Estabelecendo um modelo de camundongo para inalação de ar em temperatura extrema de baixa temperatura do trato respiratório

Resumo

A estimulação ambiental fria tem sido implicada no desenvolvimento de várias doenças crônicas. Portanto, o estabelecimento de modelos animais para pesquisa pré-clínica é crucial. Este sistema atende a essa necessidade oferecendo um dispositivo que cria um modelo de estímulo, atendendo aos requisitos para pesquisa básica sobre mecanismos patogênicos.

Resumo

Atualmente, a construção de um modelo de camundongo para estimulação ambiental fria emprega placas de calor frio e dispositivos de resfriamento vestíveis. Esses métodos podem atender parcialmente aos requisitos para estudar as respostas e efeitos regulatórios da pele de camundongos ou circuitos neurais à estimulação fria. Numerosos estudos clínicos comprovaram a correlação entre a exposição a ambientes de baixa temperatura e o desenvolvimento de várias doenças. Recentemente, tem havido uma ênfase crescente na troca contínua de informações entre órgãos e tecidos, fornecendo uma nova perspectiva sobre como abordar questões de longa data dentro do corpo humano. No entanto, as instalações existentes não conseguem construir um modelo para camundongos que inalam ar frio.

Embora colocar ratos em um ambiente frio pareça atraente, ele tem limitações consideráveis. Enquanto os camundongos inalam ar frio, sua pele também está sendo estimulada pelo ambiente frio, tornando incerto se as alterações patológicas resultantes são devidas à estimulação pulmonar através da interação de órgãos distantes ou devido aos receptores da pele e à transmissão de sinais neurais. Isso cria uma confusão considerável na pesquisa relacionada. Este esquema apresenta uma nova abordagem para a construção de um modelo de camundongo para estimulação extrema por inalação de ar frio. Este dispositivo permite que os ratos inalem gases de temperatura extremamente baixa enquanto seus corpos permanecem em uma temperatura normal. Ele maximiza a simulação dos efeitos estimulantes de temperaturas ambientes extremas em camundongos e atende às necessidades de pesquisa para estudar a relação entre temperaturas ambientais extremas e doenças relacionadas.

Introdução

Este método fornece principalmente um modelo de estimulação de ar de temperatura extremamente baixa em camundongos usando um dispositivo de feedback de temperatura de refrigeração de semicondutor não invasivo, padronizado, estável e em lote. Experimentos clínicos relacionados a baixas temperaturas confirmaram uma estreita relação com a incidência e o prognóstico de várias doenças. Um estudo de séries temporais envolvendo 272 grandes cidades da China obteve um total de 1.826.186 casos de mortes não acidentais. A relação entre temperatura e mortalidade indica consistentemente uma curva em forma de J invertido, com a fase de altas taxas de mortalidade devido ao frio sendo significativamente mais longa do que outras temperaturas. Isso sugere que o impacto das baixas temperaturas no AVC e nas doenças cardiovasculares é ilimitado à fase fria; há uma influência contínua durante um período após o desaparecimento da fase fria.

Entre as mortes não acidentais, 14,33% podem ser atribuídas a fatores de temperatura ambiental, sendo que o frio moderado (-1,4 a 22,8 °C) e o frio extremo (-6,4 a -1,4 °C) representaram 10,49% e 1,14%, respectivamente. As causas de morte incluem doenças cardiovasculares e cerebrovasculares em 17,48%, doença coronariana em 18,76%, acidente vascular cerebral isquêmico em 14,09%, acidente vascular cerebral hemorrágico em 18,10%, doenças do sistema respiratório em 10,57% e doença pulmonar obstrutiva crônica em 12,57%¹. Na China, estudos epidemiológicos de AVC sugerem um claro gradiente de norte a sul². No clima gelado do nordeste da China, a prevalência de acidente vascular cerebral é 2,36 vezes maior em comparação com a região sul³. Pesquisas substanciais confirmaram o impacto direto de ambientes de baixa temperatura nas taxas de mortalidade e na incidência de AVC ^4,5,6. Consequentemente, as diferenças significativas de temperatura climática representam um fator ambiental que não pode ser ignorado.

A falta de raciocínio científico eficaz que explique a correlação entre ambientes de baixa temperatura e aumento das taxas de derrame e problemas cardíacos continua sendo um tópico de investigação. Embora a sabedoria convencional sugira que as temperaturas frias podem aumentar a pressão arterial por meio de irritação da pele e excitação simpática⁷, os indivíduos normalmente tomam medidas para se isolar e manter o equilíbrio da temperatura corporal em resposta às condições frias. Quando expostos a temperaturas frias, os humanos modernos confiam em seu sistema respiratório em vez da pele como o principal mecanismo de defesa. Embora roupas grossas possam proteger a pele do frio externo, elas não podem impedir a inalação de ar frio no trato respiratório, expondo a traqueia e os alvéolos a intensa estimulação do frio. Os métodos atuais para a construção de modelos animais para estimulação de baixa temperatura são divididos principalmente em dois aspectos. Primeiro, vários estudos se concentraram em explorar a resposta e os mecanismos regulatórios da pele do camundongo à estimulação de baixa temperatura. Um método envolve colocar camundongos em uma placa que pode controlar as mudanças de temperatura (4-25 ° C) para investigar os mecanismos regulatórios específicos da regulação da temperatura corporal e do comportamento de evitação em resposta a estímulos frios ^8,9. Outros estudos colocaram dispositivos de resfriamento nas costas de camundongos para explorar o papel dos circuitos neurais^{na regulação da} temperatura corporal.

Por outro lado, vários estudos colocaram camundongos em pequenas câmaras com temperaturas variáveis (4-30 °C). A pesquisa de Lal e colegas e Qian et al. usou esse método para construir um modelo de camundongo de estimulação fria para explorar os circuitos neurais que regulam o controle neuroendócrino do comportamento alimentar induzido pelo frio^11,12. No entanto, os dois métodos mencionados têm suas limitações. Primeiro, a temperatura mais baixa é de 4 °C, o que é insuficiente para simular a estimulação do ar em temperatura extremamente baixa. Este método não pode excluir os efeitos reguladores da pele e dos circuitos neurais no ambiente frio. Como local primário de troca de ar, os pulmões também são órgãos onde os neurônios sensíveis ao frio estão concentrados^13,14. O papel regulador dos neurônios sensíveis ao frio em várias doenças também foi confirmado por vários pesquisadores 15,16,17. Como resultado, é urgentemente necessário um método para construir de forma estável, massiva e normativa um modelo animal de baixa temperatura do trato respiratório. Compreender o papel regulador dos pulmões e neurônios sensíveis ao frio em várias doenças crônicas sob estimulação de ar de temperatura extremamente baixa é essencial para fornecer uma base teórica para prevenir e tratar acidente vascular cerebral, doença cardíaca coronária e doenças do sistema respiratório em regiões frias. Nossa equipe abordou essa lacuna crítica construindo um dispositivo de baixa temperatura nos últimos dois anos. Este dispositivo é caracterizado pela repetibilidade, praticidade, estrutura simples e baixo custo, tornando-o adequado para tais estudos.

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Protocolo

O Comitê de Ética em Animais Experimentais aprovou todos os procedimentos envolvendo animais no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Harbin.

1. Montagem do dispositivo

NOTA: Consulte a Figura 1 para obter os componentes do dispositivo.

1. Use conectores de metal para prender dois conjuntos de invólucros de latão a dois conjuntos de chips de resfriamento de semicondutores. Aplique graxa de silicone termicamente condutora entre o invólucro de latão e o chip de resfriamento do semicondutor.
2. Aplique graxa térmica entre o invólucro de latão e o chip de resfriamento do semicondutor.
3. Conecte dois grupos de ventiladores em cada peça de refrigeração de semicondutores abaixo. Certifique-se de que o invólucro de latão, o ventilador, o chip de resfriamento do semicondutor e a graxa de silicone termicamente condutora estejam conectados com segurança como uma unidade completa.
4. Coloque o dispositivo como um todo no frasco coletor de gás e duas placas de cobertura das ranhuras.
5. Instale as placas acima e abaixo do frasco coletor de gás.
6. Conecte o tubo de entrada de água e os tubos de saída de água à entrada e saída de água do invólucro de latão, respectivamente.
7. Conecte quatro grupos de conchas de latão à parte superior e inferior do frasco de coleta de gás com tubos.
8. Conecte a bomba de água ao tubo de entrada de água.
9. Coloque o tubo de saída de água na cisterna.
10. Conecte quatro conjuntos de resfriadores semicondutores e bombas de água a dois conjuntos de fontes de alimentação (12 V e 40 A).

2. Preparação do animal para a experiência

NOTA: Usamos um camundongo macho C57Bl / 6 com 4 semanas de idade para esses experimentos. Recomenda-se que o mouse se adapte ao fixador por 3-5 dias antes da preparação do modelo. O ambiente experimental deve estar à temperatura ambiente e mantido em silêncio para evitar ruídos durante todo o experimento.

1. Prenda o mouse no fixador: Coloque o mouse no fixador, posicionando a parte frontal do nariz do mouse na abertura do fixador. Use um tampão de esponja correspondente para preencher e prender a parte traseira do fixador, garantindo que ele tenha orifícios de ventilação. Em seguida, coloque o fixador do mouse na ranhura cilíndrica do frasco de coleta de gás (Figura 1D).

3. Fluxo de operação experimental

1. Prepare uma mistura de água gelada e coloque-a na cisterna.
   NOTA: Para esta etapa, certifique-se de que o nível de água da mistura de água gelada seja maior do que a bomba para garantir que a mistura seja adicionada a tempo durante todo o experimento. O uso de água em temperatura ambiente não é recomendado
2. Posicione a bomba de água dentro da mistura de água gelada e certifique-se de que a mangueira de saída esteja submersa.
3. Coloque a sonda do sensor de temperatura dentro do orifício de medição de temperatura do frasco de coleta de gás.
4. Conecte a bomba de água à fonte de alimentação e ligue-a.
5. Conecte a fonte de alimentação ao controlador de temperatura, conecte o adaptador de energia da unidade de refrigeração na tomada do controlador de temperatura e defina a faixa de temperatura desejada no controlador.
6. Defina a faixa de temperatura do controlador de temperatura.
7. Após o experimento, remova o mouse e coloque-o de volta em seu ambiente de alojamento.
8. Desligue a fonte de alimentação do controlador de temperatura.
9. Desligue a bomba d'água.

4. Imagens térmicas

NOTA: Para demonstrar e verificar se os camundongos podem inalar ar de temperatura extremamente baixa enquanto mantêm a temperatura corporal normal dentro deste aparelho, a temperatura no frasco de coleta de gás foi medida usando uma câmera termográfica (Figura 2).

1. Use uma câmera termográfica portátil para determinar as temperaturas do orifício de ar e do orifício de medição de temperatura do frasco de coleta de gás a uma distância ideal.
2. Posicione o ponto laser vermelho, indicando o local de medição, precisamente no centro da área de medição de temperatura designada.
3. Empregando a mesma metodologia, meça novamente a temperatura corporal dos camundongos.

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Resultados

Podemos observar a construção geral deste dispositivo, que inclui um chip de refrigeração semicondutor, graxa de silicone termicamente condutora, um frasco de coleta de gás, um controlador de temperatura, um ventilador, um sistema de circulação de resfriamento de água, um fixador de mouse e um adaptador de energia. Uma única unidade pode acomodar simultaneamente as necessidades de modelagem de até 16 camundongos (Figura 1A, B). O f...

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Discussão

Na construção de um modelo de estimulação de baixa temperatura, várias etapas e precauções importantes são necessárias para garantir a precisão do experimento e o bem-estar dos animais. Use uma mistura de água gelada em vez de água em temperatura ambiente para manter um estado de baixa temperatura da água de resfriamento durante todo o experimento, o que ajuda a simular ambientes de temperatura extremamente baixa. Certifique-se de que o sistema de recirculação de água de ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
brass shell	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company
cistern	Shenzhen Gongdecheng plastic industry
fan	ChaoJingYin electoronic.,LTD	4010	12 V
Gas collection jar	Shenzhen Gongdecheng plastic industry
intake/outlet pipe	Shanghai Shenchen rubber and plastic products factory
mouse fixator	Lanjieke technology
power	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company		12 V 40 A
Semiconductor cooling chip	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company	TEC2-19006	Double layer refrigeration
Sponge plug	Shenzhen Gongdecheng plastic industry
Stainless steel fastener	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company
thermally conductive silicone grease	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company	DRG102
water pump	Shenzhen Jutai pump Co.,LTD	DC005	12 V
Water pump power adapter	Chaoke power adapter factory	1210	100-240 V 50-60 HZ 12 V