Ein neuer Workflow für die Probenahme und Digitalisierung von inkrementellen Kernen

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll vor, um 3D-gedruckte Halterungen zu verwenden, um inkrementelle Kerne im Feld zu fixieren, ohne dass sie ausgepackt und auf Holzhalterungen geklebt werden müssen. Der neue GSC-Halter ermöglicht es, die Kerne in ein Kernmikrotom zu legen, um ihre Oberfläche zu schneiden und sie direkt in die digitale Bildaufnahme zu übertragen.

Zusammenfassung

Hier stellen wir einen neuen Arbeitsablauf vor, der von der Entnahme von inkrementellen Kernen im Feld über die Lagerung und den Transport ins Labor bis hin zur Digitalisierung ihrer Baumringe für weitere Analysen für nachfolgende dendroökologische Analysen reicht. Das Verfahren beinhaltet die Verwendung neuer Probenträger für Inkrementkerne. Diese neuen Gärtner Schneider Core (GSC) Halter werden mit Hilfe einer dreidimensionalen (3D) Modellierungssoftware entworfen und schließlich mit einem 3D-Drucker gedruckt. Mit diesen Halterungen von Anfang an im Feld können die Kerne direkt mit einem Kernmikrotom geschnitten und ihre Oberfläche dann ohne weitere Neuanordnung mit einem neuen hochauflösenden Bilderfassungssystem digitalisiert werden. Sie stehen somit für die direkte Analyse zur Verfügung. Dieses System ermöglicht die Digitalisierung von Baumringen aus Bohrkernen und Scheiben sowie die Aufnahme von Bildern von langen Mikroschnitten (bis zu 40 cm) mit Durchlicht. Diese Eigenschaft ist von besonderem Interesse für dendroökologische und geomorphologische Anwendungen, um das Auftreten von Störungen in Schliffen zu identifizieren, die mit einem Kernmikrotom geschnitten wurden.

Einleitung

Das Prinzip der Datierung von Baumringen unter Anwendung der Kreuzdatierungstechnik wurde erstmals 1881 von dem österreichischen Forstwissenschaftler Arthur Freiherr von Seckendorff-Gudent eingeführt¹. In der ersten Hälfte des 20^. Jahrhunderts wurde diese Technik vom "Vater der Dendrochronologie" Andrew Ellicott Douglass neu erfunden und intensiv bei der Datierung archäologischer Stätten und lebender Bäume angewandt².

Heutzutage wird die Dendroökologie, das Forschungsthema, das als eine Art Umweltrahmen der Dendrochronologie fungiert, definiert als die Untersuchung von Baumringen und ihren inhärenten Wachstumsvariationen, die durch ökologische und umweltbedingte Veränderungen in der Zeit verursacht^{werden 3}. In der dendroökologischen Forschung werden viele andere Merkmale als Ringbreitenvariationen, wie stabile Isotope, späte Holzdichte oder Zelleigenschaften innerhalb einzelner Ringe, verwendet, um diese Daten mit Umweltparametern zu korrelieren und den Einfluss der Umweltbedingungen auf das Baumwachstum im Laufe der Zeit besser zu verstehen⁴. Durch die fortlaufende Integration von holzanatomischen Studien in die dendroökologische Forschung hat sich die dendroökologische Forschung im letzten Jahrzehnt weiterentwickelt und ist mehr denn je ein Rückgrat bei der Rekonstruktion vergangener Klimabedingungen 5,6,7,8.

Obwohl die technische Entwicklung in Bezug auf die Probenvorbereitung und -analyse, insbesondere in der Holzanatomie, in den letzten zehn Jahren stark war 9,10,11,12,13,14, gab es fast keine wirklichen Fortschritte in Bezug auf die Vereinfachung der Probenahmetechniken¹⁵. Entgegen z.B. der akustischen Wellentechnologie¹⁶ gibt es bis heute keine verlässliche "zerstörungsfreie" Methode, um die Eigenschaften von Ringen von Bäumen zu extrahieren.

Folglich stützen sich alle jahrringbezogenen Studien nach wie vor auf Holzproben, die von Bäumen oder Sträuchern entnommen wurden, die an den interessierenden Standorten entnommen wurden. Bei der Fokussierung auf Bäume besteht das Standardverfahren darin, inkrementelle Kerne aus den Stämmen¹⁵ zu entnehmen.

Die Entnahme von Kernen mit Hilfe von Inkrementkernen wird häufig als "zerstörungsfreie" Technik ausgedrückt¹⁷. Verglichen mit der Entnahme von Scheiben aus Stängeln ist dies korrekt; Nichtsdestotrotz verursacht diese Probenahmetechnik ein Loch im Stiel von etwa 1 cm Durchmesser, das meist über das Mark des Stiels^{hinausreicht 3}. Der Baum ist in der Lage, diese Wunde von selbst zu schließen, aber dieser Prozess verursacht Wachstumsreaktionen, die die gemeinsame Struktur in der Nähe der Wunde verändern sowie eine mehr oder weniger starke Verfärbung des vorhandenen Holzes um das Loch herum aufgrund von Pilzkrankheiten^18,19. Man sollte es also eher als "minimalinvasiv" denn als "zerstörungsfrei" bezeichnen.

Die Technik der Entnahme von inkrementellen Kernen hat sich in jüngster Zeit durch die Möglichkeit entwickelt, mechanische Bohrer zu verwenden, was zu qualitativ hochwertigeren Proben führt, insbesondere für holzanatomische Analysen¹⁵. Dieses Verfahren spart auch viel Zeit im Feld im Vergleich zum manuellen Kernbohren. Unverändert blieb das Verfahren des Umgangs mit den Bohrkernen, angefangen bei der Extraktion aus dem Baum über die Beschriftung, Lagerung für den Transport bis hin zur Vorbereitung im Labor für verschiedene mögliche Analysetechniken.

Die Hülsen müssen nach wie vor in stabilen Behältern, wie z. B. Strohhalmen aus Kunststoff oder Papier, verpackt werden, damit sie während des Transports nicht brechen. Die Beschriftung der Kerne erfolgt direkt auf dem Kern mit weichen Bleistiften oder (häufiger) auf der Außenseite jedes Strohhalms. Bei der Verwendung von Kunststoffbehältern müssen die Kerne nach kurzer Zeit herausgenommen werden, um die Ausbreitung von Pilzen zu vermeiden. Die Kerne müssen also wieder aus den Behältern entnommen werden. Um die Kerne zu stabilisieren und zu verhindern, dass sie sich beim Trocknen verbiegen, müssen die Kerne auf einer Halterung fixiert werden. Dies hilft auch bei der anschließenden Oberflächenvorbereitung für weitere Analysen. Dabei müssen auch die Etiketten auf die jeweiligen Passepartouts übertragen werden. Ein Standardverfahren ist das Aufkleben der Kerne auf Holzhalterungen oder das Fixieren mit Klebeband in den Rillen von Wellpappen. Das Aufkleben auf Holzhalterungen ist die am häufigsten verwendete Technik. Obwohl dieses Verfahren perfekt zum Stabilisieren und Schleifen oder Schneiden der Kerne geeignet ist, hat es mehrere Nachteile in Bezug auf mögliche chemische, isotopische und sogar holzanatomische Analysen. Ein weiterer Nachteil, trotz des Zeitaufwands, ist die fehleranfällige Übertragung der Labels für jeden Kern auf die neuen Mounts.

In der Dendrochronologie sind Ringbreitenmessungen als Grundlage für eine genaue Datierung das Rückgrat aller dendroökologischen Studien²⁰. Obwohl viele Labore immer noch auf manuelle Messungen mit Messtabellen setzen, z. B. Lintab²¹ mit angeschlossenem Fernglas, gibt es einen Trend zum Einsatz von Flachbettscannern zur Digitalisierung von Kernoberflächen und zur Messung der Ringbreite mit Software wie CooRecorder²² oder WinDENDRO²³. Leider haben diese Scanner, wie z.B. der weit verbreitete Epson Expression 10000XL, keine ausreichende Auflösung, um Strukturen als Früh- oder Spätholztracheiden eindeutig darzustellen (Abbildung 1). Aus diesem Grund sind die resultierenden Bilder nicht geeignet, um schwierige Strukturen wie sehr schmale Ringe oder Dichtefluktuationen zu erkennen, die für ein genaues Cross-Datierverfahren ohne Rückgriff auf die ursprünglichen Kerne mit einem Fernglas entscheidend sind^24,25.

Da eine hohe Bildauflösung eine unabdingbare Voraussetzung für adäquate Bildanalysen in der Jahrringforschung¹⁰ ist, wurde an der WSL ein neues Bilderfassungssystem (Skippy; https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/) entwickelt, um Baumringe auf Bohrkernoberflächen mit einer Digitalkamera zu digitalisieren, was zu Bildern führt, die eine höhere Auflösung aufweisen als alle bestehenden Flachbettscanner. Dieses System basiert auf der Idee des ATRICS-Systems²⁶, das 2007 entwickelt wurde. Zuletzt wurde ein einfaches, aber effizientes Bilderfassungssystem, vergleichbar mit dem Kippy, als Selbstbausatz²⁷ vorgestellt.

Die Digitalisierung von Baumringen, d.h. die Erfassung von Auflichtbildern, ist ein wichtiger Schritt bei der Erstellung hochauflösender Bilder von Inkrementkernen oder Scheiben, um eine zeiteffiziente, digital basierte Ringbreitenmessung zu unterstützen. Das an der WSL entwickelte System ermöglicht auch die Aufnahme von Bildern aus langen Mikroschnitten (bis zu 40 cm) mittels Durchlicht. Dieses zusätzliche Merkmal ist z.B. für dendrogeomorphe Anwendungen interessant, um das Auftreten von Reaktionsholz in Mikroschnitten zu identifizieren.

In der Studie stellen wir ein Protokoll vor, das den Umgang mit Bohrkernen im Feld und im Labor erleichtern soll. Die Basis der vorgestellten neuen Technik ist eine wiederverwendbare Halterung; der neue GSC-Halter GärtnerSchneiderErz(GSC) Halter, der mit Hilfe einer 3D-Modellierungssoftware entworfen und mit einem 3D-Drucker gedruckt wurde. Der GSC-Halter ermöglicht eine einfache Handhabung der im Feld entnommenen Bohrkerne, ohne dass diese neu verpackt oder etikettiert werden müssen. Außerdem stellen wir ein effizientes neues System zur Digitalisierung der vorbereiteten Oberflächen der Kerne vor. Dieses Protokoll umfasst das gesamte Verfahren von der Entnahme von Bohrkernen vor Ort über die Probenvorbereitung bis hin zur Digitalisierung der Kernoberflächen für nachfolgende Analysen und schließlich deren Speicherung in einem Archiv.

Protokoll

1. Anlegen des GSC-Inhabers

1. Öffnen Sie das 3D-Modell des Halters in einem Slicer-Programm, das mit einem 3D-Drucker kompatibel ist. Erstellen Sie eine Druckdatei, die vom 3D-Drucker gelesen werden kann (in diesem Fall eine "*.gcode"-Datei).
   HINWEIS: Das 3D-Modell kann mit jeder 3D-Modellierungssoftware entworfen werden.
2. Übertragen Sie die Druckdatei mit einer Speicherkarte oder einem USB-Stick auf den 3D-Drucker und aktivieren Sie die Druckdatei auf dem 3D-Drucker.
3. Sobald der Halter gedruckt ist, warten Sie, bis der Halter auf Raumtemperatur (RT) abgekühlt ist. Entfernen Sie dann die Platte, an der der Halter haftet, vom Drucker und biegen Sie die Platte ein wenig, bis sich die Form von der Oberfläche löst.
4. Entfernen Sie alle überschüssigen Gewinde oder Aufsätze aus der Halterung.
   HINWEIS: Die Anzahl der Halter, die gleichzeitig gedruckt werden sollen, hängt von der Größe des Druckers ab. Auf einem 3D-Drucker mit einem Plattenmaß von 36 cm x 36 cm kann man rund 30 Halter mit einer Länge von 35 cm in einem Durchgang drucken. Die Zeit, die benötigt wird, um 30 Halter zu drucken, hängt vom Gerät ab. Im Durchschnitt sollte dies in ca. 8 h (Drucken über Nacht) erledigt sein.

2. Extrahieren, Stabilisieren und Transportieren von Inkrementkernen im Feld

1. Nehmen Sie einen Akku-Bohrschrauber, der mit einem Drehmomentverstärker und einem Inkrementalbohrer ausgestattet ist, wählen Sie die Position des Kernbohrers und platzieren Sie den Bohrer senkrecht zur Wachstumsachse des Stiels.
   HINWEIS: Das Gleiche kann manuell mit dem Inkrementalgreifer ohne Akkubohrer durchgeführt werden.
2. Beginnen Sie mit dem Entkernen, bis der Entkerner mindestens die Hälfte des Stieldurchmessers erreicht hat. Überprüfen Sie die Tiefe wie oben beschrieben, indem Sie den Extraktor (der die gleiche Länge wie der Entkerner hat) neben den Entkerner halten.
3. Wenn Sie einen Akku-Bohrschrauber verwenden, nehmen Sie den Bohrer ab, setzen Sie den Griff auf den Ausbohrer (was bereits bei der manuellen Verwendung des Inkrementalbohrers der Fall ist), nehmen Sie den Auszieher mit der offenen Seite nach oben und setzen Sie ihn vollständig in den Ausbohrer ein.
4. Drehen Sie den Inkrementierkern nach hinten (eine volle Umdrehung), um den Kern vom Stiel abzubrechen. Nehmen Sie den Extraktor einschließlich des Kerns heraus.
5. Entfernen Sie den Kern aus dem Extraktor. Überprüfen Sie die Faserrichtung des Kerns, um eine aufrechte Ausrichtung der Fasern zu gewährleisten, wenn Sie den Kern in den Halter legen.
   HINWEIS: Die Faserrichtung kann sowohl an beiden Enden des Kerns als auch an der Seite des Kerns überprüft werden. Halten Sie dazu den Kern gegen das Licht und drehen Sie ihn, bis ein seitliches Leuchten zu sehen ist. Dies geschieht, weil auf dieser Seite die radialen Zellwände in Längsrichtung geschnitten sind und das Licht anders reflektieren als der Rest des Kerns.
6. Legen Sie den Kern mit der Faserrichtung aufrecht auf den Halter. Mit allen Fingern auf den Kern drücken, bis der Kern in die Halterung gleitet.
7. Beschriften Sie den Kern an der Seite des Halters mit einem weichen Bleistift, so dass auch auf Glas geschrieben werden kann.
   HINWEIS: Die Schrift kann später mit einem handelsüblichen Gummi entfernt werden.
8. Setzen Sie die Halterung mit dem Kern in die Transportbox ein und schließen Sie die Abdeckung.

3. Vorbereitung der montierten Kerne im Labor

1. OPTIONAL: Einbetten der montierten Kerne in Paraffin für mögliche Mikroschnitte.
   1. Stellen Sie einen Stahlkasten mit einem Deckel und einem Ventil für den Anschluss einer Vakuumpumpe auf eine Kochplatte, füllen Sie ihn bis zu ca. 2 cm mit Paraffin und warten Sie, bis er vollständig geschmolzen ist.
   2. Nehmen Sie die montierten Kerne aus der Transportbox. Setzen Sie die Halter mit den Kernen, so wie sie sind, in das flüssige Paraffin ein und schließen Sie den Deckel.
   3. Starten Sie die Vakuumpumpe, legen Sie ein konstantes, leichtes Vakuum auf den Behälter an und warten Sie ca. 2 h. Durch die offene Struktur des Halters kann das Paraffin ohne zusätzliche Barrieren in die Kerne eindringen.
   4. Stoppen Sie die Vakuumpumpe und öffnen Sie den Deckel. Die Halterungen mit den Kernen herausnehmen, auf ein Gitter legen und abkühlen lassen.
   5. Entfernen Sie bei Bedarf überschüssiges Paraffin von den Seiten des Halters.
2. Vorbereiten der Kernoberflächen
   1. Nehmen Sie die montierten Kerne aus der Transportbox oder dem Paraffinbad. Platzieren Sie den Halter mit dem Kern so wie er sich in dem Probenhalter eines Kernmikrotoms befindet. Achte darauf, den Kern so auszurichten, dass das Spätholz der Ringe zur Klinge zeigt.
   2. Ziehen Sie die Schrauben des Probenhalters fest, bis der Kernhalter vollständig sitzt.
   3. Heben Sie den Probenhalter an, bis der Kern die Klinge leicht berührt. Ziehe die Klinge über die gesamte Ausdehnung des Kerns, um den ersten Teil der Oberseite abzuschneiden.
   4. Schieben Sie das Messer hinter den Kern zurück, heben Sie den Probenhalter einige Mikrometer an und wiederholen Sie den Vorgang, bis eine ebene Fläche von mindestens 2-3 mm Breite erreicht ist.
   5. Sobald die Oberfläche wie vorgesehen geschnitten ist, entfernen Sie den Kernhalter vom Probenhalter des Mikrotoms.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Kerne mit einem Kernmikrotom zu schneiden und nicht zu schleifen, da die Oberfläche sauberer und gerade ist und die Zellen nicht mit Staub gefüllt sind.

4. Digitalisieren der Kernflächen

1. Platzieren Sie den Kernhalter mit der glatten Kernfläche auf dem Tisch eines Bilderfassungssystems, wie hier das WSL-Skippy-System vorgestellt wird.
2. Achten Sie darauf, dass der Kernhalter mit der Bewegungsrichtung des Tisches oder der Kamera ausgerichtet ist.
3. Positionieren Sie den Tisch mit dem Kernhalter unter der Kamera, sodass sich der äußerste Ring in der Bildmitte unter dem Kameraobjektiv befindet.
4. Platzieren Sie eine Skala neben dem Beginn des Kerns und nehmen Sie ein Bild zur Kalibrierung auf.
   HINWEIS: Dies muss nur einmal gemacht werden, wenn Bilder von vielen Kernen hintereinander erstellt werden.
5. Definieren Sie die Länge des Kerns in der Software und starten Sie den Bildaufnahmeprozess. Wenn das letzte Bild aufgenommen wurde, bewegt sich der Tisch wieder in die Ausgangsposition.
6. Nehmen Sie die Probe vom Tisch, platzieren Sie den nächsten Halter unter der Kamera und wiederholen Sie das zuvor beschriebene Verfahren, indem Sie die Länge des Kerns festlegen, bis alle Kerne fotografiert sind.
7. Verwenden Sie eine (verzerrungsfreie) Stitching-Software, z.B. PTGui, um die Einzelbilder zu einem endgültigen Bild der Kernoberfläche zusammenzusetzen.

5. Lagerung der Kerne

1. Nehmen Sie die analysierten Kerne in die Halterung und legen Sie sie in das tragbare Lagerregal, das mit einem 3D-Drucker gedruckt wurde.
2. Beschriften Sie das Rack, um die Kerne von außen zu identifizieren.
3. Bewahren Sie das Regal in einem Regal oder einem anderen verfügbaren Archiv auf.

Diskussion

Die Einbeziehung der Holzanatomie in dendroökologische Studien öffnete diese Studien weitgehend für neue und tiefergehende Analysen vergangener Umweltbedingungen 28,29,30. Diese neuen Techniken intensivierten auch den analytischen Aufwand, d. h. die Laborzeit, die benötigt wurde, um die interessierenden Daten zu generieren. Es gab zahlreiche Versuche, die Laborarbeit zu optimieren und den Zeitaufwand im Labor für holzanatomische Techniken zu reduzieren 9,12,13,15,30. Es wurden jedoch fast keine Anstrengungen unternommen, um das übliche Verfahren der Handhabung, Aufbereitung und Lagerung von Bohrkernen, die für diese Studien entnommen wurden, zu vereinfachen.

Der 3D-Druck bietet in dieser Hinsicht neue Möglichkeiten⁹. Der neue, 3D-gedruckte Kernhalter ist der erste Versuch, das gesamte Verfahren zu vereinfachen und damit zeitsparender und damit effizienter zu machen.

Während Kerne, die in Kunststoffstrohhalmen^31,32 oder vergleichbaren Behältern gelagert werden, herausgenommen werden müssen, um die Entwicklung von Pilzen an der Außenseite (und bald auch an der Innenseite) des Kerns zu verhindern, können Kerne, die in den GSC-Haltern befestigt sind, so bleiben, wie sie sind. Bis zu diesem Punkt ist es vergleichbar mit der Aufbewahrung in Papierstrohhalmen³³.

Der Vorteil wird deutlich, sobald die ganze Prozedur des (i) Entfernens der Kerne aus dem Strohhalm (oder einem anderen Behälter), (ii) des Aufklebens auf Holzhalterungen oder des Befestigens an anderen Gegenständen als Kabelhalterungen und (iii) der möglicherweise fehleranfällige Prozess der Übertragung des jeweiligen Codes für jeden Kern verwendet wird, wie er nun schon jahrzehntelang fast ein Standard war³⁴, unnötig wird.

Die offene Struktur des GSC-Halters ermöglicht die Lagerung der Bohrkerne ohne das Risiko eines Pilzbefalls, wie es bei der Lagerung in einem Kunststoffbehälter der Fall wäre. Wie oben beschrieben, ermöglicht der Halter auch eine Einbettung in Paraffin, um die Struktur zu stabilisieren. Dennoch ist diese "einfache" Einbettung nicht vergleichbar mit herkömmlichen Einbettungsverfahren, bei denen Kassetten zur Einbettung der Probe in einen Paraffinblock verwendet werden, wie sie bei Mikrokernen³⁵ durchgeführt wird. Die einfache Technik ist eher vergleichbar mit dem Auftragen von Maisstärke beim Schneiden von Mikroschnitten³⁶. Es stabilisiert die Zellen besser und verhindert, dass sie während des Schneidvorgangs brechen, ist aber zeitaufwändiger als die einfache Zugabe von Maisstärke. Diese Form der Einbettung stabilisiert nicht den gesamten Kern, als wäre er in einen Block eingebettet. Wenn der Kern gebrochen ist, brechen auch die Abschnitte. Da der GSC-Halter in das Kernmikrotom³⁷ passt, dauert die Vorbereitung der Oberfläche für den anschließenden Digitalisierungsprozess nur wenige Minuten.

Für den Prozess der Digitalisierung von Baumringen war der Einsatz von Flachbettscannern, die häufig für Messungen der Blauintensität^38,39 verwendet werden, hinsichtlich der detaillierteren Ansichten der Ringstruktur aufgrund der eher geringen Qualität der resultierenden Bilder nicht zufriedenstellend. Obwohl die Grenzen der üblichen (breiten) Ringe von Nadelbäumen auf diesen Bildern sichtbar waren, waren schmale Ringe oder sogar Dichteschwankungen fast unmöglich zu identifizieren.

Obwohl es faszinierende neue Versuche gibt, Baumringe in hoher Auflösung zu digitalisieren, wie z.B. Röntgen CT⁴⁰, ist der Einsatz von Digitalkameras mit hoher Auflösung immer noch die effizienteste und kostengünstigste Möglichkeit, qualitativ hochwertige Bilder für weitere Messungen zu erzeugen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Core-microtome	WSL	https://www.wsl.ch/en/services-produkte/microtomes/	Microtome to cut micro sections from increment cores
Epson Expression 10000XL	EPSON	https://epson.com/Support/Scanners/Expression-Series/Epson-Expression-10000XL---Graphic-Arts/s/SPT_E10000XL-GA	flatbed scanner
GSC holder	WSL	in-house	3D printed mount to fix cores for transport, preparation, analyses, and storage
Skippy image capturing system	WSL	https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/)	Image capturing system developed at WSL equiped with a 61 MP camera (Sony Alpha 7R IV and Sony FE 90mm f/2.8 Macro lens)