Quantificazione delle proprietà elastiche dei biofilm ambientali utilizzando l'elastografia a coerenza ottica

Riepilogo

Questo articolo evidenzia l'efficacia della tecnica dell'elastografia a coerenza ottica (OCE) nel caratterizzare rapidamente e in modo non distruttivo le proprietà elastiche del biofilm. Chiariamo le procedure critiche di implementazione OCE per misurazioni accurate e presentiamo i valori del modulo di Young per due biofilm granulari.

Abstract

I biofilm sono biomateriali complessi che comprendono una rete ben organizzata di cellule microbiche racchiuse in sostanze polimeriche extracellulari (EPS) autoprodotte. Questo articolo presenta un resoconto dettagliato dell'implementazione di misure di elastografia a coerenza ottica (OCE) su misura per la caratterizzazione elastica dei biofilm. L'OCE è una tecnica ottica non distruttiva che consente la mappatura locale della microstruttura, della morfologia e delle proprietà viscoelastiche di materiali morbidi parzialmente trasparenti con un'elevata risoluzione spaziale e temporale. Forniamo una guida completa che descrive in dettaglio le procedure essenziali per la corretta implementazione di questa tecnica, insieme a una metodologia per stimare il modulo di Young dei biofilm granulari dalle misurazioni raccolte. Questi consistono nella configurazione del sistema, nell'acquisizione dei dati e nella post-elaborazione. Nella discussione, approfondiamo la fisica sottostante dei sensori utilizzati in OCE ed esploriamo i limiti fondamentali per quanto riguarda le scale spaziali e temporali delle misurazioni OCE. Concludiamo con le potenziali direzioni future per l'avanzamento della tecnica OCE per facilitare le misurazioni elastiche dei biofilm ambientali.

Introduzione

Nel trattamento delle acque reflue e nel recupero delle risorse idriche, i biofilm benefici nei reattori di crescita collegati sono sempre più utilizzati per consentire ai microbi di convertire gli inquinanti indesiderati, come la materia organica, l'azoto e il fosfato, in forme stabilizzate che possono essere facilmente rimosse dall'acqua¹. In questi sistemi, la funzione emergente del biofilm, vale a dire le trasformazioni biochimiche, è strettamente associata alla diversità dei microbi che risiedono in esso e ai nutrienti che questi^{microbi ricevono}. Di conseguenza, la crescita continua del biofilm può rappresentare una sfida per il mantenimento di una funzionalità coerente del reattore perché la nuova crescita del biofilm può alterare i processi metabolici complessivi del biofilm, le caratteristiche di trasferimento di massa e la composizione della comunità. Stabilizzare il più possibile l'ambiente del biofilm può proteggere da tali cambiamenti³. Ciò include garantire un flusso costante di nutrienti e mantenere stabile la struttura del biofilm con uno spessore costante⁴. Il monitoraggio della rigidità e della struttura fisica del biofilm consentirebbe ai ricercatori di ottenere informazioni sulla salute generale e sul funzionamento del biofilm.

I biofilm presentano proprietà viscoelastiche ^5,6,7. Questa natura viscoelastica si traduce in una combinazione di una deformazione istantanea e lenta, dipendente dal tempo, in risposta a forze meccaniche esterne. Un aspetto unico dei biofilm è che, quando sono sottoposti a una deformazione sostanziale, rispondono come liquidi viscosi. Al contrario, se sottoposti a deformazioni minori, la loro risposta è paragonabile a quella dei solidi⁵. Inoltre, all'interno di questa regione di piccola deformazione, c'è un intervallo di deformazione sotto il quale i biofilm mostrano una relazione lineare forza-spostamento ^5,6,7. Le deformazioni all'interno di questo intervallo lineare sono ottimali per valutare le caratteristiche meccaniche del biofilm perché producono misure riproducibili. Diverse tecniche possono quantificare la risposta elastica all'interno di questo intervallo. L'elastografia a coerenza ottica (OCE) è una tecnica emergente che viene adattata per l'analisi di biofilm in questo intervallo lineare (ceppi dell'ordine di 10-4-10-5)^8,9.

L'applicazione più consolidata di OCE finora è in campo biomedico, dove la tecnica è stata applicata per caratterizzare tessuti biologici che richiedono solo un accesso ottico superficiale. Ad esempio, Li et al. hanno utilizzato l'OCE per caratterizzare le proprietà elastiche del tessuto cutaneo¹⁰. Altri autori hanno caratterizzato le proprietà elastiche anisotrope dei tessuti corneali suini e umani e come sono influenzati dalla pressione intraoculare 11,12,13,14,15,16. Alcuni vantaggi del metodo OCE per lo studio dei biofilm sono che non è distruttivo e fornisce una risoluzione spaziale a mesoscala, non richiede alcuna preparazione del campione e il metodo stesso è rapido; Fornisce misurazioni co-registrate della struttura fisica e delle proprietà elastiche (ad esempio, porosità, rugosità superficiale e morfologia)8,9,17,18.

Il metodo OCE misura lo spostamento locale delle onde elastiche che si propagano in un campione utilizzando la tomografia a coerenza ottica (OCT) sensibile alla fase. L'OCT è un interferometro ottico a bassa coerenza che trasforma i cambiamenti locali nello spostamento del campione in un cambiamento di intensità che viene registrato con uno spettrometro ottico. La tecnica OCT è stata utilizzata anche nella ricerca sul biofilm per la caratterizzazione della struttura a mesoscala, della distribuzione della porosità in tre dimensioni e della deformazione del biofilm 17,19,20,21. Inoltre, Picioreanu et al. hanno stimato le proprietà meccaniche del biofilm utilizzando la modellazione inversa dell'interazione fluido-struttura di immagini di deformazione della sezione trasversale OCT²².

D'altra parte, le misure OCE, accoppiate con la modellazione di onde elastodinamiche inverse, forniscono la velocità delle onde elastiche nel campione, che consente la caratterizzazione delle proprietà elastiche e viscoelastiche del campione. Il nostro gruppo ha adattato la tecnica OCE per la misurazione quantitativa delle proprietà elastiche e viscoelastiche del biofilm ^8,9,18 e ha convalidato la tecnica rispetto alle misurazioni della reometria a taglio in campioni di piastre di gel di agarosio¹⁸. L'approccio OCE fornisce stime precise e affidabili delle proprietà del biofilm poiché la velocità dell'onda elastica misurata è correlata alle proprietà elastiche del campione. Inoltre, il decadimento spaziale dell'ampiezza dell'onda elastica può essere direttamente correlato con le proprietà viscoelastiche dovute agli effetti viscosi nel materiale. Abbiamo riportato misure OCE delle proprietà viscoelastiche di biofilm batterici in coltura mista coltivati su coupon in un reattore anulare rotante (RAR) e biofilm granulari con geometrie complesse utilizzando modelli di onde elastodinamiche¹⁸.

La tecnica OCE è anche una potente alternativa alla reometria tradizionale¹⁸che viene utilizzata per la caratterizzazione viscoelastica. I metodi reometrici sono più adatti per i campioni con geometria planare. Pertanto, i biofilm granulari, che hanno forme e morfologie superficiali arbitrarie, non possono essere caratterizzati con precisione su un reometro ^8,23. Inoltre, a differenza dell'OCE, i metodi reometrici possono essere difficili da adattare per le misurazioni in tempo reale, ad esempio durante la crescita del biofilm nelle celle di flusso^24,25.

In questo articolo, mostriamo che le misure OCE della velocità d'onda indipendente dalla frequenza delle onde superficiali possono essere utilizzate per caratterizzare le proprietà elastiche del biofilm senza la necessità di modelli complicati. Questo sviluppo renderà l'approccio OCE più accessibile alla più ampia comunità del biofilm per lo studio delle proprietà meccaniche del biofilm.

La Figura 1 mostra un'illustrazione schematica del sistema OCT utilizzato in questo studio. Il sistema incorpora diversi strumenti, tra cui un sistema OCT commerciale sensibile alla fase nel dominio spettrale, un generatore di ritardo, un generatore di funzioni e un trasduttore piezoelettrico. Il sistema OCT funziona secondo il principio dell'interferometria impiegando una sorgente luminosa a banda larga con una lunghezza d'onda centrale di 930 nm. L'intensità luminosa raccolta, correlata agli intricati dettagli strutturali del campione, viene analizzata nell'unità di post-elaborazione e quindi convertita in un'immagine in sezione trasversale del campione, comunemente indicata come immagine OCT. La profondità di imaging OCT dipende dalla gravità dello scattering ottico nel campione che deriva dalla variazione locale dell'indice di rifrazione ed è limitata a 1-3 mm nei tessuti biologici e nei biofilm. Poiché la fase ottica nel campione e l'intensità dell'interferenza sono modulate dal movimento, l'OCT può essere utilizzato per rilevare lo spostamento locale del campione. Sfruttiamo la sensibilità allo spostamento dell'OCT nel metodo OCE per tracciare il campo di spostamento in stato stazionario delle onde elastiche nel campione. In particolare, il generatore di funzioni emette una tensione sinusoidale per pilotare il trasduttore piezoelettrico. Il trasduttore, a sua volta, si allunga e si contrae con una cronologia temporale oscillatoria. Lo spostamento oscillatorio del trasduttore impartisce una forza sinusoidale sulla superficie del campione attraverso una punta a cuneo stampata in 3D all'apice del trasduttore, portando alla generazione di onde elastiche armoniche nel campione. La punta a cuneo entra in leggero contatto con il campione, in modo che il campione rimanga intatto dopo che l'attuatore è stato ritirato dalla superficie del campione. Per registrare lo spostamento locale nel campione, vengono acquisite scansioni di profondità adiacenti separate da un ritardo temporale fisso in corrispondenza di ciascun pixel del campione. La differenza di fase ottica tra scansioni consecutive in ogni punto pixel è proporzionale allo spostamento verticale locale nello stesso punto. La sincronizzazione tra lo spostamento del trasduttore e l'ottica di scansione nel sistema OCT si ottiene attraverso un impulso di trigger che ha origine dal generatore di funzioni ed è ritardato nel generatore di ritardo. Questa fase di sincronizzazione facilita l'acquisizione di immagini coerenti della distribuzione di fase ottica locale nel campione. Queste immagini sono direttamente proporzionali allo spostamento armonico verticale locale nel campione e sono note come immagine OCE. Le immagini OCE vengono acquisite a diverse frequenze di attuazione del trasduttore per ottenere la lunghezza d'onda elastica e la velocità dell'onda in funzione della frequenza. Le velocità delle onde misurate vengono analizzate con un modello elastodinamico per determinare le proprietà elastiche del campione.

Protocollo

1. Configurazione del sistema

1. Riunisci i componenti del sistema che includono il sistema OCT commerciale (unità di base, supporto, testina di imaging e computer), generatore di forme d'onda, trasduttore, generatore di ritardi/impulsi, un interruttore con connessioni BNC, cavi e adattatori BNC, perni ottici e morsetti.
2. Collegare il segnale di sincronizzazione dal generatore di funzioni a un interruttore. Collegare l'altra porta dello switch al generatore di ritardo.
3. Collegare l'uscita del generatore di funzioni ai cavi del trasduttore.
4. Collegare le uscite del generatore di ritardo al canale di trigger sul retro dell'unità base OCT. Il segnale di uscita dal generatore di ritardo è un impulso di trigger per avviare il movimento dell'ottica di scansione nel sistema OCT.
5. Accendere i componenti del sistema (unità di base dello Strumento di personalizzazione di Office, computer, generatore di funzioni e generatore di ritardo) e avviare il software dello Strumento di personalizzazione di Office.
6. Configurare il generatore di ritardo per inviare un segnale di trigger logico transistor-transistor all'unità di base OCT. Fare riferimento al manuale del sistema OCT per i requisiti del segnale di trigger.
7. Posizionare il trasduttore sotto la lente OCT. Il trasduttore ha una punta a cuneo stampata in 3D incollata su una delle sue estremità che funge da sorgente di linea per le onde elastiche.

2. Acquisizione delle immagini

1. Sul software OCT, selezionare la modalità di acquisizione Doppler e abilitare il trigger esterno.
2. Posizionare il biofilm granulare sotto la lente in un portacampioni e spostarlo verso la punta del trasduttore utilizzando uno stadio di traslazione. Assicurarsi che il trasduttore entri in contatto delicato con la superficie del campione, come mostrato nella Figura 2. Abbiamo utilizzato due biofilm granulari (noti anche come fanghi granulari) con diametri nominali diversi (4,3 mm e 3,3 mm). Questa selezione è stata fatta per studiare l'impatto delle dimensioni del biofilm sulle sue proprietà meccaniche. Questi sono stati ottenuti commercialmente.
   NOTA: Il portacampioni impiegato in questo studio è costituito da una piastra di plastica stampata in 3D con rientranze emisferiche multiple. Questo supporto non consente misurazioni in condizioni native. Pertanto, abbiamo introdotto acqua dall'ambiente naturale durante le misurazioni per evitare che il campione si asciugasse.
3. Specificare l'area di scansione facendo clic su Inizio e Fine della linea di interesse (percorso di propagazione dell'onda) nella finestra del monitor di esempio. Centrare questa linea rispetto alla punta del trasduttore e assicurarsi che sia perpendicolare al bordo della punta.
4. Specificare il numero di pixel lungo l'area di scansione e la profondità del campione e aumentare il numero di B-scan (immagini in sezione trasversale 2D) da registrare per migliorare il rapporto segnale/rumore delle immagini OCE. I risultati presentati sono stati ottenuti utilizzando 1523 pixel lungo il percorso di scansione e 1024 pixel lungo la profondità. Sono stati effettuati un totale di 50 B-scan.
5. Fare clic sul pulsante Scansione e attivare l'interruttore. Le immagini OCT e OCE dovrebbero apparire sullo schermo. Attivare l'interruttore entro il tempo di timeout di attivazione e il tempo di preparazione della scansione.
6. Assicurarsi che l'intensità di riferimento rientri nell'intervallo ottimale e posizionare il campione all'interno della regione focale dell'obiettivo del microscopio OCT. Un campione correttamente messo a fuoco dovrebbe avere il bordo superiore vicino alla parte superiore dell'immagine.
7. Regolare il contorno di fase nell'immagine OCE sulla barra degli strumenti di visualizzazione aumentando il valore più alto della barra dei colori sul lato sinistro e diminuendo il valore più basso della barra dei colori sul lato destro. Ciò aumenterà il contrasto delle frange.
8. Configurare il generatore di funzioni per produrre una tensione sinusoidale a frequenza singola premendo il pulsante Sinusoidale nel pannello frontale e specificare la frequenza di eccitazione iniziale per le misurazioni. Le misurazioni in questo studio iniziano a 4 kHz e terminano a 9,6 kHz. Abilitare il connettore di uscita premendo il tasto Uscita.
9. Impostare una tensione accettabile per la misurazione. Questo valore dovrebbe massimizzare la visibilità delle frange, ma anche evitare l'avvolgimento di fase. Per i biofilm in questo studio e l'intervallo di frequenza delle misurazioni, una tensione compresa tra 5 e 10 V si traduce in genere in una mappa di fase con un buon contrasto.
10. Acquisire le immagini OCT e OCE facendo clic sul pulsante Registra .
11. Ripetere le misurazioni a frequenze diverse per ottenere immagini in sezione trasversale del campo d'onda elastico con diverse lunghezze d'onda (o periodi di frangia).

3. Analisi dell'immagine

1. Ottenere la dimensione fisica dei pixel. La dimensione fisica dei pixel in x si ottiene dividendo il campo visivo nella direzione x per la dimensione dell'immagine nella direzione x e quindi moltiplicando per un fattore due. La dimensione fisica dei pixel in z si ottiene dividendo il campo visivo in direzione z per la dimensione dell'immagine in direzione z. I valori del campo visivo e della dimensione dell'immagine sono memorizzati nell'array della struttura con le informazioni sull'immagine a cui è possibile accedere con la funzione OCTFileOpen fornita nell'SDK MATLAB nel pacchetto ThorImageOCT.
2. Ottenere le matrici OCT e OCE usando rispettivamente le funzioni OCTFileGetIntensity e OCTFileGetPhase e fare la media dei fotogrammi registrati. Queste funzioni sono fornite nell'SDK MATLAB nel pacchetto ThorImageOCT.
3. Ottenere le posizioni dei pixel del bordo superiore del campione binarizzando l'immagine e rilevando i pixel bianchi dall'alto verso il basso per ogni colonna.
4. Estrarre la distribuzione di fase dell'immagine OCE lungo questo bordo utilizzando la funzione improfile e calcolare la lunghezza cumulativa dell'arco in dimensioni reali. Calcola la lunghezza dell'arco prendendo la somma cumulativa della norma delle differenze in scala tra punti consecutivi nelle direzioni x e z.
5. Calcolare la trasformata di Fourier veloce spaziale della distribuzione di fase OCT misurata (cioè dalle immagini OCE) rispetto alla lunghezza cumulativa dell'arco utilizzando la funzione plomb.
6. Determinare la posizione del picco nello spettro. Questa posizione rappresenta la frequenza spaziale dell'onda. Calcolare la velocità dell'onda (o velocità di fase) dal rapporto tra la frequenza di eccitazione del trasduttore (unità di Hz) e la frequenza spaziale (unità di lunghezza inversa).

Risultati

In questo studio, abbiamo utilizzato biofilm granulari (noti anche come fanghi granulari), che sono stati ottenuti commercialmente. I granuli sono biofilm sferici che si formano attraverso l'autoaggregazione, il che significa che non richiedono un supporto o una superficie su cui crescere²⁶. La Figura 3A mostra un'immagine OCT rappresentativa in sezione trasversale che si verifica a causa della variazione spaziale dell'indice di rifrazione locale in ...

Discussione

La profondità di imaging raggiungibile nel sistema OCT è determinata dal grado di penetrazione della luce dalla sorgente luminosa, che dipende dalla lunghezza d'onda della sorgente. Inoltre, la lunghezza d'onda determina la risoluzione assiale. Le lunghezze d'onda più lunghe possono penetrare più in profondità nel campione, ma a scapito di una risoluzione assiale ridotta rispetto alle lunghezze d'onda più corte. La risoluzione trasversale, d'altra parte, dipende sia dall'apertura numerica del sistema che dalla lung...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printed sample holder
3D printed wedge tip			3 mm width
BNC cables	Any brand
Delay generator	Stanford Research Systems	DG535	DG535 Digital delay/ Pulse Generator
Function generator	Agilent Technologies		33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator
Granular biofilm	Aqua-Aerobic Systems		Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB	MathWorks		Release 2022a (MATLAB 9.12)
Piezoelectric transducer	Thorlabs	PK2JUP1	Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement
SD-OCT System	Thorlabs		Ganymede II, LSM03 scan lens
ThorImageOCT	Thorlabs		Version: 5.5.5