Quantificação das Propriedades Elásticas de Biofilmes Ambientais utilizando Elastografia de Coerência Óptica

Resumo

Este trabalho destaca a eficácia da técnica de elastografia de coerência óptica (OCE) na caracterização rápida e não destrutiva das propriedades elásticas do biofilme. Nós elucidamos procedimentos críticos de implementação de OCE para medições precisas e apresentamos os valores do módulo de Young para dois biofilmes granulares.

Resumo

Biofilmes são biomateriais complexos que compreendem uma rede bem organizada de células microbianas envoltas em substâncias poliméricas extracelulares (EPS) autoproduzidas. Este trabalho apresenta um relato detalhado da implementação de medidas de elastografia de coerência óptica (ECO) adaptadas para a caracterização elástica de biofilmes. OCE é uma técnica óptica não destrutiva que permite o mapeamento local da microestrutura, morfologia e propriedades viscoelásticas de materiais moles parcialmente transparentes com alta resolução espacial e temporal. Nós fornecemos um guia abrangente detalhando os procedimentos essenciais para a implementação correta desta técnica, juntamente com uma metodologia para estimar o módulo de elasticidade de biofilmes granulares a partir das medidas coletadas. Estes consistem na configuração do sistema, aquisição de dados e pós-processamento. Na discussão, nos aprofundamos na física subjacente dos sensores usados na OCE e exploramos as limitações fundamentais em relação às escalas espaciais e temporais das medições da OCE. Concluímos com possíveis direções futuras para o avanço da técnica OCE para facilitar as medidas elásticas de biofilmes ambientais.

Introdução

No tratamento de águas residuais e na recuperação de recursos hídricos, biofilmes benéficos em reatores de crescimento acoplados são cada vez mais empregados para permitir que micróbios convertam poluentes indesejáveis, como matéria orgânica, nitrogênio e fosfato, em formas estabilizadas que podem ser facilmente removidas da água¹. Nesses sistemas, a função emergente do biofilme, ou seja, as transformações bioquímicas, está intimamente associada à diversidade de micróbios que nele residem e aos nutrientes que esses micróbios recebem². Assim, o crescimento contínuo do biofilme pode representar um desafio para manter a funcionalidade consistente do reator, pois o crescimento do novo biofilme pode alterar os processos metabólicos gerais do biofilme, as características de transferência de massa e a composição da comunidade. Estabilizar ao máximo o ambiente do biofilme pode proteger contra tais alterações³. Isso inclui garantir um fluxo consistente de nutrientes e manter a estrutura do biofilme estável com uma espessura constante⁴. O monitoramento da rigidez e da estrutura física do biofilme permitiria que os pesquisadores obtivessem informações sobre a saúde geral e o funcionamento do biofilme.

Os biofilmes apresentam propriedades viscoelásticas ^5,6,7. Essa natureza viscoelástica resulta em uma combinação de uma deformação instantânea e lenta, dependente do tempo, em resposta a forças mecânicas externas. Um aspecto único dos biofilmes é que, quando submetidos a deformações substanciais, respondem como líquidos viscosos. Por outro lado, quando submetidos a pequenas deformações, sua resposta é comparável aos sólidos⁵. Além disso, dentro dessa pequena região de deformação, existe uma faixa de deformação sob a qual os biofilmes exibem uma relação linear força-deslocamento ^5,6,7. Deformações dentro dessa faixa linear são ótimas para avaliar as características mecânicas do biofilme, pois produzem medidas reprodutíveis. Várias técnicas podem quantificar a resposta elástica dentro dessa faixa. A elastografia de coerência óptica (ECO) é uma técnica emergente que está sendo adaptada para a análise de biofilmes nessa faixa linear (deformações da ordem de 10-4-10-5)^8,9.

A aplicação mais estabelecida da OCE até agora é na área biomédica, onde a técnica tem sido aplicada para caracterizar tecidos biológicos que requerem apenas acesso óptico superficial. Por exemplo, Li e col. utilizaram a OCE para caracterizar as propriedades elásticas do tecido cutâneo¹⁰. Outros autores caracterizaram as propriedades elásticas anisotrópicas dos tecidos corneanos suínos e humanos e como eles são afetados pela pressão intraocular 11,12,13,14,15,16. Algumas vantagens do método OCE para o estudo de biofilmes são que ele não é destrutivo e fornece resolução espacial de mesoescala, não requer nenhum preparo de amostra e o método em si é rápido; Ele fornece medidas co-registradas da estrutura física e propriedades elásticas (por exemplo, porosidade, rugosidade superficial e morfologia)8,9,17,18.

O método OCE mede o deslocamento local de propagação de ondas elásticas em um espécime usando tomografia de coerência óptica (OCT) sensível à fase. OCT é um interferômetro óptico de baixa coerência que transforma mudanças locais no deslocamento da amostra em uma mudança de intensidade que é registrada com um espectrômetro óptico. A técnica de OCT também tem sido utilizada em pesquisas de biofilmes para caracterização da estrutura de mesoescala, distribuição de porosidade em três dimensões e deformação do biofilme17,19,20,21. Além disso, Picioreanu e col. estimaram propriedades mecânicas do biofilme usando a modelagem inversa da interação fluido-estrutura de imagens de deformação transversal da OCT²².

Por outro lado, as medidas de OCE, juntamente com a modelagem de onda elastodinâmica inversa, fornecem a velocidade de onda das ondas elásticas na amostra, o que permite a caracterização das propriedades elásticas e viscoelásticas da amostra. Nosso grupo adaptou a técnica OCE para mensuração quantitativa das propriedades elásticas e viscoelásticas do biofilme ^8,9,18 e validou a técnica contra medidas de reometria de cisalhamento em amostras de placa gel de agarose¹⁸. A abordagem OCE fornece estimativas precisas e confiáveis das propriedades do biofilme, uma vez que a velocidade de onda elástica medida está correlacionada com as propriedades elásticas da amostra. Além disso, o decaimento espacial da amplitude da onda elástica pode ser diretamente correlacionado com as propriedades viscoelásticas devido aos efeitos viscosos no material. Nós relatamos medidas OCE de propriedades viscoelásticas de biofilmes bacterianos de cultura mista cultivados em um reator anular rotativo (RAR) e biofilmes granulares com geometrias complexas usando modelos de ondas elastodinâmicas¹⁸.

A técnica OCE também é uma alternativa poderosa à reometria^{tradicional18}, que é utilizada para caracterização viscoelástica. Os métodos de reometria são mais adequados para amostras com geometria plana. Dessa forma, biofilmes granulares, que apresentam formas e morfologias superficiais arbitrárias, não podem ser caracterizados com precisão em um reômetro ^8,23. Além disso, ao contrário da OCE, os métodos de reometria podem ser difíceis de adaptar para medidas em tempo real, por exemplo, durante o crescimento de biofilme em células de fluxo^24,25.

Neste artigo, mostramos que as medidas OCE da velocidade de onda independente da frequência das ondas de superfície podem ser usadas para caracterizar as propriedades elásticas do biofilme sem a necessidade de modelos complicados. Este desenvolvimento tornará a abordagem OCE mais acessível à comunidade mais ampla de biofilmes para o estudo das propriedades mecânicas do biofilme.

A Figura 1 mostra uma ilustração esquemática do sistema de OCT utilizado neste estudo. O sistema incorpora vários instrumentos, incluindo um sistema OCT comercial sensível à fase no domínio espectral, um gerador de atraso, um gerador de função e um transdutor piezoelétrico. O sistema OCT opera com o princípio da interferometria empregando uma fonte de luz de banda larga com um comprimento de onda central de 930 nm. A intensidade luminosa coletada, que está correlacionada com detalhes estruturais intrincados na amostra, é analisada na unidade de pós-processamento e, em seguida, convertida em uma imagem transversal da amostra - comumente referida como uma imagem de OCT. A profundidade da OCT depende da gravidade do espalhamento óptico na amostra, que decorre da variação local no índice de refração e é limitada a 1-3 mm em tecidos biológicos e biofilmes. Como a fase óptica na amostra e a intensidade da interferência são moduladas pelo movimento, a OCT pode ser usada para detectar o deslocamento local da amostra. Aproveitamos a sensibilidade de deslocamento da OCT no método OCE para rastrear o campo de deslocamento em estado estacionário das ondas elásticas na amostra. Especificamente, o gerador de função emite uma tensão senoidal para acionar o transdutor piezoelétrico. O transdutor, por sua vez, se alonga e contrai com um histórico de tempo oscilante. O deslocamento oscilatório do transdutor confere uma força senoidal na superfície da amostra através de uma ponta de cunha impressa em 3D no ápice do transdutor, levando à geração de ondas elásticas harmônicas na amostra. A ponta da cunha faz contato leve com a amostra, de modo que a amostra permanece intacta depois que o atuador é retraído da superfície da amostra. Para registrar o deslocamento local na amostra, varreduras de profundidade adjacentes separadas por um atraso de tempo fixo são adquiridas em cada pixel da amostra. A diferença de fase óptica entre varreduras consecutivas em cada ponto de pixel é proporcional ao deslocamento vertical local no mesmo ponto. A sincronização entre o deslocamento do transdutor e a óptica de varredura no sistema OCT é obtida através de um pulso de disparo que se origina do gerador de função e é retardado no gerador de atraso. Esta etapa de sincronização facilita a aquisição de imagens transversais consistentes da distribuição de fase óptica local na amostra. Essas imagens são diretamente proporcionais ao deslocamento harmônico vertical local na amostra e são conhecidas como imagem OCE. As imagens OCE são adquiridas em diferentes frequências de atuação do transdutor para obter o comprimento de onda elástico e a velocidade de onda em função da frequência. As velocidades de onda medidas são analisadas com um modelo elastodinâmico para determinar as propriedades elásticas da amostra.

Protocolo

1. Configuração do sistema

1. Reúna os componentes do sistema que incluem o sistema OCT comercial (unidade base, suporte, cabeça de imagem e computador), gerador de forma de onda, transdutor, gerador de atraso/pulso, um interruptor com conexões BNC, cabos e adaptadores BNC, postes ópticos e grampos.
2. Conecte o sinal de sincronização do gerador de funções a um switch. Conecte a outra porta do switch ao gerador de atraso.
3. Conecte a saída do gerador de funções aos cabos do transdutor.
4. Conecte as saídas do gerador de atraso ao canal de disparo na parte traseira da unidade base da OCT. O sinal de saída do gerador de atraso é um pulso de disparo para iniciar o movimento da óptica de varredura no sistema OCT.
5. Ligue os componentes do sistema (unidade base da OCT, computador, gerador de funções e gerador de atrasos) e inicie o software da OCT.
6. Configure o gerador de atraso para enviar um sinal de disparo lógico transistor-transistor para a unidade base da OCT. Consulte o manual do sistema OCT para obter os requisitos do sinal de gatilho.
7. Posicione o transdutor sob a lente da OCT. O transdutor tem uma ponta de cunha impressa em 3D colada em uma de suas extremidades que serve como fonte de linha para ondas elásticas.

2. Aquisição de imagens

1. No software da OCT, selecione o Modo de Aquisição do Doppler e ative o gatilho externo.
2. Coloque o biofilme granular sob a lente em um porta-amostras e mova-o em direção à ponta do transdutor usando um estágio de translação. Certifique-se de que o transdutor faça contato suave com a superfície da amostra, como mostrado na Figura 2. Foram utilizados dois biofilmes granulares (também conhecidos como lodo granular) com diferentes diâmetros nominais (4,3 mm e 3,3 mm). Esta seleção foi feita para investigar o impacto do tamanho do biofilme em suas propriedades mecânicas. Estes foram obtidos comercialmente.
   NOTA: O porta-amostra empregado neste estudo consiste em uma placa plástica impressa em 3D com múltiplas indentações hemisféricas. Este suporte não permite medições em condições nativas. Portanto, introduzimos água do ambiente natural durante as medições para evitar que a amostra secasse.
3. Especifique a região de varredura clicando em Pontos Iniciais e Finais da Linha de Interesse (caminho de propagação de onda) na janela do monitor de exemplo. Centralize essa linha em relação à ponta do transdutor e certifique-se de que ela esteja perpendicular à borda da ponta.
4. Especifique o número de pixels ao longo da região de varredura e a profundidade da amostra e aumente o número de varreduras B (imagens transversais 2D) a serem gravadas para melhorar a relação sinal-ruído das imagens OCE. Os resultados apresentados foram obtidos usando 1523 pixels ao longo do caminho de varredura e 1024 pixels ao longo da profundidade. Um total de 50 varreduras B foram realizadas.
5. Clique no botão Digitalizar e ligue o interruptor. As imagens OCT e OCE devem aparecer na tela. Ative o interruptor dentro do tempo limite do gatilho e do tempo de preparação da varredura.
6. Certifique-se de que a intensidade de referência esteja dentro da faixa ideal e posicione a amostra dentro da região focal da objetiva do microscópio da OCT. Uma amostra devidamente focada deve ter sua borda superior próxima à parte superior da imagem.
7. Ajuste o contorno de fase na imagem OCE na barra de ferramentas de exibição aumentando o valor mais alto da barra de cores do lado esquerdo e diminuindo o valor mais baixo da barra de cores do lado direito. Isso aumentará o contraste de franjas.
8. Configure o gerador de função para produzir uma tensão senoidal de frequência única pressionando o botão Sine no painel frontal e especifique a frequência de excitação inicial para as medições. As medidas deste estudo iniciam-se em 4 kHz e terminam em 9,6 kHz. Ative o conector de saída pressionando a tecla de saída.
9. Defina uma tensão aceitável para a medição. Esse valor deve maximizar a visibilidade da franja, mas também evitar o envolvimento de fases. Para os biofilmes deste estudo e a faixa de frequência das medições, uma tensão entre 5 e 10 V tipicamente resulta em um mapa de fases com bom contraste.
10. Adquira as imagens da OCT e da OCE clicando no botão Gravar .
11. Repita as medidas em diferentes frequências para obter imagens transversais do campo de onda elástica com diferentes comprimentos de onda (ou períodos de franja).

3. Análise de Imagens

1. Obtenha o tamanho físico dos pixels. O tamanho do pixel físico em x é obtido dividindo o campo de visão na direção x pelo tamanho da imagem na direção x e, em seguida, multiplicando por um fator de dois. O tamanho do pixel físico em z é obtido dividindo-se o campo de visão na direção z pelo tamanho da imagem na direção z. Os valores de campo de visão e tamanho da imagem são armazenados na matriz de estrutura com as informações da imagem que podem ser acessadas com a função OCTFileOpen fornecida no SDK do MATLAB no pacote ThorImageOCTA.
2. Obtenha as matrizes OCT e OCE usando as funções OCTFileGetIntensity e OCTFileGetPhase, respectivamente, e faça a média dos quadros registrados. Essas funções são fornecidas no SDK do MATLAB no pacote ThorImageOCTA.
3. Obtenha os locais de pixels da borda superior da amostra binarizando a imagem e detectando os pixels brancos de cima para baixo para cada coluna.
4. Extraia a distribuição de fase da imagem OCE ao longo dessa borda usando a função improfile e calcule o comprimento de arco cumulativo em dimensões reais. Calcule o comprimento do arco tomando a soma cumulativa da norma de diferenças escalonadas entre pontos consecutivos nas direções x e z.
5. Calcule a transformada de Fourier rápida espacial da distribuição de fase medida da OCT (ou seja, a partir das imagens OCE) em relação ao comprimento de arco cumulativo usando a função plomb.
6. Determine a localização do pico no espectro. Essa localização representa a frequência espacial da onda. Calcular a velocidade de onda (ou velocidade de fase) a partir da razão entre a frequência de excitação do transdutor (unidades de Hz) e a frequência espacial (unidade de comprimento inverso).

Resultados

Neste estudo, foram utilizados biofilmes granulares (também conhecidos como lodo granular), os quais foram obtidos comercialmente. Os grânulos são biofilmes esféricos que se formam por autoagregação, ou seja, não necessitam de um carreador ou superfície para crescer²⁶. A Figura 3A mostra uma imagem representativa da OCT transversal que surge devido à variação espacial do índice de refração local em um biofilme granular. O biofilme tem u...

Discussão

A profundidade de imagem atingível no sistema OCT é determinada pelo grau de penetração de luz da fonte de luz, que depende do comprimento de onda da fonte. Além disso, o comprimento de onda determina a resolução axial. Comprimentos de onda mais longos podem penetrar mais profundamente na amostra, mas às custas de resolução axial reduzida em comparação com comprimentos de onda mais curtos. A resolução transversal, por outro lado, é dependente tanto da abertura numérica do sistema quanto do comprimento de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printed sample holder
3D printed wedge tip			3 mm width
BNC cables	Any brand
Delay generator	Stanford Research Systems	DG535	DG535 Digital delay/ Pulse Generator
Function generator	Agilent Technologies		33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator
Granular biofilm	Aqua-Aerobic Systems		Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB	MathWorks		Release 2022a (MATLAB 9.12)
Piezoelectric transducer	Thorlabs	PK2JUP1	Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement
SD-OCT System	Thorlabs		Ganymede II, LSM03 scan lens
ThorImageOCT	Thorlabs		Version: 5.5.5