Cuantificación de las propiedades elásticas de las biopelículas ambientales mediante elastografía de coherencia óptica

Resumen

Este artículo destaca la eficacia de la técnica de elastografía de coherencia óptica (OCE) en la caracterización rápida y no destructiva de las propiedades elásticas de la biopelícula. Aclaramos los procedimientos críticos de implementación de OCE para mediciones precisas y presentamos los valores del módulo de Young para dos biopelículas granulares.

Resumen

Las biopelículas son biomateriales complejos que comprenden una red bien organizada de células microbianas encerradas en sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de producción propia. En este artículo se presenta una descripción detallada de la implementación de medidas de elastografía de coherencia óptica (OCE) adaptadas para la caracterización elástica de biopelículas. OCE es una técnica óptica no destructiva que permite el mapeo local de la microestructura, morfología y propiedades viscoelásticas de materiales blandos parcialmente transparentes con alta resolución espacial y temporal. Proporcionamos una guía completa que detalla los procedimientos esenciales para la correcta implementación de esta técnica, junto con una metodología para estimar el módulo de Young de biopelículas granulares a partir de las mediciones recolectadas. Estos consisten en la configuración del sistema, la adquisición de datos y el posprocesamiento. En la discusión, profundizamos en la física subyacente de los sensores utilizados en OCE y exploramos las limitaciones fundamentales con respecto a las escalas espaciales y temporales de las mediciones de OCE. Concluimos con posibles direcciones futuras para avanzar en la técnica OCE para facilitar las mediciones elásticas de biopelículas ambientales.

Introducción

En el tratamiento de aguas residuales y la recuperación de recursos hídricos, las biopelículas beneficiosas en los reactores de crecimiento adjuntos se emplean cada vez más para permitir que los microbios conviertan contaminantes indeseables, como la materia orgánica, el nitrógeno y el fosfato, en formas estabilizadas que puedan eliminarse fácilmente^{del agua.} En estos sistemas, la función emergente de la biopelícula, es decir, las transformaciones bioquímicas, está estrechamente asociada con la diversidad de microbios que residen en ella y los nutrientes que estos microbios reciben². En consecuencia, el crecimiento continuo de la biopelícula puede plantear un desafío para mantener la funcionalidad constante del reactor porque el crecimiento de la nueva biopelícula puede alterar los procesos metabólicos generales de la biopelícula, las características de transferencia de masa y la composición de la comunidad. Estabilizar el entorno de la biopelícula tanto como sea posible puede proteger contra tales cambios³. Esto incluye garantizar un flujo constante de nutrientes y mantener estable la estructura de la biopelícula con un espesor constante⁴. El monitoreo de la rigidez y la estructura física de la biopelícula permitiría a los investigadores obtener información sobre la salud general y el funcionamiento de la biopelícula.

Las biopelículas presentan propiedades viscoelásticas ^5,6,7. Esta naturaleza viscoelástica da como resultado una combinación de una deformación instantánea y lenta, dependiente del tiempo, en respuesta a fuerzas mecánicas externas. Un aspecto único de las biopelículas es que, cuando se someten a una deformación sustancial, responden como líquidos viscosos. Por el contrario, cuando se someten a una deformación menor, su respuesta es comparable a la de los sólidos⁵. Además, dentro de esta región de pequeña deformación, existe un rango de deformación bajo el cual las biopelículas exhiben una relación lineal fuerza-desplazamiento ^5,6,7. Las deformaciones dentro de este rango lineal son óptimas para evaluar las características mecánicas de la biopelícula, ya que producen mediciones reproducibles. Varias técnicas pueden cuantificar la respuesta elástica dentro de este rango. La elastografía de coherencia óptica (OCE) es una técnica emergente que se está adaptando para el análisis de biopelículas en este rango lineal (deformaciones del orden de 10-4-10-5)^8,9.

La aplicación más consolidada de OCE hasta el momento es en el campo biomédico, donde la técnica se ha aplicado para caracterizar tejidos biológicos que solo requieren un acceso óptico superficial. Por ejemplo, Li et al. utilizaron OCE para caracterizar las propiedades elásticas del tejido cutáneo¹⁰. Otros autores caracterizaron las propiedades elásticas anisotrópicas de los tejidos corneales porcinos y humanos y cómo se ven afectados por la presión intraocular 11,12,13,14,15,16. Algunas ventajas del método OCE para el estudio de biopelículas son que no es destructivo y proporciona una resolución espacial de mesoescala, no requiere ninguna preparación de la muestra y el método en sí es rápido; Proporciona mediciones corregistradas de la estructura física y las propiedades elásticas (p. ej., porosidad, rugosidad superficial y morfología)8,9,17,18.

El método OCE mide el desplazamiento local de las ondas elásticas que se propagan en una muestra utilizando tomografía de coherencia óptica sensible a la fase (OCT). La OCT es un interferómetro óptico de baja coherencia que transforma los cambios locales en el desplazamiento de la muestra en un cambio de intensidad que se registra con un espectrómetro óptico. La técnica OCT también se ha utilizado en la investigación de biopelículas para la caracterización de la estructura de mesoescala, la distribución de la porosidad en tres dimensiones y la deformación de la biopelícula 17,19,20,21. Además, Picioreanu et al. estimaron las propiedades mecánicas de la biopelícula utilizando el modelado inverso de la interacción fluido-estructura de imágenes de deformación de la sección transversal de OCT²².

Por otro lado, las mediciones de OCE, junto con el modelado de ondas elastodinámicas inversas, producen la velocidad de onda de las ondas elásticas en la muestra, lo que permite la caracterización de las propiedades elásticas y viscoelásticas de la muestra. Nuestro grupo adaptó la técnica OCE para la medición cuantitativa de las propiedades elásticas y viscoelásticas de la biopelícula ^8,9,18 y validó la técnica frente a las mediciones de reometría de cizallamiento en muestras de placas de gel de agarosa¹⁸. El enfoque OCE proporciona estimaciones precisas y fiables de las propiedades de la biopelícula, ya que la velocidad de onda elástica medida se correlaciona con las propiedades elásticas de la muestra. Además, la caída espacial de la amplitud de la onda elástica se puede correlacionar directamente con las propiedades viscoelásticas debido a los efectos viscosos en el material. Hemos reportado mediciones OCE de las propiedades viscoelásticas de biopelículas bacterianas de cultivo mixto cultivadas en cupones en un reactor anular giratorio (RAR) y biopelículas granulares con geometrías complejas utilizando modelos de ondas elastodinámicas¹⁸.

La técnica OCE es también una potente alternativa a la reometría tradicional¹⁸que se utiliza para la caracterización viscoelástica. Los métodos de reometría son los más adecuados para muestras con geometría plana. Como tal, las biopelículas granulares, que tienen formas y morfologías superficiales arbitrarias, no se pueden caracterizar con precisión en un reómetro ^8,23. Además, a diferencia de la OCE, los métodos de reometría pueden ser difíciles de adaptar para mediciones en tiempo real, por ejemplo, durante el crecimiento de la biopelícula en las células de flujo^24,25.

En este artículo, mostramos que las mediciones OCE de la velocidad de onda independiente de la frecuencia de las ondas superficiales se pueden utilizar para caracterizar las propiedades elásticas de la biopelícula sin la necesidad de modelos complicados. Este desarrollo hará que el enfoque OCE sea más accesible para la comunidad de biopelículas en general para estudiar las propiedades mecánicas de las biopelículas.

La Figura 1 muestra una ilustración esquemática del sistema OCT utilizado en este estudio. El sistema incorpora varios instrumentos, incluido un sistema OCT comercial sensible a la fase en el dominio espectral, un generador de retardo, un generador de funciones y un transductor piezoeléctrico. El sistema OCT funciona según el principio de interferometría mediante el empleo de una fuente de luz de banda ancha con una longitud de onda central de 930 nm. La intensidad de la luz recopilada, que se correlaciona con los intrincados detalles estructurales de la muestra, se analiza en la unidad de posprocesamiento y luego se convierte en una imagen transversal de la muestra, comúnmente conocida como imagen OCT. La profundidad de la imagen de la OCT depende de la gravedad de la dispersión óptica en la muestra que se deriva de la variación local en el índice de refracción y se limita a 1-3 mm en tejidos biológicos y biopelículas. Dado que la fase óptica de la muestra y la intensidad de la interferencia se modulan por el movimiento, la OCT se puede utilizar para detectar el desplazamiento local de la muestra. Aprovechamos la sensibilidad de desplazamiento de la OCT en el método OCE para rastrear el campo de desplazamiento en estado estacionario de las ondas elásticas en la muestra. Específicamente, el generador de funciones emite un voltaje sinusoidal para accionar el transductor piezoeléctrico. El transductor, a su vez, se estira y se contrae con un historial de tiempo oscilatorio. El desplazamiento oscilatorio del transductor imparte una fuerza sinusoidal sobre la superficie de la muestra a través de una punta de cuña impresa en 3D en el vértice del transductor, lo que conduce a la generación de ondas elásticas armónicas en la muestra. La punta de cuña hace un ligero contacto con la muestra, de modo que la muestra permanece intacta después de que el actuador se retrae de la superficie de la muestra. Para registrar el desplazamiento local en la muestra, se adquieren escaneos de profundidad adyacentes separados por un retardo de tiempo fijo en cada píxel de la muestra. La diferencia de fase óptica entre escaneos consecutivos en cada punto de píxel es proporcional al desplazamiento vertical local en el mismo punto. La sincronización entre el desplazamiento del transductor y la óptica de barrido en el sistema OCT se logra a través de un pulso de disparo que se origina en el generador de funciones y se retarda en el generador de retardo. Este paso de sincronización facilita la adquisición de imágenes transversales consistentes de la distribución de fase óptica local en la muestra. Estas imágenes son directamente proporcionales al desplazamiento armónico vertical local en la muestra y se conocen como imagen OCE. Las imágenes OCE se adquieren a diferentes frecuencias de accionamiento del transductor para obtener la longitud de onda elástica y la velocidad de la onda en función de la frecuencia. Las velocidades de onda medidas se analizan con un modelo elastodinámico para determinar las propiedades elásticas de la muestra.

Protocolo

1. Configuración del sistema

1. Reúna los componentes del sistema que incluyen el sistema OCT comercial (unidad base, soporte, cabezal de imágenes y computadora), generador de forma de onda, transductor, generador de retardo/pulso, un interruptor con conexiones BNC, cables y adaptadores BNC, postes ópticos y abrazaderas.
2. Conecte la señal de sincronización del generador de funciones a un interruptor. Conecte el otro puerto del switch al generador de retardo.
3. Conecte la salida del generador de funciones a los cables del transductor.
4. Conecte las salidas del generador de retardo al canal de disparo en la parte posterior de la unidad base OCT. La señal de salida del generador de retardo es un pulso de disparo para iniciar el movimiento de la óptica de escaneo en el sistema OCT.
5. Encienda los componentes del sistema (unidad base OCT, computadora, generador de funciones y generador de retardo) e inicie el software OCT.
6. Configure el generador de retardo para enviar una señal de disparo lógico de transistor-transistor a la unidad base OCT. Consulte el manual del sistema OCT para conocer los requisitos de la señal de disparo.
7. Coloque el transductor debajo de la lente OCT. El transductor tiene una punta de cuña impresa en 3D pegada en uno de sus extremos que sirve como fuente de línea para las ondas elásticas.

2. Adquisición de imágenes

1. En el software OCT, seleccione el modo de adquisición Doppler y habilite el disparador externo.
2. Coloque la biopelícula granular debajo de la lente en un portamuestras y muévala hacia la punta del transductor utilizando una etapa de traducción. Asegúrese de que el transductor haga contacto suave con la superficie de la muestra, como se muestra en la Figura 2. Se utilizaron dos biofilms granulares (también conocidos como lodos granulares) con diferentes diámetros nominales (4,3 mm y 3,3 mm). Esta selección se realizó para investigar el impacto del tamaño de la biopelícula en sus propiedades mecánicas. Estos se obtuvieron comercialmente.
   NOTA: El portamuestras empleado en este estudio consiste en una placa de plástico impresa en 3D con múltiples hendiduras semiesféricas. Este soporte no permite realizar mediciones en condiciones nativas. Por lo tanto, introdujimos agua del entorno natural durante las mediciones para evitar que la muestra se secara.
3. Especifique la región de exploración haciendo clic en los puntos inicial y final de la línea de interés (ruta de propagación de ondas) en la ventana del monitor de muestra. Centre esta línea con respecto a la punta del transductor y asegúrese de que esté perpendicular al borde de la punta.
4. Especifique el número de píxeles a lo largo de la región de escaneo y la profundidad de la muestra y aumente el número de escaneos B (imágenes transversales 2D) que se registrarán para mejorar la relación señal-ruido de las imágenes OCE. Los resultados presentados se obtuvieron utilizando 1523 píxeles a lo largo de la ruta de escaneo y 1024 píxeles a lo largo de la profundidad. Se realizaron un total de 50 B-scans.
5. Haga clic en el botón Escanear y encienda el interruptor. Las imágenes OCT y OCE deben aparecer en la pantalla. Active el interruptor dentro del tiempo de espera del disparo y el tiempo de preparación del escaneo.
6. Asegúrese de que la intensidad de referencia esté dentro del rango óptimo y coloque la muestra dentro de la región focal del objetivo del microscopio OCT. Una muestra correctamente enfocada debe tener su borde superior cerca de la parte superior de la imagen.
7. Ajuste el contorno de fase en la imagen OCE en la barra de herramientas de visualización aumentando el valor más alto de la barra de color del lado izquierdo y disminuyendo el valor más bajo de la barra de color del lado derecho. Esto aumentará el contraste de los flecos.
8. Configure el generador de funciones para producir una tensión sinusoidal de frecuencia única pulsando el botón Sinusoidal en el panel frontal y especifique la frecuencia de excitación inicial para las mediciones. Las mediciones de este estudio comienzan en 4 kHz y terminan en 9,6 kHz. Habilite el conector de salida presionando la tecla de salida.
9. Establezca un voltaje aceptable para la medición. Este valor debe maximizar la visibilidad de los flecos, pero también evitar el ajuste de fases. Para las biopelículas de este estudio y el rango de frecuencia de las mediciones, un voltaje entre 5 y 10 V suele dar como resultado un mapa de fases con buen contraste.
10. Adquiera las imágenes OCT y OCE haciendo clic en el botón Grabar .
11. Repita las mediciones a diferentes frecuencias para obtener imágenes transversales del campo de onda elástico con diferentes longitudes de onda (o períodos de franja).

3. Análisis de imágenes

1. Obtener el tamaño físico de los píxeles. El tamaño físico de píxel en x se obtiene dividiendo el campo de visión en la dirección x por el tamaño de la imagen en la dirección x y luego multiplicándolo por un factor de dos. El tamaño físico de píxel en z se obtiene dividiendo el campo de visión en la dirección z por el tamaño de la imagen en la dirección z. Los valores de campo de visión y tamaño de imagen se almacenan en la matriz de estructura con la información de la imagen a la que se puede acceder con la función OCTFileOpen proporcionada en el SDK de MATLAB en el paquete ThorImageOCT.
2. Obtenga las matrices OCT y OCE utilizando las funciones OCTFileGetIntensity y OCTFileGetPhase, respectivamente, y tome el promedio de las tramas grabadas. Estas funciones se proporcionan en el SDK de MATLAB en el paquete ThorImageOCC.
3. Obtenga las ubicaciones de los píxeles del borde superior de la muestra binarizando la imagen y detectando los píxeles blancos de arriba a abajo para cada columna.
4. Extraiga la distribución de fase de la imagen OCE a lo largo de este borde utilizando la función improfile y calcule la longitud de arco acumulada en dimensiones reales. Calcule la longitud del arco tomando la suma acumulada de la norma de diferencias escaladas entre puntos consecutivos en las direcciones x y z.
5. Calcule la transformada de Fourier rápida espacial de la distribución de fase OCT medida (es decir, a partir de las imágenes OCE) con respecto a la longitud de arco acumulada utilizando la función plomb.
6. Determine la ubicación del pico en el espectro. Esta ubicación representa la frecuencia espacial de la onda. Calcule la velocidad de onda (o velocidad de fase) a partir de la relación entre la frecuencia de excitación del transductor (unidades de Hz) y la frecuencia espacial (unidad de longitud inversa).

Resultados

En este estudio, se utilizaron biopelículas granulares (también conocidas como lodos granulares), que se obtuvieron comercialmente. Los gránulos son biopelículas esféricas que se forman a través de la autoagregación, lo que significa que no requieren un portador o superficie sobre la cual crecer²⁶. La Figura 3A muestra una imagen representativa de OCT de corte transversal que surge debido a la variación espacial del índice de refracción loc...

Discusión

La profundidad de imagen alcanzable en el sistema OCT está determinada por el grado de penetración de la luz de la fuente de luz, que depende de la longitud de onda de la fuente. Además, la longitud de onda determina la resolución axial. Las longitudes de onda más largas pueden penetrar más profundamente en la muestra, pero a expensas de una resolución axial reducida en comparación con las longitudes de onda más cortas. La resolución transversal, por otro lado, depende tanto de la apertura numérica del sistema...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printed sample holder
3D printed wedge tip			3 mm width
BNC cables	Any brand
Delay generator	Stanford Research Systems	DG535	DG535 Digital delay/ Pulse Generator
Function generator	Agilent Technologies		33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator
Granular biofilm	Aqua-Aerobic Systems		Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB	MathWorks		Release 2022a (MATLAB 9.12)
Piezoelectric transducer	Thorlabs	PK2JUP1	Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement
SD-OCT System	Thorlabs		Ganymede II, LSM03 scan lens
ThorImageOCT	Thorlabs		Version: 5.5.5