インクリメントコアのサンプリングとデジタイズのための新しいワークフロー

要約

3Dプリントされたマウントを使用して、木製のマウントに開梱して接着する必要なく、現場でインクリメントコアを固定するプロトコルを紹介します。新しいGSCホルダーは、コアをコアミクロトームに配置して表面を切断し、直接デジタル画像キャプチャに転写することができます。

要約

ここでは、現場でインクリメントコアを取得し、それらを保管してラボに輸送することから、その後の樹木生態学的分析のためのさらなる分析のための年輪のデジタル化までの新しいワークフローを紹介します。この手順では、インクリメントコアに新しいサンプルキャリアを使用します。これらの新しいゲルトナー・シュナイダー・コア(GSC)ホルダーは、3次元(3D)モデリングソフトウェアを使用して設計され、最終的に3Dプリンターでプリントされます。これらのマウントを現場で最初から使用すると、コアミクロトームで直接コアを切断でき、新しい高解像度画像キャプチャシステムを使用して、さらに再配置することなく表面をデジタル化できます。したがって、これらは直接分析に使用できます。このシステムでは、コアやディスクから年輪をデジタル化したり、透過光を使用して長いマイクロセクション(最大40cm)から画像を撮影したりできます。この特徴は、コアミクロトームで切断されたマイクロセクションの擾乱の発生を特定するための年輪生態学的および地形学的アプリケーションにとって特に興味深いものです。

概要

クロスデート技術を適用して年輪を年代測定する原理は、1881年にオーストリアの森林科学者Arthur Freiherr von Seckendorff-Gudentによって初めて導入^{されました1。}20^世紀 前半に、この技術は「年輪年代学の父」アンドリュー・エリコット・ダグラスによって再発明され、彼はそれを考古学的遺跡や生きている樹木^の年代測定に集中的に適用しました2。

今日、年輪生態学は、年輪年代学の一種の環境フレームとして機能する研究トピックであり、年輪と、時間の生態学的および環境的変化によって引き起こされるそれらの固有の成長変動の研究として定義されています³。年輪生態学研究では、安定同位体、後期木材密度、単一年輪内の細胞特性など、年輪幅の変動以外にも多くの特性を使用して、これらのデータを環境パラメータと相関させ、環境条件が樹木の成長に及ぼす影響を経時的に理解しています⁴。木材の解剖学的研究と年輪生態学的研究の継続的な統合を通じて、年輪生態学の研究は過去10年間で進化し、過去の気候条件を再構築する上でこれまで以上にバックボーンとなっています5,6,7,8。

サンプル調製と分析に関する技術開発、特に木材解剖学に関する技術開発は、過去10年間で強力であったが9,10,11,12,13,14、サンプリング技術の簡素化¹⁵に関しては、ほとんど実質的な進歩はなかった。例えば、音波技術¹⁶にもかかわらず、今日まで、木から年輪の特性を抽出するための信頼できる「非破壊的」な方法は存在しなかった。

そのため、年輪関連の研究はすべて、関心のある場所で採取された樹木や低木から採取した木製サンプルに依拠しています。樹木に焦点を当てる場合、標準的な手順は、幹¹⁵からコアをインクリメントすることです。

インクリメントコアラーを使用してコアを取ることは、しばしば「非破壊的」手法として表現されます¹⁷。ステムからディスクを取るのと比較すると、これは正しいです。それにもかかわらず、このサンプリング手法は、直径約1cmの茎に穴をあけ、その大部分は茎の髄を越えて到達^する3。木はこの傷を自然に閉じることができますが、このプロセスは成長反応を引き起こし、創傷のすぐ近くの一般的な構造を変えるだけでなく、真菌性疾患^18,19のために穴の周りの既存の木材の多かれ少なかれ激しい変色を引き起こします。ですから、「非破壊的」というよりは「低侵襲的」と呼ぶべきでしょう。

インクリメントコアを取る技術は、最近、機械式ドリルを使用する能力を通じて進化し、特に木材の解剖学的分析¹⁵において、より高品質のサンプルをもたらしました。この手順は、手動のコアリングと比較して、現場での時間を大幅に節約します。変わらなかったのは、木からの抽出からラベリング、輸送用の保管、およびさまざまな可能な分析技術のためのラボでのコアの準備まで、コアの取り扱い手順でした。

芯は、輸送中に芯が折れるのを防ぐために、プラスチックや紙製のストローなどの安定した容器に詰める必要があります。芯のラベリングは、柔らかい鉛筆を使用して芯に直接行うか、(より頻繁に)各ストローの外側で行います。プラスチック容器を使用する場合は、真菌の拡散を避けるために、短時間でコアを取り出す必要があります。そのため、コアをコンテナから再度取り出す必要があります。コアを安定させ、乾燥開始時にコアが曲がらないようにするには、コアをマウントに固定する必要があります。これは、その後のさらなる分析のための表面処理にも役立ちます。その際、ラベルをそれぞれのマウントに転写する必要もあります。標準的な手順は、木製の台紙にコアを接着するか、段ボールのリルにテープで固定することです。それらを木製の台紙に接着することは、最も頻繁に使用される技術です。この手順は、コアの安定化、研磨、または切断に最適ですが、潜在的な化学的分析、同位体分析、さらには木材の解剖学的分析に関していくつかの欠点があります。もう 1 つの欠点は、必要な時間にもかかわらず、各コアのラベルが新しいマウントにエラーが起こりやすいことです。

年輪年代学では、正確な年代測定の基盤としての年輪幅の測定は、すべての年輪生態学的研究のバックボーンです²⁰。多くのラボでは、双眼鏡が取り付けられたLintab²¹などの測定テーブルを使用した手動測定にまだ依存していますが、フラットベッドスキャナーを使用してコア表面をデジタル化し、CooRecorder²²やWinDENDRO²³などのソフトウェアを使用してリング幅を測定する傾向があります。残念ながら、これらのスキャナー、たとえば広く使用されているEpson Expression 10000XLは、アーリーウッドまたはレイトウッドの気管として構造を明確に描写するのに十分な解像度を持っていません(図1)。このため、得られた画像は、双眼鏡^24,25を使用して元のコアに戻ることなく正確なクロスデート手順に重要な、非常に狭いリングや密度の変動などの困難な構造を認識するのには適していない。

年輪科学¹⁰において、適切な画像解析を行うためには、高い画像解像度が必須の前提条件であることから、WSL(Skippy、https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/)では、デジタルカメラを用いてコア表面の年輪をデジタル化する新しい画像キャプチャシステムを開発しました。その結果、既存のフラットベッドスキャナーよりも高い解像度の画像が得られました。このシステムは、2007年に開発されたATRICSシステム²⁶のアイデアに基づいています。最近では、スキッピーに匹敵するシンプルだが効率的な画像キャプチャシステムが、自己組み立てキット²⁷として発表された。

年輪のデジタル化、つまり反射光画像キャプチャは、増分コアまたはディスクの高解像度画像を作成するための重要なステップであり、時間効率の高いデジタルベースの年輪幅測定をサポートします。WSLで開発されたシステムでは、透過光を使用して長いマイクロセクション(最大40cm)から画像を撮影することもできます。この追加機能は、例えば、マイクロセクションにおける反応木材の発生を特定するための年輪地形学的アプリケーションにとって興味深いものです。

この研究では、現場やラボでのコアの取り扱いプロセスを容易にするためのプロトコルを提示します。提示された新しい技術のベースは、再利用可能なマウントです。新しいGSCホルダー GärtnerSchneiderC鉱石(GSC)ホルダーは、3Dモデリングソフトウェアを使用して設計され、3Dプリンターで印刷されました。GSCホルダーは、現場で取り込んだコアを再梱包したりラベルを付け直したりすることなく、簡単に取り扱うことができます。また、コアの準備された表面をデジタル化するための効率的な新しいシステムも紹介します。このプロトコルは、現場でのコアの採取からサンプル調製、その後の分析のためにコア表面をデジタル化し、最終的にアーカイブに保存するまでの手順全体に及びます。

プロトコル

1. GSCホルダーの作成

1. ホルダーの3Dモデルを、3Dプリンターに対応したスライサープログラムで開きます。3Dプリンターで読み込める印刷ファイル(この場合は「*.gcode」ファイル)を作成します。
   注:3Dモデルは、任意の3Dモデリングソフトウェアを使用して設計できます。
2. メモリカードまたはUSBスティックを使用してプリントファイルを3Dプリンターに転送し、3Dプリンターで印刷ファイルをアクティブにします。
3. ホルダーが印刷されたらすぐに、ホルダーが室温(RT)まで冷えるまで待ちます。次に、ホルダーが貼り付けられているプレートをプリンターから取り外し、フォームが表面から離れるまでプレートを少し曲げます。
4. ホルダーから余分な糸やアタッチメントをすべて取り外します。
   注意: 一度に印刷するホルダーの数は、プリンターのサイズによって異なります。プレート寸法が36cm×36cmの3Dプリンターでは、長さ35cmのホルダーを1回で約30個プリントできます。30個のホルダーを印刷するのに必要な時間は、デバイスによって異なります。平均して、これは約8時間(夜間印刷)で完了する必要があります。

2. 現場でのインクリメントコアの抽出、安定化、輸送

1. トルクブースターとインクリメントコアラーを装備したコードレスドリルを取り、コアリングの位置を選択し、コアラーをステムの成長軸に垂直に配置します。
   注意: コードレスドリルを使用せずに、インクリメントコアラーを使用して手動で同じことを行うことができます。
2. コアラーがステム直径の少なくとも半分に達するまでコアリングを開始します。上記のように、エクストラクター(コアラーと同じ長さ)をコアラーの横に保持して、深さを確認します。
3. コードレスドリルを使用する場合は、ドリルを取り外し、ハンドルをコアラーに置き(インクリメントコアラーを手動で使用する場合はすでにそうです)、開いた面を上に向けてエクストラクターを取り、コアラーに完全に挿入します。
4. インクリメントコアラーを後方に回す(1回転する)と、コアをステムから切り離します。コアを含むエクストラクターを取り出します。
5. エクストラクターからコアを取り外します。コアをホルダーに配置するときは、コアのファイバー方向を確認して、ファイバーの直立した向きを確認してください。
   注:ファイバーの方向は、コアの両端とコアの側面で確認できます。このためには、コアを光に当てて、側面が輝くまで回します。これは、こちら側では、放射状の細胞壁が縦方向に切断され、コアの他の部分とは異なる方法で光を反射するために発生します。
6. ファイバー方向を直立させて、コアをホルダーの上に置きます。コアがホルダーに滑り込むまで、すべての指でコアの上部を押します。
7. ホルダーの側面にある芯に柔らかい鉛筆でラベルを貼り、ガラスにも書き込めるようにします。
   注意: 書き込みは、後で一般的なゴムで取り外すことができます。
8. 芯のあるホルダーを輸送ボックスに入れ、カバーを閉じます。

3. ラボでマウントされたコアの準備

1. オプション:マウントされたコアをパラフィンに埋め込むことで、マイクロセクショニングが可能になります。
   1. 真空ポンプ接続用のバルブが取り付けられた蓋付きのスチールボックスをホットプレートに置き、パラフィンを約2cmまで充填し、完全に溶けるまで待ちます。
   2. 取り付けられたコアをトランスポートボックスから取り出します。ホルダーをコアをそのまま流動パラフィンに入れ、蓋を閉めます。
   3. 真空ポンプを始動し、容器に一定の軽い真空を当てて、約2時間待ちます。ホルダーのオープン構造により、パラフィンは追加の障壁なしにコアを貫通できます。
   4. 真空ポンプを停止し、蓋を開けます。コアの入ったホルダーを取り出し、グリッドに置き、冷まします。
   5. 必要に応じて、ホルダーの側面から余分なパラフィンを取り除きます。
2. コアサーフェスの準備
   1. 取り付けられたコアを輸送ボックスまたはパラフィンバスから取り出します。コア付きのホルダーをそのままコアミクロトームのサンプルホルダーに置きます。リングのレイトウッドがブレードを向くようにコアを向けてください。
   2. コアホルダーが完全に固定されるまで、サンプルホルダーのネジを締めます。
   3. コアがブレードにわずかに触れるまで、サンプルホルダーを持ち上げます。コアの全範囲にわたってブレードを引っ張って、上部の最初の部分を切り取ります。
   4. ナイフをコアの後ろに押し戻し、サンプルホルダーを数ミクロン持ち上げ、幅が少なくとも2〜3mmの平面が得られるまで手順を繰り返します。
   5. 意図したとおりに表面を切断したらすぐに、ミクロトームのサンプルホルダーからコアホルダーを取り外します。
      注:コアミクロトームでコアを切断し、表面がきれいでまっすぐで、セルがほこりで満たされていないため、サンディングしないことをお勧めします。

4. コアサーフェスのデジタイズ

1. ここでWSL-Skippyシステムが示されているように、プレーンコア面を持つコアホルダーを画像キャプチャシステムのテーブルに置きます。
2. コアホルダーをテーブルまたはカメラの移動方向に合わせてください。
3. コアホルダーをカメラの下に置き、最も外側のリングがカメラ対物レンズの下の view 中央になるようにします。
4. コアの開始点の隣にスケールを置き、キャリブレーションのために画像を撮ります。
   注:これは、多数のコアのイメージを連続して行う場合に1回だけ行う必要があります。
5. ソフトウェアでコアの長さを定義し、画像キャプチャ プロセスを開始します。最後の画像が撮影されると、テーブルは開始位置に戻ります。
6. サンプルをテーブルから取り出し、次のホルダーをカメラの下に置き、すべてのコアが撮影されるまでコアの長さを定義して前述の手順を繰り返します。
7. PTGuiなどの(歪みのない)スティッチングソフトウェアを使用して、単一の画像をコア表面の1つの最終画像に結合します。

5. コアの保管

1. 解析したコアをホルダーに取り、3Dプリンターでプリントしたポータブルストレージラックに入れます。
2. ラックにラベルを付けて、外部からコアを識別します。
3. ラックは、棚またはその他の使用可能なアーカイブに保管します。

ディスカッション

樹木の解剖学を樹木生態学的研究に含めることで、これらの研究は過去の環境条件の新しく詳細な分析に広く開かれました28,29,30。これらの新しい手法は、分析作業、つまり目的のデータを生成するために必要なラボ時間も強化しました。実験室での作業を最適化し、木材解^{剖学的技術}9,12,13,15,30に関して実験室で必要な時間を短縮するための多くの試みがなされてきた。しかし、これらの研究のために行われたコアの取り扱い、準備、および保管の一般的な手順を容易にするための努力はほとんど行われていません。

3Dプリンティングは、この点で新たな可能性を提供します⁹。新しい3Dプリントされたコアホルダーは、この手順全体を簡素化し、時間を短縮し、より効率的にする最初の試みです。

プラスチック製スト^ロー31,32または同等の容器に保存されたコアは、コアの外側(およびすぐに内側)で真菌が発生するのを防ぐために取り出す必要がありますが、GSCホルダーに固定されたコアはそのままにしておくことができます。この点までは、紙製スト^ロー33に収納するのと同等である。

その利点は、(i)藁(または他の容器)から芯を取り外す、(ii)芯を木製の台紙に接着するか、ケーブルサポートとして他の物体に固定する、そして(iii)各芯に使用されるそれぞれのコードを転送するというエラーが発生しやすいプロセスを実行するとすぐに明らか^{になります。} 不要になります。

GSCホルダーのオープン構造により、プラスチック容器に保管する場合のように、真菌の侵入のリスクなしにコアを保管することができます。上述したように、ホルダーは、構造を安定させるためにパラフィンに包埋することも可能にする。それにもかかわらず、この「単純な」埋め込みは、マイクロコア³⁵に対して行われるように、サンプルをパラフィンブロックに埋め込むためにカセットを使用する一般的な埋め込み手順と比較することはできない。この単純な技術は、マイクロ切片³⁶を切断する際にコーンスターチを塗布することにかなり匹敵する。これにより、細胞がより安定し、切断手順中に細胞が破損するのを防ぐことができますが、単にコーンスターチを追加するよりも時間がかかります。この形式の埋め込みでは、コア全体がブロックに埋め込まれているかのように安定することはありません。コアが壊れると、セクションも壊れます。GSCホルダーはコアミクロトーム³⁷に収まるため、その後のデジタル化プロセスのための表面の準備には数分しかかかりません。

年輪をデジタル化するプロセスでは、青色強度測定^38,39に頻繁に使用されるフラットベッドスキャナーの適用は、結果として得られる画像の品質がかなり低かったため、年輪構造のより詳細なビューに関しては満足のいくものではなかった。これらの画像では、針葉樹の一般的な(幅の広い)リングの境界が見えましたが、狭いリングや密度の変動さえも識別することはほぼ不可能でした。

X線CT⁴⁰など、年輪を高解像度でデジタル化する魅力的な新しい試みがありますが、高解像度のデジタルカメラを使用することは、さらなる測定のために高品質の画像を生成するための最も効率的で費用対効果の高い方法です。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Core-microtome	WSL	https://www.wsl.ch/en/services-produkte/microtomes/	Microtome to cut micro sections from increment cores
Epson Expression 10000XL	EPSON	https://epson.com/Support/Scanners/Expression-Series/Epson-Expression-10000XL---Graphic-Arts/s/SPT_E10000XL-GA	flatbed scanner
GSC holder	WSL	in-house	3D printed mount to fix cores for transport, preparation, analyses, and storage
Skippy image capturing system	WSL	https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/)	Image capturing system developed at WSL equiped with a 61 MP camera (Sony Alpha 7R IV and Sony FE 90mm f/2.8 Macro lens)