدة الثلاثة للغرفة ، على التوالي. تأكد من توسيط محول الطاقة PZT السفلي أسفل الحجرة.
  4. أسلاك اللحام إلى المنطقتين الموصلتين لكل محول طاقة PZT.
  5. أخيرا ، قم بتثبيت الجهاز على قاعدة مجوفة لمنع PZT السفلي من ملامسة أسطح العمل الأخرى.

2. إعداد نظام التجميع الصوتي

  1. ابدأ بتركيب الجهاز الصوتي على منصة المجهر ، مما يسمح بمراقبة الرؤية العلوية لداخل الغرفة.
  2. ضع مجهرا رقميا على جانب الجهاز خاليا من محولات الطاقة PZT ، مما يتيح مراقبة الرؤية الجانبية للغرفة من الداخل.
  3. قم بتوصيل الأسلاك بشكل مستقل من محولات الطاقة PZT الثلاثة في سلسلة بثلاثة مضخمات طاقة وثلاث قنوات إخراج لمولدات الوظائف (انظر جدول المواد).
  4. قم ببرمجة الإعدادات على مولدات الوظائف لكل محول طاقة PZT ، مع تحديد المعلمات مثل شكل الموجة الجيبية والتردد والسعة.
  5. لضمان التعقيم ، املأ حجرة الجهاز الصوتي بنسبة 75٪ كحول لمدة 5 دقائق ، متبوعا بتنظيف شامل بمحلول PBS معقم. بعد ذلك ، قم بإشعاع الغرفة بضوء الأشعة فوق البنفسجية في مقعد نظيف لمدة لا تقل عن 1 ساعة.

3. زراعة الخلايا وإجراءات الحصاد

  1. ابدأ بزراعة خلايا C3A ، وهي خط خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية ، في دورق زراعة الخلايا T25 باستخدام وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (انظر جدول المواد).
  2. عندما تصل خلايا C3A إلى التقاء 80٪ تقريبا ، قم بإجراء مرور الخلية على النحو التالي: أولا ، اغسل الجزء السفلي من قارورة الثقافة مرتين باستخدام PBS. ثم أضف 2 مل من 0.05٪ تربسين-EDTA إلى دورق زراعة الخلايا واحتضانه عند 37 درجة مئوية لتسهيل انفصال الخلايا. أوقف عملية التربسين بإضافة 2 مل من وسط الاستزراع الكامل.
  3. انقل محلول الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل ، وقم بطرده مركزيا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حبيبات خلوية.

4. إعداد الحبر الحيوي

  1. تحضير محلول GelMA 6٪ (وزن / حجم) يحتوي على 0.5٪ (وزن / حجم) ليثيوم فينيل -2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات (LAP) عن طريق إذابة 0.3 جم من GelMA و 0.025 جم من LAP (انظر جدول المواد) في 5 مل من محلول الفوسفات العازل (PBS). اترك الخليط في حمام مائي 47 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. قبل الاختلاط مع الخلايا ، مرر محلول GelMA من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) للتعقيم.
  3. أعد تعليق حبيبات الخلية المذكورة أعلاه (الخطوة 3.3) في وسط زراعة الخلايا. قم بتلطيخ كمية صغيرة من الخلايا بمحلول أزرق تريبان بنسبة 0.4٪ ثم استخدم مقياس دم نظيف لعد الخلايا.
  4. امزج كمية مناسبة من خلايا C3A ، محسوبة بناء على كثافة الخلية التي تم الحصول عليها أعلاه ، مع محلول GelMA المعقم لتحضير الحبر الحيوي بكثافة خلية تبلغ 2 × 106 خلايا / مل.
  5. لتصور كرويات الخلايا المجمعة ، قم بتلطيخ خلايا C3A مسبقا عن طريق احتضانها بجهاز تعقب خلايا 2 ميكرومتر (صبغة DiO ، انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا المصنفة بوسط زراعة الخلايا الطازجة ثلاث مرات قبل الاستخدام.

5. تجميع كرويات الخلية باستخدام الجهاز الصوتي

  1. ماصة أكثر من 1 مل من الحبر الحيوي في الغرفة المعقمة. تأكد من أن المسافة وجها لوجه بين سطح السائل وقاع الغرفة هي مضاعف عدد صحيح لنصف الطول الموجي الصوتي.
    ملاحظة: يمكن للمرء التحكم في هذه المسافة عن طريق ضبط حجم الحبر الحيوي المضاف. يمكن تقدير الطول الموجي الصوتي (λ) باستخدام الصيغة λ = c / f ، حيث يمثل c سرعة الصوت في الوسط ، و f هو تردد محول الطاقة PZT.
  2. قم بتشغيل مولد الوظائف ومضخم الطاقة لبدء تشغيل كل محول طاقة PZT.
    ملاحظة: يوصى بتشغيل كل محول طاقة PZT بشكل فردي أولا لتحقيق النمط الخلوي الأمثل للخط المتوازي. يمكن تحقيق ذلك عن طريق إجراء مسح تردد بحجم خطوة 0.001 ميجاهرتز بالقرب من تردد الرنين الأساسي لكل محول طاقة PZT. بعد ذلك ، قم بتطبيق هذه الإشارات المثلى في وقت واحد على جميع محولات الطاقة PZT الثلاثة للحصول على النمط الخلوي 3D-dot المتوقع. قبل تطبيق كل إشارة دخل ، تأكد من تشتيت الخلايا بالتساوي في الحبر الحيوي عن طريق التقليب برفق.
  3. قم بربط الحبر الحيوي باستخدام الضوء الأزرق (405 نانومتر ، 60 ميجاوات / سم2 ، 30 ثانية) لإنشاء سقالة هيدروجيل ثلاثية الأبعاد تغلف مجاميع الخلايا المجمعة صوتيا. بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل مولد الوظائف ومضخم الطاقة.
  4. انقل سقالة هيدروجيل ثلاثية الأبعاد بعناية من الحجرة إلى طبق بتري وقطعها إلى قطع صغيرة (على سبيل المثال ، 2 مم × 2 مم × 2 مم) باستخدام ماكينة حلاقة نظيفة.
  5. إضافة وسط زراعة الخلايا للزراعة.
    ملاحظة: تذكر تغيير وسيلة الثقافة كل يوم.

6. استرجاع كرويات الخلية

  1. ابدأ بمراقبة تكوين كروي في طبقات مختلفة من السقالات باستخدام مجهر مقلوب.
  2. بعد 3 أيام من الثقافة ، قم بإزالة وسط الثقافة واغسل سقالات الهيدروجيل جيدا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني.
  3. احتضان السقالات بأكثر من 2 مل من محلول تحلل GelMA بتخفيف 1: 200 مع وسط زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة في حاضنة الخلايا. تهدف هذه الخطوة إلى إذابة سقالات الهيدروجيل.
  4. انقل المحلول من الخطوة السابقة إلى أنبوب ثم قم بطرده مركزيا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حبيبات كروية الخلية.
  5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في وسط استزراع جديد للتطبيقات النهائية.

7. تحليل الجدوى الكروية

  1. تقييم صلاحية كرويات الخلية إما داخل سقالات هيدروجيل أو في الكرويات المسترجعة باستخدام مجموعة تلطيخ حية / ميتة (انظر جدول المواد).
  2. احتضان العينات في نقاط زمنية مختلفة مع 1 مل من محلول PBS يحتوي على 1 ميكرولتر من Calcein-AM و 2 ميكرولتر من Propidium Iodide (PI) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. بالنسبة للعينات داخل سقالات الهيدروجيل ، اغسلها مباشرة باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين. بالنسبة للكرويات المسترجعة ، يتم استخدام أجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حبيبات كروية ، وغسلها مرتين قبل المراقبة.
  4. راقب العينات باستخدام مجهر مضان والتقط صور مضان.
  5. احسب نسبة المساحة الملطخة ب Calcein-AM إلى المساحة الإجمالية الملطخة بكل من Calcein-AM و PI باستخدام ImageJ لتحديد صلاحية الكروية.

النتائج

صممت هذه الدراسة جهاز تجميع صوتي 3D للتصنيع الشامل للكرويات الخلوية. يتألف الجهاز الصوتي من غرفة مربعة مع محولي طاقة PZT متصلين بالمستوى X والمستوى Y على السطح الخارجي للغرفة ومحول طاقة PZT واحد في قاع الغرفة (الشكل 1A ، B). تم توصيل ثلاث قنوات إخراج من مولدين وظيفيين بثل?...

Discussion

إن التصنيع الفعال والمستقر للكرويات الخلوية ذات الإنتاجية العالية باستخدام تقنيات مثل جهاز التجميع الصوتي ثلاثي الأبعاد يحمل وعدا كبيرا لتطوير الهندسة الطبية الحيوية وفحص الأدوية1،2،3. يبسط هذا النهج الإنتاج الضخم للكرويات الخلوية من خ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم عمل Tis من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFA1104600) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة تشجيانغ في الصين (LQ23H160011).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22-μm filterMerckSLGSM33SSUsed for GelMA solution sterilization
35 mm-cell culture dishCorning430165Used for culturing cells
Confocal microscopeNikonA1RHD25Fluorescent cell observation
DiO dyeBeyotimeC1038Dye used to stain cells
DMEMGibco12430054Cell culture media
FBSGibco10099141CCell culture media supplement
Function generatorRigolDG5352For RF signal generation
GelMARegenovononeUsed to prepare bioink
GelMA lysis bufferEFLEFL-GM-LS-001Used to dissolve GelMA scaffolds
Inverted microscopeNikonTi-UCell observation
LAPSigma-Aldrich900889Used as photoinitiator
Live-Dead kitBeyotimeC2015MCell vability analysis
PBSGibco10010002Used as buffer
Penicillin-streptomycinGibco15070063Prevent cell culture contamination
Power ampliferMinicircuitLCY-22+Increase the voltage amplitude of the RF signal
PZT transducersYantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd.PZT-41Functional units for acoustic assembly device
T25 cell culture flaskCorning430639Used for culturing cells
Trypan blue Gibco15250061Cell counting
Trypsin-EDTA Gibco25200056Cell dissociation enzyme

References

  1. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
  4. Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
  5. Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
  6. Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
  7. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
  8. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  9. Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
  10. Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
  11. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
  12. Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
  13. Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
  14. Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
  15. Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
  16. Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
  17. Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
  18. Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
  19. Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
  20. Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
  21. Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
  22. Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
  23. Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
  24. Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
  25. Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
  26. Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
  27. Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
  28. Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
  29. Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
  30. Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

200 GelMA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved