Un nuevo flujo de trabajo para el muestreo y la digitalización de núcleos de incremento

Resumen

Presentamos un protocolo para utilizar monturas impresas en 3D para fijar núcleos de incremento en el campo sin necesidad de desempaquetarlos y pegarlos en monturas de madera. El nuevo soporte GSC permite colocar los núcleos en un micrótomo central para cortar su superficie y transferirlos directamente a la captura de imagen digital.

Resumen

Aquí presentamos un nuevo flujo de trabajo que va desde la toma de núcleos de incremento en el campo, almacenándolos y transportándolos al laboratorio, hasta la digitalización de sus anillos de árboles para análisis posteriores para análisis dendroecológicos posteriores. El procedimiento implica el uso de nuevos portadores de muestras para núcleos de incremento. Estos nuevos soportes Gärtner Schneider Core (GSC) se diseñan utilizando software de modelado tridimensional (3D) y finalmente se imprimen con una impresora 3D. Utilizando estos soportes desde el principio en el campo, los núcleos se pueden cortar directamente con un micrótomo central, y su superficie se puede digitalizar sin más reorganización utilizando un nuevo sistema de captura de imágenes de alta resolución. Por lo tanto, están disponibles para el análisis directo. Este sistema permite digitalizar anillos de árboles a partir de núcleos y discos, y también tomar imágenes de micro secciones largas (hasta 40 cm) utilizando luz transmitida. Esta característica es de especial interés para aplicaciones dendroecológicas y geomórficas para identificar el inicio de cualquier perturbación en microsecciones cortadas con un micrótomo central.

Introducción

El principio de la datación de los anillos de los árboles mediante la aplicación de la técnica de datación cruzada fue introducido por primera vez por el científico forestal austriaco Arthur Freiherr von Seckendorff-Gudent en 1881¹. En la primera mitad^{del siglo XX} , esta técnica fue reinventada por el "Padre de la Dendrocronología" Andrew Ellicott Douglass, quien la aplicó intensivamente en la datación de sitios arqueológicos y árboles vivos².

Hoy en día, la dendroecología, el tema de investigación que actúa como una especie de marco ambiental de la dendrocronología, se define como el estudio de los anillos de los árboles y sus variaciones de crecimiento inherentes causadas por cambios ecológicos y ambientales en el tiempo³. En la investigación dendroecológica, se utilizan muchas otras características además de las variaciones del ancho del anillo, como los isótopos estables, la densidad tardía de la madera o las características de las células dentro de anillos individuales, para correlacionar estos datos con los parámetros ambientales y comprender mejor el impacto de las condiciones ambientales en el crecimiento de los árboles a lo largo del tiempo⁴. A través de la integración continua de los estudios anatómicos de la madera a la investigación dendroecológica, la investigación en dendroecología evolucionó en la última década y es más que nunca una columna vertebral en la reconstrucción de las condiciones climáticas pasadas 5,6,7,8.

A pesar de que el desarrollo técnico en cuanto a la preparación y análisis de muestras, especialmente en anatomía de la madera, fue fuerte en la última década 9,10,11,12,13,14, casi no hubo avances reales en cuanto a la simplificación de las técnicas de muestreo ¹⁵. A pesar de, por ejemplo, la tecnología de ondas acústicas¹⁶, hasta el día de hoy no existe un método "no destructivo" fiable para extraer las características de los anillos de los árboles.

En consecuencia, todos los estudios relacionados con los anillos de los árboles siguen basándose en muestras de madera tomadas de árboles o arbustos tomados en los sitios de interés. Cuando se enfoca en los árboles, el procedimiento estándar es tomar núcleos de incremento de los tallos¹⁵.

La toma de núcleos mediante el uso de núcleos incrementales se expresa con frecuencia como una técnica "no destructiva"¹⁷. En comparación con tomar discos de los tallos, esto es correcto; Sin embargo, esta técnica de muestreo provoca un agujero en el tallo de aproximadamente 1 cm de diámetro, que en su mayoría llega más allá de la médula del tallo³. El árbol es capaz de cerrar esta herida por sí solo, pero este proceso provoca reacciones de crecimiento, alterando la estructura común en las proximidades de la herida, así como una decoloración más o menos intensa de la madera existente alrededor del agujero debido a enfermedades fúngicas ^18,19. Por lo tanto, debería llamarse mejor "mínimamente invasivo" en lugar de "no destructivo".

La técnica de tomar núcleos de incremento evolucionó recientemente a través de la capacidad de utilizar taladros mecánicos, lo que resultó en muestras de mayor calidad, especialmente para análisis anatómicos de madera¹⁵. Este procedimiento también ahorra mucho tiempo en el campo en comparación con la extracción manual de núcleos. Lo que no cambió fue el procedimiento de manipulación de los núcleos, desde la extracción del árbol hasta el etiquetado, el almacenamiento para el transporte y la preparación en el laboratorio para diversas técnicas de análisis posibles.

Los núcleos aún deben empacarse en contenedores estables, como pajitas hechas de plástico o papel, para evitar que se rompan durante el transporte. El etiquetado de los corazones se realiza directamente en el núcleo con lápices suaves o (más frecuentemente) en el exterior de cada pajita. Cuando se utilizan recipientes de plástico, los corazones deben sacarse después de un corto tiempo para evitar la propagación de hongos. Por lo tanto, los núcleos deben volver a sacarse de los contenedores. Para estabilizar los núcleos y evitar que se doblen cuando comiencen a secarse, los núcleos deben fijarse en un soporte. Esto también ayuda con la posterior preparación de la superficie para análisis posteriores. Al hacerlo, las etiquetas también deben transferirse a los soportes respectivos. Un procedimiento estándar es pegar los núcleos en soportes de madera o fijarlos con cinta adhesiva en los surcos de los tableros corrugados. Pegarlos en soportes de madera es la técnica más utilizada. Aunque este procedimiento es perfecto para estabilizar y lijar o cortar los núcleos, tiene varias desventajas con respecto a los posibles análisis químicos, isotópicos e incluso anatómicos de la madera. Otra desventaja, a pesar del tiempo requerido, es la transferencia propensa a errores de las etiquetas de cada núcleo a los nuevos soportes.

En dendrocronología, las mediciones del ancho de los anillos como base para una datación precisa son la columna vertebral de todos los estudios dendroecológicos²⁰. Aunque muchos laboratorios todavía confían en las mediciones manuales utilizando tablas de medición, por ejemplo, Lintab²¹ con binoculares adjuntos, existe una tendencia a usar escáneres planos para digitalizar las superficies del núcleo y medir el ancho del anillo utilizando software como CooRecorder²² o WinDENDRO²³. Desafortunadamente, estos escáneres, por ejemplo, el ampliamente utilizado Epson Expression 10000XL, no tienen suficiente resolución para representar claramente las estructuras como traqueidas de madera temprana o tardía (Figura 1). Por esta razón, las imágenes resultantes no son adecuadas para reconocer estructuras difíciles como anillos muy estrechos o fluctuaciones de densidad, que son críticas para un procedimiento de datación cruzada preciso sin volver a los núcleos originales con binoculares^24,25.

Dado que la alta resolución de la imagen es un requisito previo indispensable para un análisis adecuado de las imágenes en la ciencia de los anillos de los árboles¹⁰, se desarrolló un nuevo sistema de captura de imágenes en WSL (Skippy; https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/) para digitalizar los anillos de los árboles en las superficies del núcleo utilizando una cámara digital, lo que da como resultado imágenes que presentan una resolución más alta que todos los escáneres planos existentes. Este sistema se basó en la idea del sistema ATRICS²⁶, desarrollado en 2007. Más recientemente, se presentó un sistema de captura de imágenes simple pero eficiente comparable al Skippy como un kit de autoensamblaje²⁷.

La digitalización de los anillos de los árboles, es decir, la captura de imágenes con luz reflejada, es un paso importante en la creación de imágenes de alta resolución de núcleos o discos de incremento para respaldar una medición de ancho de anillo digital y eficiente en el tiempo. El sistema desarrollado en WSL también permite tomar imágenes de micro secciones largas (hasta 40 cm) utilizando luz transmitida. Esta característica adicional es, por ejemplo, de interés para las aplicaciones dendrogeomórficas para identificar el inicio de la madera de reacción en micro secciones.

En el estudio, presentamos un protocolo para facilitar el proceso de manejo de núcleos en el campo y en el laboratorio. La base de la nueva técnica presentada es una montura reutilizable; el nuevo soporte GSC GärtnerSchneiderCore (GSC) diseñado con software de modelado 3D e impreso con una impresora 3D. El soporte GSC permite un manejo sencillo de los núcleos tomados en el campo sin tener que volver a empaquetarlos o etiquetarlos. También presentamos un nuevo y eficiente sistema para digitalizar las superficies preparadas de los núcleos. Este protocolo abarca todo el procedimiento, desde la toma de núcleos en el campo hasta la preparación de la muestra, la digitalización de las superficies de los núcleos para los análisis posteriores y, finalmente, su almacenamiento en un archivo.

Protocolo

1. Creación del titular del GSC

1. Abra el modelo 3D del soporte en un programa de corte que sea compatible con una impresora 3D. Cree un archivo de impresión que pueda ser leído por la impresora 3D (en este caso, un archivo "*.gcode").
   NOTA: El modelo 3D se puede diseñar utilizando cualquier software de modelado 3D.
2. Transfiera el archivo de impresión a la impresora 3D mediante una tarjeta de memoria o una memoria USB y active el archivo de impresión en la impresora 3D.
3. Tan pronto como se imprima el soporte, espere hasta que el soporte se enfríe a temperatura ambiente (RT). A continuación, retira la placa a la que se adhiere el soporte de la impresora y dobla un poco la placa hasta que la forma se separe de la superficie.
4. Retire todo el exceso de roscas o accesorios del soporte.
   NOTA: El número de soportes que se imprimirán a la vez depende del tamaño de la impresora. En una impresora 3D con una dimensión de placa de 36 cm x 36 cm, se pueden imprimir alrededor de 30 soportes con una longitud de 35 cm en una sola tirada. El tiempo necesario para imprimir 30 soportes depende del dispositivo. En promedio, esto debe hacerse en aproximadamente 8 horas (impresión nocturna).

2. Extracción, estabilización y transporte de núcleos de incremento en el campo

1. Tome un taladro inalámbrico equipado con un refuerzo de par y un desentrañador de incremento, seleccione la posición de extracción de muestras y coloque el descorazonador perpendicular al eje de crecimiento del tallo.
   NOTA: Lo mismo se puede hacer manualmente usando el descorazonador de incrementos sin un taladro inalámbrico.
2. Comience a descorazonar hasta que el descorazonador alcance al menos la mitad del diámetro del tallo. Verifique la profundidad como se explicó anteriormente sosteniendo el extractor (que tiene la misma longitud que el descorazonador) al lado del descorazonador.
3. En el caso de utilizar un taladro inalámbrico, retire el taladro, coloque el mango en el descorazonador (que ya es el caso cuando se utiliza el descorazonador de incremento manualmente), tome el extractor con el lado abierto hacia arriba e insértelo completamente en el descorazonador.
4. Gire el descoronador de incrementos hacia atrás (una vuelta completa) para separar el núcleo del tallo. Saque el extractor, incluido el núcleo.
5. Retire el núcleo del extractor. Verifique la dirección de la fibra del núcleo para garantizar una orientación vertical de las fibras al colocar el núcleo en el soporte.
   NOTA: La dirección de la fibra se puede verificar en ambos extremos del núcleo, así como en el costado del núcleo. Para esto, sostenga el núcleo contra la luz y gírelo hasta que se vea un lado brillante. Esto sucede porque, en este lado, las paredes radiales de las células están cortadas longitudinalmente y reflejan la luz de manera diferente al resto del núcleo.
6. Coloque el núcleo en la parte superior del soporte con la dirección de la fibra en posición vertical. Presione la parte superior del núcleo con todos los dedos hasta que el núcleo se deslice en el soporte.
7. Etiquete el núcleo en el costado del soporte con un lápiz suave, lo que permite escribir incluso en vidrio.
   NOTA: La escritura se puede quitar posteriormente con una goma común.
8. Coloque el soporte con el núcleo en la caja de transporte y cierre la tapa.

3. Preparación de los núcleos montados en el laboratorio

1. OPCIONAL: Incrustación de los núcleos montados en parafina para un posible micro seccionamiento.
   1. Coloque una caja de acero con una tapa provista de una válvula para la conexión de una bomba de vacío en una placa calefactora, llénela hasta aproximadamente 2 cm con parafina y espere hasta que se haya derretido por completo.
   2. Saque los núcleos montados de la caja de transporte. Coloque los soportes con los núcleos tal como están en la parafina líquida y cierre la tapa.
   3. Ponga en marcha la bomba de vacío, aplique un vacío constante y ligero al recipiente y espere unas 2 h. Debido a la estructura abierta del soporte, la parafina puede penetrar en los núcleos sin barreras adicionales.
   4. Detenga la bomba de vacío y abra la tapa. Saque los soportes con los núcleos, colóquelos en una rejilla y deje que se enfríen.
   5. Si es necesario, retire el exceso de parafina de los lados del soporte.
2. Preparación de las superficies principales
   1. Saque los núcleos montados de la caja de transporte o del baño de parafina. Coloque el soporte con el núcleo tal como está en el portamuestras de un micrótomo de núcleo. Asegúrese de orientar el núcleo de manera que la madera tardía de los anillos mire hacia la hoja.
   2. Apriete los tornillos del portamuestras hasta que el soporte del núcleo esté completamente seguro.
   3. Levante el portamuestras hasta que el núcleo toque ligeramente la hoja. Tira de la cuchilla sobre toda la extensión del núcleo para cortar la primera parte de la parte superior.
   4. Empuje la cuchilla hacia atrás detrás del núcleo, levante el portamuestras unas micras y repita el procedimiento hasta obtener una superficie plana de al menos 2-3 mm de ancho.
   5. Tan pronto como la superficie se corte según lo previsto, retire el soporte del núcleo del soporte de muestras del micrótomo.
      NOTA: Se recomienda cortar los núcleos con un micrótomo y no lijarlos porque la superficie es más limpia y recta, y las celdas no están llenas de polvo.

4. Digitalización de las superficies del núcleo

1. Coloque el soporte de núcleo con la superficie de núcleo plana sobre la mesa de un sistema de captura de imágenes, como se presenta aquí el sistema WSL-Skippy.
2. Asegúrese de alinear el soporte del núcleo con la dirección de movimiento de la mesa o la cámara.
3. Coloque la mesa con el soporte central debajo de la cámara para que el anillo más externo esté en el centro de visión debajo del objetivo de la cámara.
4. Coloque una escala junto al inicio del núcleo y tome una imagen con fines de calibración.
   NOTA: Esto solo debe hacerse una vez cuando se hacen imágenes de muchos núcleos en sucesión.
5. Defina la longitud del núcleo en el software e inicie el proceso de captura de imágenes. Cuando se toma la última imagen, la mesa vuelve a la posición inicial.
6. Retire la muestra de la mesa, coloque el siguiente soporte debajo de la cámara y repita el procedimiento descrito anteriormente definiendo la longitud del núcleo hasta que se fotografíen todos los núcleos.
7. Utilice un software de costura (sin distorsiones), por ejemplo, PTGui, para combinar las imágenes individuales en una imagen final de la superficie del núcleo.

5. Almacenamiento de los núcleos

1. Tome los núcleos analizados en el soporte y colóquelos en el estante de almacenamiento portátil impreso con una impresora 3D.
2. Etiquete el bastidor para identificar los núcleos desde el exterior.
3. Guarde el estante en un estante o en cualquier otro archivo disponible.

Discusión

La inclusión de la anatomía de la madera en los estudios dendroecológicos abrió ampliamente estos estudios para nuevos y profundos análisis de las condiciones ambientales pasadas 28,29,30. Estas nuevas técnicas también intensificaron los esfuerzos analíticos, es decir, el tiempo de laboratorio necesario para generar los datos de interés. Han sido numerosos los intentos de optimizar el trabajo de laboratorio y de reducir el tiempo necesario en el laboratorio con respecto a las técnicas anatómicas de la madera 9,12,13,15,30. Pero casi no se han hecho esfuerzos para facilitar el procedimiento común de manipulación, preparación y almacenamiento de núcleos para estos estudios.

La impresión 3D ofrece nuevas posibilidades en este sentido⁹. El nuevo soporte de núcleo impreso en 3D es el primer intento de simplificar todo este procedimiento, haciéndolo menos lento y, por lo tanto, más eficiente.

Mientras que los núcleos almacenados en pajitas de plástico^31,32 o contenedores comparables deben extraerse para evitar que se desarrollen hongos en el exterior (y pronto también en el interior) del núcleo, los núcleos fijados en los soportes GSC pueden permanecer como están. Hasta este punto, es comparable a almacenarlos en pajitas de papel³³.

La ventaja se hace evidente tan pronto como todo el procedimiento de (i) retirar los núcleos de la paja (u otro contenedor), (ii) pegarlos en soportes de madera o fijarlos en otros objetos como soportes de cable, y (iii) el proceso posiblemente propenso a errores de transferir el código respectivo utilizado para cada núcleo, ya que fue casi un estándar durante décadas³⁴, se vuelve innecesario.

La estructura abierta del soporte GSC permite almacenar los núcleos sin riesgo de infestación de hongos, como sería el caso cuando se almacena en un contenedor de plástico. Como se ha descrito anteriormente, el soporte también permite una incrustación en parafina para estabilizar la estructura. Sin embargo, esta "simple" incrustación no puede compararse con los procedimientos comunes de incrustación que utilizan casetes para incrustar la muestra en un bloque de parafina, como se hace para los micronúcleos³⁵. La técnica simple es bastante comparable a la aplicación de almidón de maíz al cortar micro secciones³⁶. Estabilizará mejor las células y evitará que se rompan durante el procedimiento de corte, pero requiere más tiempo que simplemente agregar almidón de maíz. Esta forma de incrustación no estabilizará todo el núcleo como si estuviera incrustado en un bloque. Si el núcleo se rompe, las secciones también se romperán. Dado que el soporte GSC encaja en el micrótomo^{central 37}, la preparación de la superficie para el posterior proceso de digitalización solo lleva unos minutos.

Para el proceso de digitalización de los anillos de los árboles, la aplicación de escáneres planos, frecuentemente utilizados para las mediciones de la intensidad del azul^38,39, no fue satisfactoria en cuanto a vistas más detalladas de la estructura del anillo debido a la baja calidad de las imágenes resultantes. Aunque los límites de los anillos comunes (anchos) de las coníferas eran visibles en estas imágenes, los anillos estrechos, o incluso las fluctuaciones de densidad, eran casi imposibles de identificar.

Aunque existen nuevos y fascinantes intentos de digitalizar los anillos de los árboles en alta resolución, como la tomografía computarizada de rayos^{X 40}, el uso de cámaras digitales de alta resolución sigue siendo la forma más eficiente y rentable de producir imágenes de alta calidad para mediciones posteriores.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Core-microtome	WSL	https://www.wsl.ch/en/services-produkte/microtomes/	Microtome to cut micro sections from increment cores
Epson Expression 10000XL	EPSON	https://epson.com/Support/Scanners/Expression-Series/Epson-Expression-10000XL---Graphic-Arts/s/SPT_E10000XL-GA	flatbed scanner
GSC holder	WSL	in-house	3D printed mount to fix cores for transport, preparation, analyses, and storage
Skippy image capturing system	WSL	https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/)	Image capturing system developed at WSL equiped with a 61 MP camera (Sony Alpha 7R IV and Sony FE 90mm f/2.8 Macro lens)