Etablierung eines Mausmodells für die Inhalation von Atemwegen mit extrem niedriger Temperatur

Zusammenfassung

Die Stimulation der kalten Umgebung wurde mit der Entwicklung verschiedener chronischer Krankheiten in Verbindung gebracht. Daher ist die Etablierung von Tiermodellen für die präklinische Forschung von entscheidender Bedeutung. Dieses System adressiert diesen Bedarf, indem es ein Gerät anbietet, das ein Stimulusmodell erstellt, das die Anforderungen der Grundlagenforschung zu pathogenen Mechanismen erfüllt.

Zusammenfassung

Derzeit werden bei der Konstruktion eines Mausmodells für die Stimulation kalter Umgebungen kalte Wärmeplatten und tragbare Kühlgeräte verwendet. Diese Methoden können teilweise die Anforderungen erfüllen, um die Reaktionen und regulatorischen Effekte der Haut von Mäusen oder neuronaler Schaltkreise auf Kältestimulation zu untersuchen. Zahlreiche klinische Studien haben den Zusammenhang zwischen der Exposition gegenüber niedrigen Temperaturen und der Entstehung verschiedener Krankheiten belegt. In jüngster Zeit wird der kontinuierliche Informationsaustausch zwischen Organen und Geweben zunehmend in den Vordergrund gerückt, was eine neue Perspektive auf die Lösung langjähriger Probleme im menschlichen Körper bietet. Bestehende Anlagen sind jedoch nicht in der Lage, ein Modell für Mäuse zu bauen, die kalte Luft einatmen.

Obwohl es attraktiv erscheint, Mäuse in einer kalten Umgebung zu platzieren, hat es erhebliche Einschränkungen. Während Mäuse kalte Luft einatmen, wird ihre Haut auch durch die kalte Umgebung stimuliert, so dass unklar ist, ob die daraus resultierenden pathologischen Veränderungen auf die Lungenstimulation durch das Zusammenspiel entfernter Organe oder auf die Hautrezeptoren und die neuronale Signalübertragung zurückzuführen sind. Dies führt zu erheblicher Verwirrung in der verwandten Forschung. Dieses Schema stellt einen neuen Ansatz für die Konstruktion eines Mausmodells für die Stimulation durch Inhalation extremer kalter Luft dar. Dieses Gerät ermöglicht es Mäusen, Gase mit extrem niedrigen Temperaturen einzuatmen, während ihr Körper auf einer normalen Temperatur bleibt. Es maximiert die Simulation der stimulierenden Wirkung extremer Umgebungstemperaturen auf Mäuse und erfüllt die Forschungsanforderungen zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen extremen Umgebungstemperaturen und verwandten Krankheiten.

Einleitung

Dieses Verfahren bietet in erster Linie ein extrem niedriges Luftstimulationsmodell bei Mäusen unter Verwendung eines nicht-invasiven, standardisierten, stabilen und chargenweisen Halbleiter-Kältetemperatur-Feedback-Geräts. Klinische Experimente im Zusammenhang mit niedrigen Temperaturen haben einen engen Zusammenhang mit dem Auftreten und der Prognose verschiedener Krankheiten bestätigt. Eine Zeitreihenstudie, an der 272 Großstädte in China beteiligt waren, ergab insgesamt 1.826.186 Fälle von Nicht-Unfalltodesfällen. Die Beziehung zwischen Temperatur und Mortalität zeigt durchweg eine invertierte J-förmige Kurve, wobei die Phase mit hohen Sterblichkeitsraten aufgrund von Kälte deutlich länger ist als andere Temperaturen. Dies deutet darauf hin, dass der Einfluss niedriger Temperaturen auf Schlaganfälle und Herz-Kreislauf-Erkrankungen auf die Erkältungsphase beschränkt ist; Es gibt einen anhaltenden Einfluss während einer Periode, nachdem die Kältephase abgeklungen ist.

Von den Todesfällen, die keine Unfälle sind, sind 14,33 % auf Umwelttemperaturfaktoren zurückzuführen, wobei mäßige Kälte (-1,4 bis 22,8 °C) und extreme Kälte (-6,4 bis -1,4 °C) 10,49 % bzw. 1,14 % ausmachten. Zu den Todesursachen gehören Herz-Kreislauf- und zerebrovaskuläre Erkrankungen mit 17,48 %, koronare Herzkrankheiten mit 18,76 %, ischämischer Schlaganfall mit 14,09 %, hämorrhagischer Schlaganfall mit 18,10 %, Erkrankungen des Atemwegs mit 10,57 % und chronisch obstruktive Lungenerkrankungen mit 12,57 %¹. In China deuten epidemiologische Studien zum Schlaganfall auf ein deutliches Gefälle von Nord nach Süd^{hin 2}. Im kalten Klima des Nordostens Chinas ist die Prävalenz von Schlaganfällen 2,36-mal höher als in der südlichen Region³. Umfangreiche Forschungsarbeiten haben den direkten Einfluss von Umgebungen mit niedrigen Temperaturen auf die Sterblichkeitsraten und die Inzidenz von Schlaganfällen bestätigt ^4,5,6. Folglich stellen die erheblichen Klimatemperaturunterschiede einen Umweltfaktor dar, der nicht ignoriert werden kann.

Der Mangel an effektiven wissenschaftlichen Argumenten, die den Zusammenhang zwischen Umgebungen mit niedrigen Temperaturen und erhöhten Raten von Schlaganfällen und Herzproblemen erklären, ist nach wie vor Gegenstand von Untersuchungen. Während die gängige Meinung besagt, dass kalte Temperaturen den Blutdruck durch Hautreizungen und sympathische Erregung erhöhen können⁷, ergreifen Personen in der Regel Maßnahmen, um sich zu isolieren und das Gleichgewicht der Körpertemperatur als Reaktion auf kalte Bedingungen aufrechtzuerhalten. Wenn der moderne Mensch kalten Temperaturen ausgesetzt ist, verlässt er sich auf sein Atmungssystem und nicht auf die Haut als primären Abwehrmechanismus. Dicke Kleidung kann die Haut zwar vor äußerer Kälte schützen, aber sie kann nicht verhindern, dass kalte Luft in die Atemwege eingeatmet wird, wodurch Luftröhre und Lungenbläschen einer intensiven Kältestimulation ausgesetzt werden. Derzeitige Methoden zur Konstruktion von Tiermodellen für die Tieftemperaturstimulation gliedern sich im Wesentlichen in zwei Aspekte. Zunächst konzentrierten sich zahlreiche Studien auf die Erforschung der Reaktions- und Regulationsmechanismen der Haut von Mäusen auf die Stimulation bei niedrigen Temperaturen. Eine Methode besteht darin, Mäuse auf eine Platte zu legen, die Temperaturänderungen (4-25°C) kontrollieren kann, um die spezifischen Regulationsmechanismen der Körpertemperaturregulation und des Vermeidungsverhaltens als Reaktion auf Kältereize zu untersuchen ^8,9. Andere Studien haben Kühlgeräte auf dem Rücken von Mäusen platziert, um die Rolle neuronaler Schaltkreise bei der Regulierung der Körpertemperatur zu untersuchen¹⁰.

Umgekehrt wurden Mäuse in mehreren Studien in kleine Kammern mit variablen Temperaturen (4-30 °C) gebracht. Die Forschung von Lal und Kollegen sowie Qian et al. nutzten diese Methode, um ein Mausmodell der Kältestimulation zu konstruieren, um die neuronalen Schaltkreise zu erforschen, die die neuroendokrine Kontrolle des kälteinduzierten Fressverhaltens regulieren^11,12. Die beiden genannten Methoden haben jedoch ihre Grenzen. Erstens beträgt die niedrigste Temperatur 4 °C, was nicht ausreicht, um eine extrem niedrige Luftstimulation zu simulieren. Diese Methode kann die regulierende Wirkung der Haut und der neuronalen Schaltkreise auf die kalte Umgebung nicht ausschließen. Als primärer Ort des Luftaustauschs ist die Lunge auch Organe, in denen kälteempfindliche Neuronen konzentriert sind^13,14. Die regulatorische Rolle kälteempfindlicher Neuronen bei verschiedenen Krankheiten wurde auch von mehreren Forschern bestätigt 15,16,17. Daher wird dringend eine Methode benötigt, um ein Niedertemperatur-Tiermodell für Atemwege stabil, massiv und normativ zu konstruieren. Das Verständnis der regulatorischen Rolle der Lunge und kälteempfindlicher Neuronen bei verschiedenen chronischen Erkrankungen unter extremer Luftstimulation bei niedrigen Temperaturen ist unerlässlich, um eine theoretische Grundlage für die Prävention und Behandlung von Schlaganfällen, koronaren Herzkrankheiten und Erkrankungen des Atmungssystems in kalten Regionen zu schaffen. Unser Team hat diese kritische Lücke geschlossen, indem es in den letzten zwei Jahren ein Niedertemperaturgerät gebaut hat. Dieses Gerät zeichnet sich durch Wiederholbarkeit, Praktikabilität, einfache Struktur und niedrige Kosten aus und eignet sich daher für solche Studien.

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Protokoll

Die Ethikkommission für Versuchstiere hat alle Verfahren mit tierischen Probanden am First Affiliated Hospital der Harbin Medical University genehmigt.

1. Montage des Gerätes

HINWEIS: In Abbildung 1 finden Sie die Gerätekomponenten.

1. Verwenden Sie Metallverbinder, um zwei Sätze Messinggehäuse an zwei Sätzen Halbleiterkühlchips zu befestigen. Tragen Sie wärmeleitendes Silikonfett zwischen dem Messinggehäuse und dem Halbleiterkühlchip auf.
2. Tragen Sie Wärmeleitpaste zwischen dem Messinggehäuse und dem Halbleiterkühlchip auf.
3. Schließen Sie zwei Gruppen von Lüftern in jedem Stück Halbleiterkühlung unten an. Stellen Sie sicher, dass das Messinggehäuse, der Lüfter, der Halbleiterkühlchip und das wärmeleitende Silikonfett als komplette Einheit sicher verbunden sind.
4. Legen Sie das Gerät als Ganzes in den Gasauffangbehälter und die beiden Abdeckplatten der Schlitze.
5. Montieren Sie die Platten über und unter dem Gasauffangbehälter.
6. Verbinden Sie das Wasserzulaufrohr und die Wasserauslassrohre mit dem Wassereinlass bzw. -auslass der Messingschale.
7. Verbinden Sie vier Gruppen von Messingschalen mit Rohren an der Ober- und Unterseite des Gasauffangbehälters.
8. Schließen Sie die Wasserpumpe an das Wasserzulaufrohr an.
9. Legen Sie das Wasserablaufrohr in den Spülkasten.
10. Schließen Sie vier Sätze Halbleiterkühler und Wasserpumpen an zwei Sätze Netzteile (12 V und 40 A) an.

2. Vorbereitung des Tieres auf den Versuch

HINWEIS: Für diese Experimente haben wir eine männliche C57Bl/6-Maus im Alter von 4 Wochen verwendet. Es wird empfohlen, die Maus vor der Modellvorbereitung 3-5 Tage lang an den Fixateur anpassen zu lassen. Die Versuchsumgebung sollte Raumtemperatur haben und ruhig gehalten werden, um Lärm während des gesamten Experiments zu vermeiden.

1. Befestigen Sie die Maus im Fixateur: Setzen Sie die Maus in den Fixateur ein und positionieren Sie den vorderen Teil der Mausnase an der Öffnung des Fixateurs. Verwenden Sie einen passenden Schwammstopfen, um den hinteren Teil des Fixateurs zu füllen und zu sichern, und stellen Sie sicher, dass er Belüftungslöcher hat. Setzen Sie anschließend den Mausfixator in den zylindrischen Schlitz des Gasauffangbehälters ein (Abbildung 1D).

3. Ablauf des experimentellen Betriebs

1. Bereiten Sie eine Eis-Wasser-Mischung vor und geben Sie sie in die Zisterne.
   HINWEIS: Stellen Sie bei diesem Schritt sicher, dass der Wasserstand des Eis-Wasser-Gemisches höher ist als der der Pumpe, um sicherzustellen, dass das Gemisch während des gesamten Experiments rechtzeitig hinzugefügt wird. Die Verwendung von Wasser bei Raumtemperatur wird nicht empfohlen
2. Positionieren Sie die Wasserpumpe im Eis-Wasser-Gemisch und stellen Sie sicher, dass der Auslassschlauch eingetaucht ist.
3. Platzieren Sie die Temperaturfühlersonde in der Temperaturmessöffnung des Gasauffangbehälters.
4. Schließen Sie die Wasserpumpe an die Stromquelle an und schalten Sie sie ein.
5. Schließen Sie das Netzteil an den Temperaturregler an, stecken Sie das Netzteil des Kühlaggregats in die Steckdose des Temperaturreglers und stellen Sie den gewünschten Temperaturbereich am Regler ein.
6. Stellen Sie den Temperaturbereich des Temperaturreglers ein.
7. Entfernen Sie nach dem Experiment die Maus und setzen Sie sie wieder in ihre Gehäuseumgebung ein.
8. Schalten Sie die Stromversorgung des Temperaturreglers aus.
9. Schalten Sie die Wasserpumpe aus.

4. Wärmebildtechnik

HINWEIS: Um zu demonstrieren und zu überprüfen, dass die Mäuse extrem niedrige Temperaturen einatmen können, während sie in diesem Gerät die normale Körpertemperatur aufrechterhalten, wurde die Temperatur im Gassammelgefäß mit einer Wärmebildkamera gemessen (Abbildung 2).

1. Verwenden Sie eine tragbare Wärmebildkamera, um die Temperaturen sowohl des Luftlochs als auch des Temperaturmesslochs des Gasauffangbehälters aus optimaler Entfernung zu ermitteln.
2. Positionieren Sie den roten Laserpunkt, der den Messort anzeigt, genau in der Mitte des vorgesehenen Temperaturmessbereichs.
3. Messen Sie mit der gleichen Methode die Körpertemperatur der Mäuse erneut.

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Ergebnisse

Wir können die Gesamtkonstruktion dieses Geräts beobachten, die einen Halbleiter-Kühlchip, wärmeleitendes Silikonfett, ein Gasauffanggefäß, einen Temperaturregler, einen Lüfter, ein Wasserkühlungs-Zirkulationssystem, einen Mausfixateur und ein Netzteil umfasst. Eine einzige Einheit kann gleichzeitig die Modellierungsanforderungen von bis zu 16 Mäusen erfüllen (Abbildung 1A, B). Das Gasauffanggefäß, das Zirkulationssystem für die...

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Diskussion

Bei der Erstellung eines Niedertemperatur-Stimulationsmodells sind mehrere wichtige Schritte und Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, um die Genauigkeit des Versuchs und das Wohlergehen der Tiere zu gewährleisten. Verwenden Sie ein Eis-Wasser-Gemisch anstelle von Wasser mit Raumtemperatur, um während des gesamten Experiments einen niedrigen Temperaturzustand des Kühlwassers aufrechtzuerhalten, was zur Simulation von Umgebungen mit extrem niedrigen Temperaturen beiträgt. Stellen Sie sich...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
brass shell	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company
cistern	Shenzhen Gongdecheng plastic industry
fan	ChaoJingYin electoronic.,LTD	4010	12 V
Gas collection jar	Shenzhen Gongdecheng plastic industry
intake/outlet pipe	Shanghai Shenchen rubber and plastic products factory
mouse fixator	Lanjieke technology
power	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company		12 V 40 A
Semiconductor cooling chip	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company	TEC2-19006	Double layer refrigeration
Sponge plug	Shenzhen Gongdecheng plastic industry
Stainless steel fastener	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company
thermally conductive silicone grease	Shenzhen Haida high-tech electronic equipment company	DRG102
water pump	Shenzhen Jutai pump Co.,LTD	DC005	12 V
Water pump power adapter	Chaoke power adapter factory	1210	100-240 V 50-60 HZ 12 V