Establecimiento de un modelo de ratón para la inhalación de aire a temperatura extremadamente baja del tracto respiratorio

Resumen

La estimulación del ambiente frío se ha implicado en el desarrollo de diversas enfermedades crónicas. Por lo tanto, es crucial establecer modelos animales para la investigación preclínica. Este sistema responde a esta necesidad ofreciendo un dispositivo que crea un modelo de estímulo, cumpliendo con los requisitos de la investigación básica sobre mecanismos patogénicos.

Resumen

Actualmente, la construcción de un modelo de ratón para la estimulación ambiental fría emplea placas de frío-calor y dispositivos de enfriamiento portátiles. Estos métodos pueden cumplir parcialmente los requisitos para estudiar las respuestas y los efectos reguladores de la piel o los circuitos neuronales del ratón a la estimulación con frío. Numerosos estudios clínicos han corroborado la correlación entre la exposición a ambientes de baja temperatura y el desarrollo de diversas enfermedades. Recientemente, ha habido un énfasis creciente en el intercambio continuo de información entre órganos y tejidos, proporcionando una perspectiva novedosa para abordar problemas de larga data dentro del cuerpo humano. Sin embargo, las instalaciones existentes no pueden construir un modelo para ratones que inhalan aire frío.

Aunque colocar ratones en un ambiente frío parece atractivo, tiene limitaciones considerables. Mientras los ratones inhalan aire frío, su piel también está siendo estimulada por el ambiente frío, por lo que no está claro si los cambios patológicos resultantes se deben a la estimulación pulmonar a través de la interacción de órganos distantes o a los receptores de la piel y la transmisión de señales neuronales. Esto crea una confusión considerable en la investigación relacionada. Este esquema presenta un nuevo enfoque para la construcción de un modelo de ratón para la estimulación de la inhalación de aire frío extremo. Este dispositivo permite a los ratones inhalar gases a temperaturas extremadamente bajas mientras sus cuerpos permanecen a una temperatura normal. Maximiza la simulación de los efectos estimulantes de las temperaturas ambientales extremas en ratones y satisface las necesidades de investigación para estudiar la relación entre las temperaturas ambientales extremas y las enfermedades relacionadas.

Introducción

Este método proporciona principalmente un modelo de estimulación del aire a temperatura extremadamente baja en ratones que utilizan un dispositivo de retroalimentación de temperatura de refrigeración de semiconductores no invasivo, estandarizado, estable y por lotes. Los experimentos clínicos relacionados con las bajas temperaturas han confirmado una estrecha relación con la incidencia y el pronóstico de diversas enfermedades. Un estudio de series temporales en el que participaron 272 ciudades importantes de China obtuvo un total de 1.826.186 casos de muertes no accidentales. La relación entre la temperatura y la mortalidad indica consistentemente una curva en forma de J invertida, con la fase de altas tasas de mortalidad debido al frío siendo significativamente más larga que otras temperaturas. Esto sugiere que el impacto de las bajas temperaturas en el ictus y las enfermedades cardiovasculares es ilimitado a la fase fría; Hay una influencia continua durante un período después de que la fase fría ha disminuido.

Entre las muertes no accidentales, el 14,33% se puede atribuir a factores de temperatura ambiental, con el frío moderado (-1,4 a 22,8 °C) y el frío extremo (-6,4 a -1,4 °C) que representaron el 10,49% y el 1,14%, respectivamente. Las causas de muerte incluyen enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares con un 17,48%, enfermedad coronaria con un 18,76%, accidente cerebrovascular isquémico con un 14,09%, accidente cerebrovascular hemorrágico con un 18,10%, enfermedades del sistema respiratorio con un 10,57% y enfermedad pulmonar obstructiva crónica con un 12,57%¹. En China, los estudios epidemiológicos del ictus sugieren un claro gradiente de norte a sur². En el clima gélido del noreste de China, la prevalencia de accidente cerebrovascular es 2,36 veces mayor en comparación con la región sur³. Numerosas investigaciones han confirmado el impacto directo de los ambientes de baja temperatura en las tasas de mortalidad y la incidencia de accidentes cerebrovasculares ^4,5,6. En consecuencia, las diferencias significativas de temperatura climática representan un factor ambiental que no puede ser ignorado.

La falta de un razonamiento científico eficaz que explique la correlación entre los entornos de baja temperatura y el aumento de las tasas de accidentes cerebrovasculares y problemas cardíacos sigue siendo un tema de investigación. Si bien la sabiduría convencional sugiere que las temperaturas frías pueden aumentar la presión arterial a través de la irritación de la piel y la excitación simpática⁷, las personas generalmente toman medidas para aislarse y mantener el equilibrio de la temperatura corporal en respuesta a las condiciones frías. Cuando se exponen a temperaturas frías, los humanos modernos confían en su sistema respiratorio en lugar de la piel como principal mecanismo de defensa. Si bien la ropa gruesa puede proteger la piel del frío externo, no puede evitar inhalar aire frío en el tracto respiratorio, exponiendo la tráquea y los alvéolos a una intensa estimulación por frío. Los métodos actuales para construir modelos animales para la estimulación a baja temperatura se dividen principalmente en dos aspectos. En primer lugar, numerosos estudios se han centrado en explorar la respuesta y los mecanismos reguladores de la piel del ratón a la estimulación a baja temperatura. Un método consiste en colocar ratones en un plato que pueda controlar los cambios de temperatura (4-25 °C) para investigar los mecanismos reguladores específicos de la regulación de la temperatura corporal y el comportamiento de evitación en respuesta a estímulos fríos ^8,9. Otros estudios han colocado dispositivos de enfriamiento en la espalda de ratones para explorar el papel de los circuitos neuronales en^{la regulación de} la temperatura corporal.

Por el contrario, varios estudios han colocado ratones en cámaras pequeñas con temperaturas variables (4-30 °C). La investigación de Lal y sus colegas y Qian et al. utilizó este método para construir un modelo de ratón de estimulación con frío para explorar los circuitos neuronales que regulan el control neuroendocrino del comportamiento de alimentación inducido por el frío^11,12. Sin embargo, los dos métodos mencionados tienen sus limitaciones. En primer lugar, la temperatura más baja es de 4 °C, lo que es insuficiente para simular la estimulación del aire a temperaturas extremadamente bajas. Este método no puede excluir los efectos reguladores de la piel y los circuitos neuronales en el ambiente frío. Como sitio primario de intercambio de aire, los pulmones también son órganos donde se concentran las neuronas sensibles al frío^13,14. El papel regulador de las neuronas sensibles al frío en diversas enfermedades también ha sido confirmado por varios investigadores 15,16,17. Como resultado, se necesita urgentemente un método para construir de manera estable, masiva y normativa un modelo animal de baja temperatura del tracto respiratorio. Comprender el papel regulador de los pulmones y las neuronas sensibles al frío en diversas enfermedades crónicas bajo estimulación de aire a temperatura extremadamente baja es esencial para proporcionar una base teórica para prevenir y tratar el accidente cerebrovascular, la enfermedad coronaria y las enfermedades del sistema respiratorio en regiones frías. Nuestro equipo abordó esta brecha crítica mediante la construcción de un dispositivo de baja temperatura en los últimos dos años. Este dispositivo se caracteriza por su repetibilidad, practicidad, estructura simple y bajo costo, lo que lo hace adecuado para tales estudios.

Protocolo

El Comité de Ética de Animales Experimentales ha aprobado todos los procedimientos que involucran animales en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Harbin.

1. Montaje del dispositivo

NOTA: Consulte la Figura 1 para ver los componentes del dispositivo.

1. Utilice conectores metálicos para asegurar dos juegos de carcasas de latón a dos conjuntos de chips de refrigeración de semiconductores. Aplique grasa de silicona térmicamente conductora entre la carcasa de latón y el chip de enfriamiento del semiconductor.
2. Aplique grasa térmica entre la carcasa de latón y el chip de enfriamiento del semiconductor.
3. Conecte dos grupos de ventiladores en cada pieza de refrigeración de semiconductores a continuación. Asegúrese de que la carcasa de latón, el ventilador, el chip de enfriamiento del semiconductor y la grasa de silicona térmicamente conductora estén conectados de forma segura como una unidad completa.
4. Coloque el dispositivo en su conjunto en el frasco colector de gas y las dos placas de cubierta de las ranuras.
5. Instale las placas por encima y por debajo del frasco colector de gas.
6. Conecte la tubería de entrada de agua y las tuberías de salida de agua a la entrada y salida de agua de la carcasa de latón, respectivamente.
7. Conecte cuatro grupos de carcasas de latón a la parte superior e inferior del frasco de recolección de gas con tuberías.
8. Conecte la bomba de agua a la tubería de entrada de agua.
9. Coloque la tubería de salida de agua en la cisterna.
10. Conecte cuatro juegos de enfriadores de semiconductores y bombas de agua a dos juegos de fuentes de alimentación (12 V y 40 A).

2. Preparación del animal para el experimento

NOTA: Utilizamos un ratón macho C57Bl/6 de 4 semanas de edad para estos experimentos. Se recomienda dejar que el ratón se adapte al fijador durante 3-5 días antes de la preparación del modelo. El entorno experimental debe estar a temperatura ambiente y mantenerse en silencio para evitar ruidos durante todo el experimento.

1. Asegure el mouse en el fijador: Coloque el mouse en el fijador, colocando la parte delantera de la nariz del mouse en la apertura del fijador. Use un tapón de esponja a juego para llenar y asegurar la parte trasera del fijador, asegurándose de que tenga orificios de ventilación. A continuación, coloque el fijador del ratón en la ranura cilíndrica del frasco de recolección de gas (Figura 1D).

3. Flujo de operación experimental

1. Prepare una mezcla de agua helada y colóquela en la cisterna.
   NOTA: Para este paso, asegúrese de que el nivel del agua de la mezcla de hielo y agua sea más alto que el de la bomba para garantizar que la mezcla se agregue a tiempo durante todo el experimento. No se recomienda usar agua a temperatura ambiente
2. Coloque la bomba de agua dentro de la mezcla de agua helada y asegúrese de que la manguera de salida esté sumergida.
3. Coloque la sonda del sensor de temperatura dentro del orificio de medición de temperatura del frasco de recolección de gas.
4. Conecte la bomba de agua a su fuente de alimentación y enciéndala.
5. Conecte la fuente de alimentación al controlador de temperatura, conecte el adaptador de corriente de la unidad de refrigeración a la toma de corriente del controlador de temperatura y establezca el rango de temperatura deseado en el controlador.
6. Configure el rango de temperatura del controlador de temperatura.
7. Después del experimento, retire el mouse y vuelva a colocarlo en su entorno de vivienda.
8. Apague la fuente de alimentación del controlador de temperatura.
9. Apague la bomba de agua.

4. Imágenes térmicas

NOTA: Para demostrar y verificar que los ratones pueden inhalar aire a una temperatura extremadamente baja mientras mantienen la temperatura corporal normal dentro de este aparato, se midió la temperatura en el frasco de recolección de gas utilizando una cámara termográfica (Figura 2).

1. Utilice una cámara termográfica de mano para determinar las temperaturas tanto del orificio de aire como del orificio de medición de temperatura del frasco de recolección de gas desde una distancia óptima.
2. Coloque el punto láser rojo, que indica la ubicación de medición, con precisión en el centro del área de medición de temperatura designada.
3. Empleando la misma metodología, se vuelve a medir la temperatura corporal de los ratones.

Resultados

Podemos observar la construcción general de este dispositivo, que incluye un chip de refrigeración semiconductor, grasa de silicona térmicamente conductora, un frasco de recolección de gas, un controlador de temperatura, un ventilador, un sistema de circulación de enfriamiento por agua, un fijador de mouse y un adaptador de corriente. Una sola unidad puede acomodar simultáneamente las necesidades de modelado de hasta 16 ratones (Figura 1A,B

Discusión

Al construir un modelo de estimulación a baja temperatura, son necesarios varios pasos y precauciones clave para garantizar la precisión del experimento y el bienestar de los animales. Utilice una mezcla de agua helada en lugar de agua a temperatura ambiente para mantener un estado de baja temperatura del agua de refrigeración durante todo el experimento, lo que ayuda a simular entornos de temperatura extremadamente baja. Asegúrese de que el sistema de recirculación de agua de enfri...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
brass shell	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company
cistern	Shenzhen Gongdecheng plastic industry
fan	ChaoJingYin electoronic.,LTD	4010	12 V
Gas collection jar	Shenzhen Gongdecheng plastic industry
intake/outlet pipe	Shanghai Shenchen rubber and plastic products factory
mouse fixator	Lanjieke technology
power	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company		12 V 40 A
Semiconductor cooling chip	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company	TEC2-19006	Double layer refrigeration
Sponge plug	Shenzhen Gongdecheng plastic industry
Stainless steel fastener	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company
thermally conductive silicone grease	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company	DRG102
water pump	Shenzhen Jutai pump Co.,LTD	DC005	12 V
Water pump power adapter	Chaoke power adapter factory	1210	100-240 V 50-60 HZ 12 V